Fmr1基因敲除对小鼠生长发育的影响

目的：Fmr1基因敲除对小鼠生长发育的影响.方法：挑选10周龄FVB小鼠和Fmr1基因敲除小鼠各20只（雌、雄各半）,采取1∶1同居,全同胞兄妹近交繁殖,测定子代生长发育指标,进行统计分析.结果：Fmr1基因敲除小鼠体质量与体长分别为：0 d,（1.25.4±0.21）g,（38.99±1.74）mm;21 d,（8.17±2.26）g,（122.81±11.42）mm;60 d,（22.93±2.93）g,（180.19±7.46）mm;FVB小鼠体质量与体长分别为：0 d,（1.33±0.23）g,（40.53±3.05）mm;21 d,（7.75±1.56）g,（118.73±7.85）mm;60 d,（21.11±1.99）g,（176.43±5.73）mm.两个品系的小鼠体质量与体长的增长差异无统计学意义（P〉0.05）.结论：Fmr1基因敲除不影响小鼠正常的生长发育.     

Nrf2基因敲除小鼠的饲养繁殖及基因型鉴定

目的 繁殖和鉴定Nrf2基因敲除小鼠.方法 将引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功的子代有3种基因型小鼠,即野生型、杂合子以及纯合子小鼠,从繁殖成功的小鼠尾巴中提取基因组DNA,用PCR法鉴定小鼠的基因型.结果 Nrf2杂合子小鼠的繁殖和饲养均获得成功,亦获得了较多的基因敲除纯合子小鼠.结论 正确的饲养繁殖以及鉴定方法是从杂合子中获得Nrf2基因敲除纯合子小鼠的有效途径.     

髓系特异性Spi1基因敲除小鼠的构建和基因鉴定

目的 构建髓系特异性Spi1基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。方法 根据CRISPR/Cas9技术原理和Cre/LoxP系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2两侧各放置同向Loxp元件;将Cas9蛋白、sgRNA和Donor载体混合显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6J母鼠的子宫中,19～20 d后获得F0代。将阳性F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配,得到稳定的F1代Spi1^flox/+小鼠。F1代Spi1^flox/+小鼠雌雄自交得到Spi1^flox/flox小鼠。Spi1^flox/flox与Lyz2-Cre⁺小鼠交配得到Spi1^flox/+/Lyz2-Cre⁺小鼠,再将其与Spi1^flox/flox交配,得到的Spi1^flox/flox/...     

促肾上腺皮质激素释放激素基因敲除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的探讨促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)基因敲除(KO)小鼠饲养、繁殖及基因型鉴定的方法。方法从美国Jackson实验室引进CRH KO小鼠,按照遗传学规则,对杂合子型(CRH+/-)小鼠进行配对繁殖,提取幼鼠尾部组织全基因组DNA,通过聚合酶链反应(PCR)对幼鼠基因型进行鉴定。结果 CRH KO纯合子型(CRH-/-)小鼠的繁殖和饲养均获得成功,采用PCR成功地对所获得的小鼠进行基因分析,在子代小鼠中存在野生纯合子型(CRH+/+)、杂合子型(CRH+/-)及CRHKO纯合子型(CRH-/-)小鼠。CRH-/-小鼠较另外2种基因型小鼠存活率明显下降,但3种基因型小鼠在出生后10 d及30d体质量无明显差异。结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法可从杂合子型(CRH+/-)小鼠中获得CRH KO纯合子型(CRH-/-)小鼠。     

βB2晶体蛋白基因敲除小鼠模型的建立

目的:建立βB2晶体蛋白基因敲除小鼠模型.方法:采用美国iGTL实验室的技术构建打靶载体,建立基因敲除小鼠模型.采用PCR对小鼠基因型进行鉴定,Western印迹法对晶体蛋白的表达进行鉴定.结果:PCR成功检测出3种基因型;纯合子基因敲除的小鼠未检测到βB2晶体蛋白的表达.结论:成功构建了βB2晶体蛋白基因敲除的小鼠模型.     

