人脐血间充质干细胞分离、培养及向成骨细胞分化的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞(MSCs)的分离培养及向成骨细胞的分化潜能。方法从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;1.0×10-8mol/L地塞米松,2.0×10-4mol/L抗坏血酸,7.0×10-3mol/Lβ-磷酸甘油的IMDM培养基对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,von-Kossa染色鉴定。结果成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后细胞间可见黑色矿化物沉积阳性。结论脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为成骨细胞。     

不同培养条件下人脐血间充质干细胞的差异

目的：观察不同条件对人脐血间充质于细胞培养的影响。方法：实验于2004—10／2005—10在首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。①用复方枸橼酸血液保存液和肝素钠两种不同的抗凝血剂保存的人脐带血，经密度梯度离心法分离新鲜脐带血，获取的单个核细胞，经椎虫蓝染色进行活细胞计数，比较所获得的单个核细胞数。②用不同密度1&;#215;10^9L^-1，2&;#215;10^9L^-1,5&;#215;10^9L^-1接种单个核细胞，倒置显微镜下观察细胞形态。用流式细胞仪检测所培养的细胞免疫表型。③分别用高糖和低糖DMEM培养液（含体积分数0．1的胎牛血清）培养单个核细胞，其他条件相同，从72h后对所形成的细胞克隆进行计数，对两种培养基形成的细胞克隆和生长状况进行比较。结果：①不同抗凝血剂抗凝的人脐带血所获得的单个核细胞数及细胞生长状态：用肝素钠抗凝血剂保存的人脐带血所获得的单个核细胞数和细胞生长状态明显优于用复方枸橼酸血液保存液保存的人脐带血（P〈0．05）。②不同接种密度人脐血间充质干细胞的贴壁生长状态及人脐血间充质干细胞的免疫表型：较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞，而以5&;#215;10^9L^-1密度接种，72h后单个核细胞开始贴壁并开始形成细胞克隆，在10d后出现梭形细胞，培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。用流式细胞仪检测所培养的细胞为非造血间充质干细胞。③两种培养基形成的细胞克隆数和生长状况：在10d以后，用低糖DMEM组培养的单个核细胞形成的细胞克隆数与高糖DMEM组相比较差异有显著性意义（P〈0．05）。结论：①肝素钠作为人脐带血保存液能获得大量的单个核细胞，有利于人脐血间充质干细胞的培养。②5&;#215;10^9L^-1。细胞接种密度有利于人脐血间充质干细胞贴壁生长。③用低糖DMEM作为培养人脐血间充质干细胞的培养基有利于细胞克隆的形成和维持，对保持人脐血间充质干细胞特性有良好作用。     

人脐带血间充质干细胞的体外培养及其影响因素

背景:多潜能间充质干细胞在特定的培养条件下可以分化为骨、脂肪、软骨、肌肉以及内皮细胞,是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞。目的:建立人脐带血来源的间充质干细胞体外培养、扩增的方法,并分析其影响因素。设计:随机对照实验。单位:无锡第三人民医院组织工程和细胞生物学研究室。材料:健康新生儿脐带血(来源于无锡第三人民医院妇产科临产室,均征得产妇及其家属同意)70例,每例40mL;低糖基本必需培养基(Gibco),胎牛血清(Gibco),青链霉素(Gibco),胰蛋白酶(Gibco),FITC标记的小鼠抗人CD29、CD105、CD106(Ancell)单克隆荧光抗体和PE标记的小鼠抗人CD34、CD44、CD45、CD19、HLA-DR(Immunotech)单克隆荧光抗体,Ficoll分离液(Pharmacia)。方法:实验于2005-02/2005-12在无锡第三人民医院组织工程和细胞生物学研究室完成。①脐血间充质细胞的分离培养:健康新生儿脐带血共70例肝素(25u/mL)抗凝,分离单个核细胞,其中60例沉淀细胞用细胞培养液(低糖基本必需培养基 50g/L胎牛血清 10g/L青链霉素)重悬,另10例用高糖基本必需培养基重悬(其余培养条件相同)。细胞长到80%融合时,以1.0×107个/L的密度接种于培养瓶中进行扩增培养。②胎牛血清包被对人脐血间充质干细胞贴壁率的影响:取生长状态良好、纯化后对数生长期的人脐血间充质干细胞,分为血清包被组和无血清包被组,分别观察其贴壁率。③间充质干细胞的形态学和生长曲线:在相差显微镜(OLYMPUS CK40)下观察细胞生长状况,数码成像系统(OLYMPUS DP50)摄像记录。④免疫表型:取扩增第5代的脐血间充质干细胞,用EPICS-ALTRA流式细胞仪进行检测。主要观察指标:①观察高糖组和低糖组细胞的生长状态。②观察不同时间点胎牛血清包被组与未包被组细胞的贴壁情况并分别计算贴壁率。结果:本实验总共培养和分析了70例脐血间充质干细胞样本。由于10例予含高糖的培养基培养的标本均未获得理想的间充质干细胞,故未进行统计学分析。①按照本实验所建立的培养体系,约20%的样本成功培养出脐血间充质干细胞。原代细胞在培养2周后可达到融合,一般其倍增时间为3～4d,传代后7～8d即可达到融合。②扩增至第5代的间充质干细胞结果显示,脐血间充质干细胞均一稳定地表达间充质干细胞相关的抗原标记:CD29,CD44,CD105,但不表达CD34,CD45,CD106,HLA-DR,这与源于骨髓的间充质干细胞的表面抗原标记相一致。③血清包被组间充质干细胞贴壁率显著高于无血清包被组(P<0.01)。结论:脐带血中的间充质干细胞可在体外培养、扩增,能够作为间充质干细胞的一种有效来源。高糖可能抑制人脐血间充质干细胞的生长和扩增。     

