应用基因芯片技术检测乙型肝炎病毒前-C区/BCP区基因突变的研究

目的　探讨利用基因芯片技术检测乙型肝炎病毒 (HBV)前 C区 /BCP区基因突变方法的临床价值及前 C区 /BCP区基因突变的临床意义。方法　应用基因芯片技术检测 4 6例急慢性肝病的HBV前 C区A1896 (nt1896G→A)、A1899(nt1899G→A)及HBVC基因启动子 (BCP)T176 2A176 4 (nt176 2A→T、nt176 4G→A)四位点突变 ,并探讨该技术的临床应用价值。结果　用基因芯片法测定HBV基因特定变异位点特异性强 ,阳性率为 87 0 %。A1896突变 18例 (4 5 0 % ) ,A1899突变 10例 (2 5 0 % ) ,T176 2A176 4联合突变 30例(75 0 % ) ,多位点突变 14例(35 0 % )。各变异组与未变异组比较 ,肝功损害均有显著性差异 (P <0 0 5～ 0 0 1)。前 C区 /BCP区基因突变在乙型肝炎肝硬化及慢性乙型肝炎中较为常见 ,在急性乙型肝炎中未检出。结论　应用基因芯片法测定HBV特定变异位点特异性强 ,可一次同时检测多个突变位点 ,具有一定的临床应用价值。     

乙型肝炎病毒S基因插入和点突变株感染及其血清学特征

为探讨乙型肝炎病毒感染血清学不典型表现的分子病毒学基础,用聚合酶链反应产物直接序列分析测定中国人感染的ＨＢＶ Ｓ基因核苷酸序列。结果发现：１５例ＨＢｓＡｇ阴性ＨＢＶ感染者中,１例第５５２位碱基胸腺嘧啶被胞嘧啶,导致ＨＢｓＡｇ第１３３位蛋氨酸被氨酸替代;３例第５４６位碱基Ｃ被Ｔ替换,导致ＨＢｓＡｇ第１３１位苏氨酸被异亮氨酸替代。     

乙型肝炎患者血清HBV前C区A1896变异的检测分析

目的了解HBsAg(+)/HBcAb(+)/HBeAb(+)的慢性乙肝病人血清乙肝病毒(HBV)DNA前C区A1896的变异情况及其与临床关系。方法对所有试验对象检测肝功能指标,根据检测结果分为丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高组和ALT正常组。用聚合酶链反应杂交(PCR-ELISA)定量检测HBV-DNA并进一步检测HBV前C区A1896位点的变异情况。结果 38例患者中有18例HBV-DNA阳性,其中15例发生A1896位点变异,变异率为83.3%(15/18)。ALT升高组的18例中,血清HBV-DNA阳性13例,阳性率72.2%,平均浓度为9.62×106(1.10×103～1.09×108)拷贝/ml,A1896变异13例,变异率为100%(13/13)。ALT正常组的20例中,HBV-DNA阳性5例,阳性率25.00%,平均浓度2.55×104(3.28×103～4.61×104)拷贝/ml。A1896变异2例,变异率为40%(2/5)。两组比较无论在HBV-DNA阳性率,还是A1896位变异率都具有统计学差异(P<0.05)。结论 HBsAg(+)/HBcAb(+)/HBeAb(+)的慢性乙肝患者存在较高的A1896变异率,ALT升高组HBV-DNA阳性率和变异率均高于ALT正常组(P<0.05),提示HBV A1896位点变异与肝脏病变活动加重和ALT升高有关。     

中药及其有效成分抗乙型肝炎病毒的研究进展

综述近年来有关中药及其天然化合物抗乙型肝炎病毒的基础研究和临床应用 ,为开发研制天然抗乙肝药物和临床药物的应用提供依据。     

滚环扩增在乙型肝炎病毒cccDNA检测中的应用

目的 建立慢性乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的滚环扩增(RCA)方法 .方法 以27例慢性乙型肝炎患者的肝组织cccDNA和血清松弛环状DNA(rcDNA)为研究对象.根据中国患者HBV基因序列特点设计4对引物,分别可与HBV cccDNA的正、负链结合.在Phi29 DNA聚合酶的作用下,获得线性多拷贝cccDNA扩增产物,以该产物为模板获得cccDNA全序列;通过对模板的系列稀释鉴定RCA方法 的灵敏度;以RCA产物为模板扩增肝组织cccDNA的反转录酶区基因,并与同时扩增的同时间采集的同一患者血清中的rcDNA序列进行比较.结果 成功建立了HBV cccDNA全序列的RCA方法 ,最低可检测到10个拷贝的cccDNA分子,并获得了所有扩增cccDNA的全基因序列.27例患者中,18例患者的肝组织CCCDNA和血清rcDNA反转录酶区的序列完全一致,9例患者中共检出 84个不同的核苷酸位点,平均每个患者9.3个,84个不同核苷酸中只有5个引起了氨基酸的改变.结论 滚环扩增方法 对肝组织HBV cccDNA的检测具有较好的灵敏度.该方法 的建立对深入了解cccDNA在HBV致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效有重要意义.     