ASIC1基因敲除小鼠的繁殖及基因鉴定

饲养并繁殖酸敏感离子通道1(ASIC1)基因敲除杂合子小鼠,提取小鼠尾部组织DNA,采用聚合酶链反应( PCR)方法鉴定子代小鼠基因型. ASIC1 基因敲除小鼠的繁育和鉴定均获得成功,子代小鼠基因型分别为杂合子( ASIC1+/-)、纯合子( ASIC1-/ -)和野生型( ASIC1+/ +).     

Alk-SMase基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定

目的 :为了繁育和鉴定碱性鞘磷脂酶(Alkaline sphingomyelinase,alk-SMase)基因敲除小鼠,将引进的基因敲除小鼠进行饲养繁殖,杂合子、纯合子用于继续保种。方法:对其幼鼠剪尾提取基因组DNA,采用PCR方法进行基因型鉴定;取alkSMase表达组织做HE染色进行形态学比较。结果 :对引进小鼠已成功饲养和繁殖,并得到纯合alk-SMase基因缺失型小鼠。结论:正确的饲养、繁殖及基因鉴定方法对于基因敲除小鼠的获得和保种具有重要的意义。     

水通道蛋白5基因敲除纯合子小鼠的获取

水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是表达于动植物细胞膜表面的一类蛋白质,主要调控渗透压介导的水分子运动,也部分调控其他小分子如甘油、尿素等物质的跨膜运动.目前发现人类有12种AQPs的表达,主要表达于泌尿系统、消化系统、呼吸系统等部位液体流动量较大的细胞膜上.呼吸系统中主要表达AQP1、3、4、5四种分子,其中AQP1、AQP5在急性肺损伤的发病中具有重要作用[1-2],但二者的确切作用机制尚不很清楚,对其确切机制的探讨是目前研究的热点.     

利用TALEN技术高效制备TXNIP基因敲除小鼠模型

目的 利用显微注射技术注射敲除Txnip基因的TALEN mRNA获得TXNIP敲除小鼠。方法 在线设计Txnip敲除位点, 构建TALEN载体并在细胞水平验证剪切活性, 体外转录TALENs成mRNA并通过显微注射技术注射到C57BL/6J小鼠受精卵, 对F0代小鼠进行DNA水平鉴定获得TXNIP敲除小鼠。结果 在Txnip第一外显子上设计了TALEN识别剪切位点, 并在细胞水平验证具有剪切活性, 注射mRNA到受精卵获得了4只敲除小鼠, 其中2只Txnip发生移码突变, 成功制备了TXNIP敲除小鼠。结论 通过注射TALENs mRNA可以高效制备TXNIP敲除小鼠。     

NF-kappaB p50基因敲除小鼠子宫内膜异位症模型的建立及其研究

目的利用NF-kappaBp50基因敲除小鼠建立子宫内膜异位症模型探索NF-kappaBp50亚单位在子宫内膜异位症发生发展中的作用。方法利用子宫内膜移植法建立P50基因敲除小鼠及野生型对照小鼠的子宫内膜异位症动物模型,检测建模后异位病灶大小、免疫组化检测异位病灶、在位内膜以及阴道磷酸化p65(p-p65)、PKCepsilon和TRPV1的表达。结果 p50基因敲除小鼠异位病灶明显减小,并且,p50基因敲除小鼠异位病灶,在位内膜,以及阴道的p-p65 and PKCepsilon的表达也下降。结论 NF-kappaBp50亚单位在子宫内膜异位症的发生发展中起重要作用,可能是潜在的治疗靶标。     