不同培养条件下人脐血间充质干细胞的差异

目的:观察不同条件对人脐血间充质干细胞培养的影响。方法:实验于2004-10/2005-10在首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。①用复方枸橼酸血液保存液和肝素钠两种不同的抗凝血剂保存的人脐带血,经密度梯度离心法分离新鲜脐带血,获取的单个核细胞,经椎虫蓝染色进行活细胞计数,比较所获得的单个核细胞数。②用不同密度1×109L-1,2×109L-1,5×109L-1接种单个核细胞,倒置显微镜下观察细胞形态。用流式细胞仪检测所培养的细胞免疫表型。③分别用高糖和低糖DMEM培养液(含体积分数0.1的胎牛血清)培养单个核细胞,其他条件相同,从72h后对所形成的细胞克隆进行计数,对两种培养基形成的细胞克隆和生长状况进行比较。结果:①不同抗凝血剂抗凝的人脐带血所获得的单个核细胞数及细胞生长状态:用肝素钠抗凝血剂保存的人脐带血所获得的单个核细胞数和细胞生长状态明显优于用复方枸橼酸血液保存液保存的人脐带血(P<0.05)。②不同接种密度人脐血间充质干细胞的贴壁生长状态及人脐血间充质干细胞的免疫表型:较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞,而以5×109L-1密度接种,72h后单个核细胞开始贴壁并开始形成细胞克隆,在10d后出现梭形细胞,培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。用流式细胞仪检测所培养的细胞为非造血间充质干细胞。③两种培养基形成的细胞克隆数和生长状况:在10d以后,用低糖DMEM组培养的单个核细胞形成的细胞克隆数与高糖DMEM组相比较差异有显著性意义(P<0.05)。结论:①肝素钠作为人脐带血保存液能获得大量的单个核细胞,有利于人脐血间充质干细胞的培养。②5×109L-1细胞接种密度有利于人脐血间充质干细胞贴壁生长。③用低糖DMEM作为培养人脐血间充质干细胞的培养基有利于细胞克隆的形成和维持,对保持人脐血间充质干细胞特性有良好作用。     