乙型肝炎病毒的泛嗜性及其意义

原来认为乙型肝炎病毒（HBV）为专一的嗜肝病毒。近年来，由于核酸分子杂交技术的发展，在肝外器官细胞内不断检出HBVDNA，表明HBV是一种泛嗜性病毒，不仅侵犯肝脏，而且可在肝外器官和组织中存在。我们就近年HBV的泛嗜性，及其与病毒性肝炎的肝外病理改变等研究进展，综述如下。1HBV的肝外复制近年来的一些研究提示，HBV可在肝细胞以外的组织中进行复制。1990年Yoffe等[1]应用Slotblotting和Southern杂交技术在2例暴发性肝炎患者的淋巴结、肾、胰、脾及其它组织中发现有HBVDNA复制的中间体。但有人对上拨鼠肝炎病毒（WHBV）…     

乙型肝炎、丁型肝炎病毒联合诊断芯片制备的初步研究

目的制备联合检测乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)基因芯片并进行杂交验证。方法利用Primer Premier 5．0分别针对HBV、HDV基因保守区域设计多对PCR引物,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体,提取阳性克隆质粒进行测序分析鉴定。用PixSys5500芯片打印仪将PCR产物打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片。样品荧光标记采用限制性显示(RD)技术,标记后进行杂交验证分析。结果序列分析表明,运用PCR技术得到的多个基因片段均属于HBV、HDV特异基因。杂交结果显示,敏感性、特异性、重复性等指标均佳。结论利用PCR扩增产物作为探针制备HBV、HDV联合诊断芯片是一种快速、简便的实用方法,有着广阔的应用前景;利用RD技术标记样品可提高多种肝炎病毒混合检测的敏感性。     

女性乙型肝炎病毒携带者卵巢颗粒细胞中乙型肝炎病毒感染情况与临床检测结果分析

目的分析女性乙型肝炎病毒(HBV)携带者卵巢颗粒细胞中HBV感染情况与临床检测结果。方法选取自2014年1月至2016年1月于自贡市第三人民医院接受辅助生育治疗的40例女性患者作为研究对象,其中,20例患者为HBV携带者(携带组),20例患者为非HBV携带者(非携带组),分离患者卵泡液中的颗粒细胞并制成涂片。应用经地高辛标记的特异性HBV DNA探针,通过原位杂交对颗粒细泡涂片进行检测;应用碱性磷酸酶系统进行显色反应。结果携带组患者的颗粒细胞涂片显示,5例可见200个成簇的颗粒细胞,细胞核中检测出20个HBV DNA阳性细胞;6例患者可见220个片状、单层的颗粒细胞,细胞核中检测出8个HBV DNA阳性细胞;9例患者可见180个成簇的颗粒细胞,细胞核中检测出4个HBV DNA阳性细胞。非携带组患者的颗粒细胞涂片为阴性。显色10 min时,患者未出现阳性信号;显色20 min时,4例患者出现阳性信号;显色30 min时,3例患者背景着色较深,阳性信号不易辨认,忽略不计。因此,20 min为显色的最佳时间。结论女性HBV携带者卵巢颗粒细胞中具有HBV DNA,可通过生殖细胞向子代传播乙型肝炎。因此,应加强对HBV携带孕产妇的健康宣传教育,并采取有效措施进行阻断。     

乙型肝炎病毒感染的分子生物学检测方法及其应用

乙型肝炎病毒感染的分子生物学检测方法及其应用陈晓旭①郭哲②张丹阳①关键词乙型肝炎病毒分子生物技术中图法分类号Ｒ５７５．１乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ是乙型肝炎病毒的遗传基因。应用分子生物技术检测体内ＨＢＶＤＮＡ较常用的免疫学方法更为直接、敏感、可靠［...     