PICK1基因敲除小鼠的繁育及子代基因型的鉴定

目的 探讨蛋白激酶Cα相互作用蛋白(PICK1)基因敲除小鼠的优化繁育方法及 PICK1 基因敲除小鼠子代鼠的鉴定方法,为进一步研究 PICK1蛋白的功能奠定基础.方法 用 6 种不同的交配方式观察子代鼠的各表型比率及雌、雄性PICK1 基因突变纯合子小鼠的繁殖能力;从子鼠鼠尾中提取基因组 DNA,用 PCR 方法扩增 PICK1 基因片段,电泳后观察结果.结果 PICK1 / 、PICK1 /-、PICK1-/-各表型小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,且雌性PICK1 基因突变纯合子小鼠有繁殖能力,雄性PICK1 基因突变纯合子小鼠无繁殖能力.琼脂糖凝胶电泳显示PCR 产物分子量大小为 400 bp 和 200 bp,与目的 基因片段相对分子质量大小一致.结论 雌、雄性PICK1 基因突变杂合子小鼠交配是繁育PICK1 基因突变纯合子子鼠的较好方法;实验所用PCR方法能够精确鉴定PICK1 基因突变纯合子子鼠,为PICK1 蛋白功能的实验研究提供了较理想的动物模型.     

TAFA2基因剔除小鼠模型的建立

目的 建立TAFA2基因剔除小鼠模型,为在体研究TAFA2基因的生物学功能及其与中枢神经系统发生、发育的关系创造条件. 方法 运用生物信息学手段确定小鼠TAFA2基因组的序列,设计基因剔除策略,构建基因剔除载体pBR322-MK-MCS-TAFA2,以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆,PCR鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆. 结果 同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚后获得嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti（野生型）毛色的小鼠41只,其中14只为TAFA2基因剔除杂合子小鼠,阳性率为34.1%.在雌、雄杂合子小鼠交配的后代中获得纯合子小鼠,初步的表型观察未发现TAFA2基因剔除小鼠出现异常改变. 结论 已成功建立了TAFA2基因剔除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.     

半枝莲总黄酮对ApoE基因敲除小鼠血清PLTP、IL-6、CRP表达的影响

 目的探讨半枝莲总黄酮对载脂蛋白E基因敲除小鼠AS病变形成早期血脂水平与血清磷脂转运蛋白（PLTP）、Il-6、C
反应蛋白（CRP）表达的影响。方法载脂蛋白E 基因敲除小鼠随机分为模型组、辛伐他汀组、银杏叶胶囊组、半枝莲总黄酮高、
中、低剂量组,取正常C57BL/6 小鼠为对照组,各6 只。除模型组、对照组给予等容量羧甲基纤维素钠外,其他各组分别给予阳性
对照药与受试药8 周。处死小鼠,ELISA 法检测血脂、PLTP、IL-6 及CRP 的表达水平。取主动脉制作切片、HE染色,观察形态学
变化。结果半枝莲总黄酮中、高剂量组TG、TC、LDL-C 水平明显低于模型组,高剂量组HDL-C 水平高于模型组,半枝莲总黄
酮各组PLTP、IL-6、CPR的表达水平较模型组明显降低,有统计学意义。PLTP与IL-6 水平呈正相关,与CRP 水平呈正相关,IL-6
与CRP 水平呈正相关。结论半枝莲总黄酮可通过降低载脂蛋白E 基因敲除小鼠TG、TC、LDL-C 水平,升高HDL-C 水平,降
低PLTP、IL-6、CPR 水平而发挥抗AS 的作用。     

Carrier Screening and Prenatal Gene Diagnosis of β-thalassemia by PCR-RDB Technique

Beta- thalassemia is the most common geneticdisease all over the world. It is caused by heteroge-neous defects in theβ- globin gene,mostly due topoint mutation.Inβ- thalassemia major,both allelesof theβ- globin chain are mutated. Affected new-borns develop progressively severe anemia beginningat3 months of age.Lifelong blood transfusion andbone marrow transplantation are the only treatment.Furthermore,the incidence of particular mutationsvaries among different populations. Because of theet…     