脐血间充质干细胞培养体系的建立

目的:寻找脐带血来源的间充质干细胞体外分离、纯化及培养的条件,以建立稳定的体外培养体系,满足实验和临床的需要。方法:实验于2005-06/2006-04在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成。脐带血36份,50～60mL/份,取自青岛大学医学院附属医院产科健康产妇正常足月顺产或剖宫产分娩婴儿的脐带血,经产妇本人及家属同意。无菌条件下取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。16份脐血每份分为3组,分别以间充质干细胞接种密度1×107L-1、1×109L-1、1×1011L-1接种于未包被6孔培养板内,加入5%胎牛血清的DMEM-LG培养。20份脐血每份分为3组,以1×1011L-1单个核细胞密度分别加入5%、10%和20%胎牛血清的DMEM-LG接种于胎牛血清包被的6孔培养板内培养。采用常规的间充质干细胞培养Friedenstein法进行脐血间充质干细胞的培养和扩增培养。观察不同脐血单个核细胞的接种密度、培养液胎牛血清浓度和胎牛血清包被培养皿对间充质干细胞培养的影响。结果:①胎牛血清未包被组以1×107L-1和1×109L-1接种组培养7d后贴壁数量很少,贴壁的细胞未长满瓶底即死亡,无法传代。1×1011L-1组贴壁细胞较多,间充质样细胞与破骨样细胞并存。1×1011L-1组分5%、10%、20%3种血清浓度,贴壁细胞均较多,以间充质干细胞为主,胎牛血清浓度5%组间充质干细胞的纯度较10%及20%组高,破骨样细胞相对较少;胎牛血清包被组与未包被组相比,贴壁细胞少,培养的间充质干细胞纯度较高,破骨样细胞相对较少。②流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,脐血P3代间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD45、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论:将脐血单个核细胞以1×1011L-1高密度接种在5%低胎牛血清浓度的低糖DMEM培养基中、胎牛血清包被培养瓶等条件下,可以在体外成功的培养出较纯化的脐血间充质干细胞,其培养成功率和间充质干细胞纯度较高。     

钛颗粒对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响

目的：钛合金假体磨损产生的钛颗粒对骨髓间充质干细胞成骨分化所造成影响可能是假体松动的原因之一．总结钛颗粒对骨髓间充质干细胞成骨分化影响的研究近况。 资料来源：应用微机检索Medline1980—01／2005-12相关钛颗粒对骨髓间充质干细胞成骨分化影响的文献，检索词“mesenchymal stem cells，bone marrow，osteogenesis，titanium，wear particles”，并限定文献语言种类为English。同时微机检索中国期刊全文数据库2000—01／2005—12相关钛颗粒对骨髓间充质干细胞成骨分化影响方面的文献。检索词为“间充质干细胞，骨生成，钛”，并限定语言种类为中文。 资料选择：对资料进行初审，并开始查找全文。纳入标准：①钛颗粒与假体松动。②钛颗粒与骨髓间充质干细胞成骨分化能力的关系。排除标准：综述文献、重复研究、Meta分析类文章。 资料提炼：共收集到96篇关于钛颗粒与假体松动以及钛颗粒与骨髓间充质干细胞成骨分化能力关系的文献，纳入15篇符合标准的文献。 资料综合：钛及其合金具有优秀的生物相容性、超强的耐腐蚀性和较低的弹性模量等优点而被广泛应用。有研究显示，金属颗粒引发假体周围的无菌性炎症是导致其松动的重要原因。然而，假体的长期稳定需要骨与假体的紧密长入，而这需要假体周围的骨髓间充质干细胞的成骨转化。钛颗粒可以通过影响间充质干细胞的增殖并引起间充质干细胞的凋亡而使骨髓中的间充质干细胞数量减少。除了钛颗粒本身以外，由钛颗粒作用于细胞后所产生并释放的可溶性细胞因子对骨髓间充质干细胞的活性也具有抑制作用。而这方面的作用机制还有待于进一步的研究。 结论：钛颗粒对骨髓间充质干细胞本身的活力以及向成骨细胞分化能力等方面均有负面的作用，这可能是钛合金人工关节假体松动的原因之一。     