家庭骨乙型肝炎病毒变异株感染的分子病毒学调查

为分析乙型肝炎病毒家庭内聚集感染病例的ＨＢＶ变异特点，我们对１０个家庭２５例ＨＢＶ感染者了分子病毒学研究，均用单链构型多态性分析ＨＢＶ外膜基因“ａ”决定簇片段的变异，ＰＣＲ－限制性片断长度多态性分析，分析ＨＢＶ前Ｃ区终码变异。     

乙型肝炎病毒C基因G87变异对宿主细胞HLA-I表达的影响

目的 探讨HBV C基因G87变异对宿主细胞表面HLA-I表达的影响。方法 采用定点突变技术和亚克隆技术，将HBV野生型基因组质粒构建为C基因G87变异株表达载体(EBO-G87)和野生株表达载体(EBO-WT)，以脂质体技术分别转染HepG2细胞，转染细胞经FITC标记的鼠抗HLA-ABC mAb染色，流式细胞术测定细胞表面HLA-I的表达。结果 构建的EBO-G87和EBO-WT重组载体经内切酶双酶切鉴定及核苷酸序列测定证实。HepG2细胞表面HLA-I表达的平均荧光强度，EBO空载体转染的细胞为2．3，EBO-WT转染的细胞明显增强至18．8，EBO-G87转染的细胞增至10.5。结论 2株HBV上调HLA-I表达强度不同，C基因G87变异可使宿主细胞表面的HLA-I表达水平发生改变。     

隐匿性HBV感染相关S基因突变对HBsAg检测的影响及其机制

目的 探讨隐匿性HBV感染(OBI)相关S基因突变对多种抗-HBs及HBsAg临床检测试剂的反应性.方法 9种代表性S基因突变株(M1-M9,其中M1-M5为本课题组首次报道)分离自1例OBI患者和3例OBI献血人员血清.分别采用野生型及突变型S基因重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞,分析9种突变株HBsAg表达及其突变蛋白对抗体和检测试剂反应的影响.结果 采用HBsAg罗氏诊断试剂Elecsys定量检测9种突变株胞内HBsAg水平,均较野生株的水平明显下降;相同样品用抗-His抗体检测显示仅M1、M6和M7的HBsAg-His融合蛋白表达水平与野生株比较明显降低.6种抗-HBs与各突变HBsAg的反应性结果(S/CO值)显示,与野生株相比,多数突变株与6种抗-HBs的反应性明显降低,M1、M4、M7和M9产生的HBsAg与抗体4及M9产生的HBsAg与抗体6反应性最差(S/CO＜1).6种商品化HBsAg临床试剂检测结果显示,多数突变株与6种HBsAg试剂反应性较野生株明显降低(P＜0.05),ELISA试剂D、E和F漏检率分别为11.1％、22.2％和55.6％.结论 本实验涉及的突变HBsAg与抗-HBs的结合力降低是引起OBI表现的主要原因之一.当前临床常用HBsAg检测试剂对突变HBsAg的检测能力存在明显不足,亟待提高.     

YMDD突变株HBV转基因小鼠的制备及检测

目的建立YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠,为乙肝防治研究提供转基因动物模型。方法采用受精卵显微注射法,将带有YMDD突变的对拉米夫定有耐药性的1.3拷贝HBV基因注入FVB/N单细胞受精卵的原核内,制备YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠。采用PCR检测外源基因的整合和传代情况,采用ELISA和免疫组化等方法检测HBsAg在肝、肾中的复制和表达情况。结果注射受精卵3401枚,产269只F0代仔鼠,PCR阳性33只,外源基因的整合率12.3%。9只转基因鼠血清HBVDNA弱阳性,拷贝数低于103拷贝/ml;免疫组化结果显示肝组织和肾组织均有HBsAg表达,且肾组织中的表达强于肝组织。经传代产下47只F1代转基因鼠,目的基因PCR阳性率为27.6%,且肝组织和肾组织中HBsAg均有表达,分布特性与F0代一致。结论成功制备出体内有复制表达而且可以传代YMDD耐药突变株HBV的转基因小鼠。     

HBV启动子对肝细胞具有特异性转录活性的研究

目的：探讨HBV转录调控核心序列在肝细胞中转录的活性。方法：构建HBV增强子和启动子调控的荧光素酶报告栽体，用脂质体转染法将其转染肝细胞和非肝细胞，双荧光素酶报告基因试验检测其在不同细胞中的转录活性。结果：HBV启动子在2、2.15细胞中转录活性最高，在其他肝细胞中的转录活性显著高于非肝细胞。结论：由HBV启动子构建的载体可能是一种新颖的有前景的靶向性肝癌细胞基因治疗栽体。     