新转移相关基因ATP 结合盒转运子E1在非小细胞肺癌中的表达及其意义

 目的观察ATP 结合盒转运子E1（ABCE1 ）的mRNA和蛋白在非小细胞肺癌组织、癌旁肺组织及转移淋巴结中的表达情况,探讨其在肺癌发生、发展中的意义及其与各种临床病理参数的关系。方法应用半定量逆转录聚合酶链反应、Westernblot 和免疫组织化学SP法检测非小细胞肺癌组织、癌旁肺组织和转移淋巴结中ABCE1mRNA 和蛋白的表达情况。结果肺癌组织和转移淋巴结中ABCE1mRNA和蛋白的表达量均高于癌旁肺组织（P<0.05）,且mRNA和蛋白的表达呈正相关（r =3.992,P =0.001）。ABCE1 蛋白的表达与患者年龄、性别、组织学分级、有无淋巴结转移及pTNM 分期无关（ P> 0.05）,与病理类型有关（P =0.036）,在肺腺癌中的表达高于鳞癌; ABCE1mRNA 的表达与肺癌组织学分级有关（P =0.026）。结论ABCE1的表达可能与非小细胞肺癌的侵袭和转移相关,在肺癌的发生发展过程中起到了重要作用,并可能成为潜在的肿瘤标记物及预后指标。     

Survivin基因在膀胱肿瘤中的表达

目的探讨Survivin基因在膀胱TCC中的表达及其与膀胱肿瘤生物学行为关系。方法逆转录PCR方法检测了16例正常膀胱组织、12例膀胱移行细胞乳头状瘤和59例膀胱TCC组织Survivin基因的表达。结果59例膀胱TCC呈Survivin基因高表达,其表达阳性率为76.27%,而膀胱移行细胞乳头状瘤和正常组织则有16.67%(2/12)和0(0/16)的表达,其差异有显著性(P<0.01)。Survivin基因的表达随肿瘤的分化程度的降低和TNM分期的增加而增多,但无明显统计学意义。其表达与膀胱肿瘤其它生物学行为如发病情况和年龄因素无明显相关性(P>0.05)。结论Survivin基因在膀胱移行细胞肿瘤中的高表达提示其与TCC的发生有关。Survivin基因对膀胱TCC临床早期诊断和靶向治疗有重要意义。     

脂质体介导TFPI-2质粒DNA转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的探讨角膜基质细胞组织因子途径抑制物2(TFPI-2)的表达情况,为角膜新生血管的基因治疗提供方法.方法体外兔角膜基质细胞原代、传代培养;脂质体介导人类TFPI-2真核表达载体pBos-Cite-neo/TFPI-2转染角膜基质细胞,RT-PCR,Western blot技术检测转染前后基质细胞中TFPI-2 mRNA及相应蛋白质的表达水平.结果转染前后基质细胞TFPI-2 mRNA的表达水平IATFPI-2/IAβ-actin分别为0.56±0.04、0.78±0.03;蛋白质的表达水平IA值分别为18.4±1.3、24.2±0.5,差异均有显著意义.结论培养角膜基质细胞可基础表达一定量的TFPI-2,转染TFPI-2质粒后使基质细胞TFPI-2 mRNA和蛋白质的表达增高,为开展角膜新生血管的基因治疗提供实验依据.     

银染mRNA差异显示方法的建立

目的：建立银染mRNA差异显示方法，为差异表达基因片断的分离克隆奠定基础，方法：采用随机引物和锚定引物各1条，建立差异显示反转录聚合酶链式反应（DDRT－PCR）和银染方法，对DDRT－PCR过程中各实验影响因素进行优化，割取差异条带进行二次扩增。结果：当总RNA用量为0．2ug，引物浓度为0．6－1．0umol/L,dNTP浓度为200unmol/L,MgCl2浓度为1．6－2.0mmol/L，时，同时起始5个循环的退火温度为50℃，扩增效率最佳，特异性好，背景 干净，结论：DDRT－PCR方法简便，灵敏，高效，可用于分离差异表达基因。