钛颗粒对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响

目的:钛合金假体磨损产生的钛颗粒对骨髓间充质干细胞成骨分化所造成影响可能是假体松动的原因之一,总结钛颗粒对骨髓间充质干细胞成骨分化影响的研究近况。资料来源:应用微机检索Medline1980-01/2005-12相关钛颗粒对骨髓间充质干细胞成骨分化影响的文献,检索词“mesenchymalstemcells,bonemarrow,osteogenesis,titanium,wearparticles”,并限定文献语言种类为English。同时微机检索中国期刊全文数据库2000-01/2005-12相关钛颗粒对骨髓间充质干细胞成骨分化影响方面的文献,检索词为“间充质干细胞,骨生成,钛”,并限定语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并开始查找全文。纳入标准:①钛颗粒与假体松动。②钛颗粒与骨髓间充质干细胞成骨分化能力的关系。排除标准:综述文献、重复研究、Meta分析类文章。资料提炼:共收集到96篇关于钛颗粒与假体松动以及钛颗粒与骨髓间充质干细胞成骨分化能力关系的文献,纳入15篇符合标准的文献。资料综合:钛及其合金具有优秀的生物相容性、超强的耐腐蚀性和较低的弹性模量等优点而被广泛应用。有研究显示,金属颗粒引发假体周围的无菌性炎症是导致其松动的重要原因。然而,假体的长期稳定需要骨与假体的紧密长入,而这需要假体周围的骨髓间充质干细胞的成骨转化。钛颗粒可以通过影响间充质干细胞的增殖并引起间充质干细胞的凋亡而使骨髓中的间充质干细胞数量减少。除了钛颗粒本身以外,由钛颗粒作用于细胞后所产生并释放的可溶性细胞因子对骨髓间充质干细胞的活性也具有抑制作用,而这方面的作用机制还有待于进一步的研究。结论:钛颗粒对骨髓间充质干细胞本身的活力以及向成骨细胞分化能力等方面均有负面的作用,这可能是钛合金人工关节假体松动的原因之一。     

胰岛干细胞和脐血间充质干细胞体外分离培养的形态学特征观察

背景：干细胞是具有自我更新能力和高度增殖能力和多种分化潜能的较原始细胞，在一定的条件下，干细胞可以分化成机体内的多种功能细胞。胰岛干细胞和脐血间充质干细胞可以治疗相应系统的疾病，但是目前有关这两类干细胞的培养仍有困难。目的：探讨胰岛干细胞和脐血间充质干细胞分离和培养的方法，并观察在培养过程中两类干细胞的形态学变化。设计：完全随机分组设计，重复测量实验。单位：郑州大学医学院生理学教研室于细胞研究中心材料：实验于2004-04／2005-01在郑州大学医学院干细胞中心完成。选用鼠龄1-3d新生SD大鼠10-15只进行胰岛干细胞培养，采集年龄24—35岁的足月妊娠健康产妇（经过产妇知情同意）新鲜脐带血进行脐血问充质细胞的培养。方法：取新生SD大鼠，无菌条件下剖腹取胰，眼科剪反复剪切后V型胶原酶消化分离胰岛。连续转瓶法纯化胰岛。取新鲜采集脐带血，用1．077g／cm^3的淋巴细胞分层液，密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。将胰岛细胞和脐血单个核细胞接种于37℃，体积分数0.05 CO2培养箱内培养。于不同时间观察细胞形态的变化并通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况。主要观察指标：胰岛干细胞和脐血间充质千细胞的分离培养方法以及在细胞生长过程中的形态学变化。结果：①培养中可见梭形胰岛祖细胞贴壁呈极性生长，并且不断增殖，约12-14d长满瓶底，可连续多次传代。撤去生长因子和血清后有圆形细胞团开始形成。②从脐血中分离出的单个核细胞，培养中先出现大量的造血细胞集落，瑞士染色显示这些细胞大多数为粒系的集落，7d后出现贴壁的扁平状的上皮样细胞和长梭形的成纤维样细胞，同时有大量的破骨样细胞混杂。随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。结论：胰岛干细胞和脐血间充质干细胞可以在体外分离和培养，用于进一步相关实验工作。     

人脐血中分离骨髓间充质干细胞成骨诱导前后的生物学特性

目的观察诱导因素对骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的影响,探索骨组织工程的种子细胞来源。方法使用密度梯度离心法分离来源于人脐血的骨髓间充质干细胞进行培养,保留已贴壁细胞传代,观察在加有地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的培养液中骨髓间充质干细胞的生长及分化情况。结果分离得到的骨髓间充质干细胞呈成纤维样表现,诱导条件下第2代细胞碱性磷酸酶活性增高,12d达到最高,为(33.10±0.54)U/ml,P<0.001,t=-48.32,且出现矿化结节。结论人脐血来源的骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下具有一定的成骨能力,可作为骨组织工程种子细胞。     