HBsAg和抗HBs双阳性患者S基因新增N-糖基化突变的意义

目的 分析乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg+抗HBs双阳性患者S基因主要亲水区(MHR)新增N-糖基化突变的特点,探讨HBsAg+抗HBs双阳性的发生机制和临床意义.方法 对284例HBsAg+抗HBs双阳性和314例HBsAg单阳性的慢性HBV感染者S基因进行测序分析.对1例携有MHR区双N-糖基化新型突变株的慢性乙肝患者样本进行随访收集和研究.构建双N-糖基化突变和对照前S/S基因重组质粒,转染HepG2细胞,分析突变对病毒复制力和抗原性的影响.结果 HBsAg+抗HBs双阳性患者MHR区新增N-糖基化突变的检出率为11.3％(32/284),显著高于HBsAg单阳性患者的2.9％(9/314)(P＜0.01).HBsAg+抗HBs双阳性组中,72例肝细胞癌(HCC)在N-糖基化突变阳性和阴性患者中所占比例分别为46.9％(15/32)和22.6％(57/252) (P＜0.01).从1例患者中检出的新型株突变形式为s116-118TST→NST+s 131-133TSM→NST,并联合sP120缺失+G145D突变,在3份随访样本中该突变株分别占98.0％、2.0％和2.5％,第2份样本中检出s130-132GTS→NSS单N-糖基化突变株,占17.6％,但无sP120缺失+G145D联合突变.与野生株相比,新型突变株复制力提高31％,但HBsAg定量降低99％.免疫荧光结果显示,双N-糖基化定点回复突变株可部分恢复HBsAg检出水平,提示除双N-糖基化突变外,sP120缺失+G145D联合突变对HBsAg抗原性减弱也有明显影响.结论 HBV S基因MHR区新增N-糖基化突变与HBsAg+抗HBs双阳性相关,两者同时出现可能是HCC发生的高风险因素;S基因MHR区新增双N-糖基化+sP120缺失+sG145D联合突变共同影响HBsAg的抗原性.     

HBV全基因核心蛋白变异株稳定表达载体的构建及其抗原表达

通过定点突变技术将HBV质粒p3．8Ⅱ构建成核心蛋白变异株V60和L97。经序列测定和生物学活性检测后，亚克隆入EB病毒稳定表达载体。重组载体分别作内切酶酶切鉴定和序列测定证实，用脂质体介导转染HepG2细胞稳定传代，定量测定各株培养上清HBV抗原表达。结果发现，3株HBsAg含量S／N值接近，变异株HBeAg含量S／CO值低于野生株。上述3种重组载体的构建可为体外研究HBV核心蛋白热点变异与致病的关系提供基础。     

1121例慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区的耐药突变分析

目的 分析大样本慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶基因上的多位点核苷(酸)类似物的耐药相关突变情况及其临床意义.方法 提取1 121例患者血清HBV DNA,采用巢式PCR方法 扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对12个位点上的耐药相关突变进行检测,并结合临床资料进行分析.结果 检出拉米夫定(LAM)耐药突变228例,阿德福韦(ADV)耐药突变32例,恩替卡韦(ETV)耐药突变13例,替比夫定(L-dT)耐药突变4例.多药耐药5例.LAM耐药突变中以M204V和M2041最常见,前者通常伴随U80M突变,后者常单独出现;ADV耐药突变中以N236T±A181位碱基替换为主;ETV耐药突变发生在LAM耐药基础上,以T184位碱基替换为主;L-dT的耐药突变为M2041.结论 用基因序列测定法检测HBV RT基因多位点耐药相关突变,有助于临床及时发现乙肝患者是否存在HBV基因耐药,合理进行抗病毒治疗.     

乙型肝炎病毒前C/C区及其调控基因变异的研究

目的研究慢性乙型肝炎病人中HBVpreC/C基因及其调控序列的变异和特点。方法对42例慢性乙型肝炎病人中扩增的HBVDNA各3个克隆进行序列分析。结果42例病人,HBVC基因调控序列发生T1762A1764双突变者20例,其中HBeAg阳性者7例,HBeAg阴性者13例(P<005);22例发生T1673G1799双突变。前C变异中,18例发生A1896变异,其中HBeAg阳性者6例,HBeAg阴性者12例(P<0.05)。C区变异中,AA5、AA38、AA60、AA87、AA97、AA130、AA135都是变异的热点。前C/C区还存在有插入、缺失等不同变异。结论慢性乙型肝炎病人的HBVC基因及其调控序列变异具有多样性及复杂性,与体内的免疫清除与病毒逃避免疫攻击相关,从而容易导致疾病的慢性化。