脐血来源的间充质干细胞生物学特性与向成骨细胞分化能力的研究

目的研究人脐血来源的间充质干细胞（UCBMSC）的免疫表型、生物学特性及其向成骨细胞分化的能力。方法分离脐血单个核细胞，以干细胞培养液培养间充质干细胞（MSC），观察其体外生长特性；用流式细胞术进行免疫表型测定和细胞周期分析；以含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的诱导液定向诱导向成骨细胞分化；以碱性磷酸酶染色、矿化结节染色、骨桥蛋白mRNA的表达以及I型胶原表达鉴定MSC向成骨细胞分化的潜能。结果从脐血中可以培养出MSC，为成纤维细胞样的贴壁细胞。免疫表型分析显示CD45、CD34、CD11a、CD14、HLA．DR阳性细胞占1％～3％；CD166、CD44、CD106、CD29、CD105、CD49e、CD90、CD73表达率达91％～98％。细胞周期分析显示95％以上的细胞处于G0／G1期。定向成骨细胞诱导后，可以检测到碱性磷酸酶、I型胶原的表达，矿化结节的形成和骨桥蛋白mRNA的表达。结论UCBMSC是基质细胞的祖细胞，在合适的条件下可被诱导向成骨细胞分化，因此有可能作为有潜力的骨组织工程的种子细胞来源。     

脐血间充质干细胞生物学特性及其成骨成脂分化潜能

背景:对于脐血来源间充质干细胞的研究是干细胞研究领域的重点和热点,但目前国内外研究对其报道尚较少,许多方面存在争议.目的:观察人脐血间充质干细胞的生物学特性,并探讨其向成骨、成脂肪细胞诱导分化的能力.方法:从不同胎龄脐血中分离培养间充质干细胞;通过倒置相差显微镜及透射电镜观察细胞的形态、生长增殖情况及其超微结构;并描绘细胞生长曲线;用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测.分别用成骨及成脂诱导液对脐血间充质干细胞进行诱导,通过茜素红染色检测脐血间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的能力;通过油红O染色检测其向脂肪细胞诱导分化的能力.结果与结论:倒置相差显微镜下观察脐血间充质干细胞贴壁生长,呈成纤维细胞样外观,细胞呈螺旋状排列;透射电镜观察脐血间充质干细胞细胞核大,胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞;原代及传代培养的脐血间充质干细胞生长曲线均呈S型,第3,5代细胞增殖能力最强.流式细胞仪检测结果显示,脐血间充质干细胞均稳定表达与间充质干细胞相关的表面抗原标志物CD29,CD44和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45.脐血间充质干细胞成骨诱导后3周时茜素红染色可检测到大量钙化基质的形成;成脂诱导3周时油红O染色可检测到胞质中脂滴的形成.提示脐血间充质干细胞的形态特征、生长增殖特点及细胞表面标志物等生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,具有强大的生长增殖与自我更新能力.脐血间充质干细胞在体外诱导条件下可以向成骨细胞及脂肪细胞等间质组织细胞定向分化.     

人脐血间充质干细胞的生物学特性及其成骨成脂肪分化

背景:目前有关脐血间充质干细胞的生物学特性及分化能力的研究较少.目的:观察人脐血间充质干细胞的生物学特性,及其向成骨、成脂肪细胞分化的能力.方法:从不同胎龄脐血中分离间充质干细胞,对其进行原代和传代培养,并诱导其向成骨及成脂肪细胞分化.结果与结论:倒置相差显微镜下见分离培养的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈成纤维细胞样外观,细胞呈螺旋状排列;透射电镜下可见脐血间充质干细胞胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞;原代及传代培养的脐血间充质干细胞生长曲线均呈S 型,第3,5 代细胞增殖能力最强,低胎龄的脐血间充质干细胞集落形成能力最强.流式细胞仪检测结果显示,脐血间充质干细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原CD29,CD44 和CD90,不表达造血细胞标志CD34 和CD45.成骨诱导后3 周,碱性磷酸酶染色为强阳性,茜素红染色可见大量钙化基质的形成;成脂诱导3 周,油红O 染色可检测到胞质中脂滴的形成.提示脐血间充质干细胞具有间充质干细胞的形态特征、生长增殖特点及细胞表面标志物等生物学特性,可向成骨细胞及脂肪细胞分化.     

人脐血间充质干细胞的生物学特性及其成骨成脂肪分化（英文）

背景：目前有关脐血间充质干细胞的生物学特性及分化能力的研究较少。目的：观察人脐血间充质干细胞的生物学特性,及其向成骨、成脂肪细胞分化的能力。方法：从不同胎龄脐血中分离间充质干细胞,对其进行原代和传代培养,并诱导其向成骨及成脂肪细胞分化。结果与结论：倒置相差显微镜下见分离培养的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈成纤维细胞样外观,细胞呈螺旋状排列;透射电镜下可见脐血间充质干细胞胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞;原代及传代培养的脐血间充质干细胞生长曲线均呈S型,第3,5代细胞增殖能力最强,低胎龄的脐血间充质干细胞集落形成能力最强。流式细胞仪检测结果显示,脐血间充质干细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原CD29,CD44和CD90,不表达造血细胞标志CD34和CD45。成骨诱导后3周,碱性磷酸酶染色为强阳性,茜素红染色可见大量钙化基质的形成;成脂诱导3周,油红O染色可检测到胞质中脂滴的形成。提示脐血间充质干细胞具有间充质干细胞的形态特征、生长增殖特点及细胞表面标志物等生物学特性,可向成骨细胞及脂肪细胞分化。     

脐血间充质干细胞的体外培养及其表面标志变化

背景:目前有关脐血间充质干细胞的体外培养和大规模扩增方法不一,存在一定困难.目的:观察脐血间充质样干细胞体外分离和培养的方法,并检测其表面分子的变化.方法:取新鲜采集脐带血,用1.077 g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞.将脐血单个核细胞接种于37℃、含体积分数为5%CO2培养箱内培养.于不同时间观察细胞形态的变化并通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况.结果与结论:从脐血中分离出的单个核细胞,培养中先出现大量的造血细胞集落,CFU-GM与BFU-E集落形成最多,集落分别增加了(37.1+2.3)和(10.4+1.7)倍,瑞氏染色显示这些细胞大多数为粒系的集落(80.1±85.2)%,其次为红系的细胞集落(14.2±1.8)%,7d后出现贴壁的扁平状上皮样细胞和长梭形成纤维样细胞,同时有大量的破骨样细胞混杂.扩增后第14天经流式细胞仪分析CD38+细胞为1.64%,CD34+/CD38+细胞为1_71%,CD34+/CD38-细胞为0.55%,PI+细胞为0.05%,Annexin-V+细胞为0.18%.随着培养时间的延长,细胞数目不断增加,培养21 d时,单个核细胞扩增了近7.8倍.,第28天增加了1.71倍.经流式细胞仪分析CD38+细胞为74.32%,CD34+/CD38+细胞为1.61%,CD34+/CD38-细胞为0.24%.提示脐血间充质干细胞可以体外培养.     

改良法体外培养脐带血间充质干细胞及其生物学特性分析

背景：目前报道的脐带血间充质干细胞分离成功率较低,且缺乏较为统一的鉴定方法。目的：对传统的体外分离培养脐带血间充质干细胞方法加以改良,以提高细胞培养成功率,并进行生物学特性观察。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-04／2007-01在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成。材料：取自足月健康顺产新生儿的脐带血标本28份,由上海市红房子医院产科提供,经产妇和家属同意。方法：无菌条件下取新生儿脐带血,以密度梯度离心法分离单个核细胞,以含体积分数为10％胎生血清的α-MEM培养基进行体外培养,原代培养5-7d后半量换液,后每隔三四天全量换液一次。待细胞贴壁后,按处理方法不周分为2组：改良1组当皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的皿中培养;改良2组待皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基换为含体积分数为15％小牛血清的α-MEM培养液,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为10％胎牛血清的α-MEM培养基。取第5代脐带血间充质干细胞,逍行体外成骨及成脂诱导。主要观察指标：显微镜下观察脐带血间充质干细胞的形态,流式细胞仪测定细胞免疫表型,碱性磷酸酶染色及油红染色检测细胞诱导分化能力。结果：28份脐带血中20份培养出贴壁细胞（改良1组6份/10份,改良2组14份／18份）,其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞（改良1组4份,改良2组9份）,成功率为46.4％,可传至22代且形态无变化,强烈表达CD105、CD29等间充质干细胞表面标志,而CD34、CD45和CD106等早阴性表达。在特定诱导条件下,脐带血间充质干细胞可分化为成骨细胞和脂肪细胞。结论：脐带血中存在间充质干细胞,具有多向分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定,体外培养方法经改良后可提高脐带血间充质干细胞的培养成功率。     

血小板裂解液对人脐带间充质干细胞体外成骨分化的影响

背景：血小板裂解液是浓缩后血小板的裂解产物,含有多种活性成分。有研究表明这些活性成分可促进间充质干细胞的增殖和分化,但血小板裂解液作为一个整体,对间充质干细胞成骨分化的作用尚不明确。目的：分析血小板裂解液对人脐带间充质干细胞成骨诱导分化的干预效应。方法：采用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,体外培养扩增,流式细胞仪进行细胞表型鉴定。实验分为以下4组：普通矿化液组,血小板裂解液组,矿化液-血小板裂解液联合诱导组,对照组。加入相应诱导培养基诱导培养2周。结果与结论：分离得到的人脐带间充质干细胞的细胞表型CD34（-）﹑CD45（-）、HLA-DR（-）,CD44（＋）﹑CD105（＋）﹑CD146（＋）。茜素红染色在3个诱导组中皆为阳性,染色效果未见明显差异,而对照组阴性。碱性磷酸酶活性测定显示3个诱导组的碱性磷酸酶活性都明显高于对照组（P〈0.05）,矿化液-血小板裂解液联合诱导组碱性磷酸酶活性明显高于普通矿化液组和血小板裂解液组（P〈0.05）。结果显示在体外条件下,单纯的5%血小板裂解液可以诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞定向分化,且联合应用矿化液时能更有效地诱导人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞。     

诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化

背景:脐血来源的间充质干细胞具有与造血干细胞和骨髓间充质干细胞相似的多向分化潜能,并且可以诱导分化为神经元样细胞,但分离培养后的成功率比较低,需要寻求一种成功率较高的培养方法。目的:探讨脐血间充质干细胞的生物学特性及向神经元样细胞诱导分化的方法。方法:由作者检索CNKI数据库2002/2011收录的有关脐血间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞的相关研究文献,中文检索词为"脐血间充质干细胞,神经细胞,诱导分化,细胞因子"。结果与结论:脐血间充质干细胞具有与造血干细胞和骨髓间充质干细胞相似的多向分化潜能,可以在体外诱导分化为神经样细胞,对CD34表达阴性,是区别于脐血造血干细胞的主要标志物。脐血间充质干细胞在体外诱导分化的方法主要有细胞生长因子法、化学诱导剂法、生长因子与诱导剂联合法,通过各种神经诱导剂的作用,使培养出的神经元样细胞数量有所增加,国内外基础研究结果显示移植脐血间充质干细胞诱导分化的神经元样细胞可以修复中枢神经系统损伤性疾病,脐血间充质干细胞是神经损伤修复的一种理想种子细胞。     

脐血间充质干细胞的适宜培养条件

背景：目前有关脐血间充质干细胞培养的实验较多,主要从改善培养基成分、脐血细胞的分离方法以及首次换液时间等方面进行调整,目前尚未建立一个安全、高效的培养体系。目的：探讨脐血间充质干细胞的适宜培养条件。方法：于新疆医科大学第一附属医院产科取健康产妇的脐血,比较不同换液时间、不同培养基、不同体积分数的胎牛血清对脐血间充质干细胞原代培养效果的影响。结果与结论：首次第5～7天换液、低糖DMEM、IMDM培养基有利于脐血间充质干细胞的生长。但还不能认为含体积分数为30%胎牛血清与含体积分数为20%胎牛血清的培养基在培养脐血间充质干细胞方面有差别。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

背景：人脐带间充质干细胞较骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞易取材、更为原始,并不受伦理、法律的限制,是中枢神经系统损伤修复最具治疗潜力的细胞来源之一。 目的：探讨重组人碱性成纤维生长因子、重组人表皮生长因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的潜能。 方法：采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂,体外诱导人脐带间充质干细胞;在倒置显微镜下动态观察细胞形态学变化,并用免疫荧光法检测人脐带间充质干细胞向神经干细胞分化的情况,实时荧光定量PCR技术检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白在mRNA水平的相对表达量。 结果与结论：形态学观察经诱导后的人脐带间充质干细胞呈神经干细胞球改变;免疫荧光法及实时荧光定量PCR技术均可检测到神经干细胞标记物巢蛋白,并可进一步分化表达神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2以及神经胶质细胞蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白。碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化。