应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒x抗原结合蛋白1结合的肝细胞蛋白编码基因

目的:构建乙型肝炎病毒x抗原结合蛋白1(XBP1)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与XBP1相互作用的基因。方法:通过PCR扩增获得XBP1基因,构建真核表达载体pGBKT7-XBP1,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-β-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆。提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-XBP1共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-β-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆。挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析。结果:筛选出20种与XBP1相互作用的蛋白,其中包括金属硫蛋白,平滑肌细胞相关蛋白,去唾液酸糖蛋白受体,丙酮酸脱氢酶激酶1,甜菜碱甲基转移酶,视黄醇结合蛋白,补体因子B、人补体C9,转化生长因子β1,丝氨酸蛋白酶抑制剂;cAMP应答元件结合蛋白,拓扑异构酶IIβ等已知功能基因及1个未知功能序列。结论:筛选到多种XBP1相互作用的基因,包括与细胞内结构、细胞生长相关蛋白基因,参与细胞内代谢的蛋白基因,参与信号转导途径、免疫及其他相关蛋白基因,参与DNA的复制、转录、重组、修复的基因。     

酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中与鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用的宿主因子,为进一步研究巨细胞病毒的致病机制奠定实验基础.方法将诱饵质粒pGBKT7-M122转化酵母菌AH109,Western blot检测诱饵蛋白在酵母细胞中的表达.阳性重组AH109菌株与小鼠脑cDNA文库进行配合,在色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤缺陷培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有Ⅹ-α-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上进行筛选,提取阳性酵母菌质粒,转化大肠杆菌后提取质粒测序,对测序结果进行序列比对和分析.将阳性文库质粒与诱饵质粒共同转化酵母AH109感受态细胞,重新验证其在酵母中的相互作用,同时阳性文库质粒与空载体pGBKT7亦被用同样的方法转入AH109感受态细胞,以排除阳性文库质粒的自激活作用.结果筛选出与M122蛋白相互作用的21种已知基因编码的蛋白质和3种未知基因编码的蛋白,其中21种已知蛋白分别为:突触融合蛋白8(syntaxin 8,Stx8)、磷酸葡萄糖变位酶2(phosphoglucomutase 2,Pgm2)、Shaker型电压依赖性钾通道的β1亚单位(potassium voltage-gated channel,shaker-related subfamily,beta member 1,Kcnab1)、19型胶原蛋白(collagen,type ⅪⅩ,alpha 1,Col19a1)、古蛋白1(archain 1,Arcn1)、胞嘧啶核苷酸激酶(cytidylate kinase,Cmpk)、热休克蛋白DnaJ同系物A亚家族成员1[DnaJ(Hsp40)homolog,subfamily A,member 1,Dnaja1]、Na+、K+ATP转运酶β3亚单位(ATPase,Na+/K+ transporting,beta 3 polypeptide,Atp1b3)、SH3结构域GRB2样相互作用蛋白1[SH3-domain GRB2-like(endophilin)interacting protein 1,Sgip1]、锚蛋白重复域17(ankyrin repeat domain 17,Ankrd17)、无义介导的mRNA 降解因子Smg-7同系物(Smg-7 homolog,nonsense mediated mRNA decay factor,Smg7)、精子相关抗原9(sperm associated antigen 9,Spag9)、FK506结合蛋白1A(FK506 binding protein 1a,Fkbp1a)、MYST组蛋白乙酰转移酶4[MYST histone acetyltransferase(monocytic leukemia)4,Myst4]、透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1,Hapln1)、自噬相关蛋白3(autophagy-related 3,Atg3)、精氨酸/色氨酸富集的剪切因子5(splicing factor,arginine/serine-rich 5,Sfrs5)、C3HC型锌指蛋白(zinc finger,C3HC-type containing 1,Zc3hc1)、硫氧还蛋白相关的跨膜蛋白1(thioredoxin-related transmembrane protein 1,Txndc1)、接头蛋白复合物AP-1亚单位(adaptor protein complex AP-1,gamma 1 subunit,Aplg1)和Cul1蛋白(cullin 1,Cul1).回返验证实验进一步证实这些蛋白与M122蛋白能够在酵母细胞AH109发生相互作用,但Aplg1和Cul1被证实具有自激活作用.结论 筛选到的其中19种已知基因编码的蛋白可能与巨细胞病毒的致病机制相关,但仍需进一步的验证.     

用酵母双杂交系统筛选抗人p53单链抗体

目的采用重叠PCR技术,构建小鼠抗人p53基因的全套单链抗体(sc Fv)文库,利用酵母双杂交系统筛选抗人p53sc Fv。方法构建表达p53诱饵载体p GBKT7-p53,提取P53蛋白免疫的小鼠脾脏组织总RNA,反转录PCR和重叠PCR方法构建VH-linker-VL型sc Fv基因库。将其与载体p GADT7连接,产物转化至含诱饵载体的AH109酵母菌中,于营养缺陷型平板中筛选阳性克隆。采用免疫细胞化学染色方法验证sc Fv与人P53蛋白的亲和力。结果成功构建诱饵质粒p GBKT7-p53并转入酵母AH109细胞,其在酵母细胞中无自激活能力,对宿主菌亦无毒性;成功获取VH-linker-VL型的抗体文库并构建捕获载体,利用酵母双杂交系统成功筛选到抗人P53 sc Fv片段;sc Fv1、sc Fv2和sc Fv3与人P53蛋白间均具有一定亲和力,可用以检测细胞、组织中的P53蛋白。结论利用酵母双杂交系统,获得具有良好的亲和力抗人P53 sc Fv,为筛选sc Fv提供新思路。     

应用酵母双杂交系统筛选Foxp3△2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交系统从人外周血白细胞cD-NA文库中筛选与转录因子Foxp3相互作用的蛋白,为进一步研究Foxp3的转录调控机制奠定基础。方法:首先构建pG-BKT7-Foxp3△2酵母双杂交诱饵载体,转化AH109酵母细胞,检测其毒性及自激活作用;然后将诱饵质粒与人外周血白细胞cDNA文库共转AH109酵母细胞,筛选了与Foxp3△2存在相互作用的蛋白。结果:成功构建了pGBKT7-Foxp3△2酵母表达载体,经转染AH109酵母细胞,无有毒性,无自激活作用。获得了40个阳性克隆,经生物信息学分析,其中9个具有开放读框。结论:应用酵母双杂交技术筛选出一组可与Foxp3△2相互作用的候选蛋白,为进一步研究Foxp3△2功能奠定了基础。     

应用酵母双杂交技术筛选干扰素β结合蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术筛选干扰素β（IFNp）结合蛋白。方法 用多聚酶链反应（PCR）技术扩增IFNB基因，连接酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109，与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基（SD／-Trp-Leu-His-Ade）和X-α-半乳糖（X-α-gal列）上进行双重筛选阳性克隆，提取酵母质粒后转化大肠埃希菌（DH5α）并经氨苄西林抗性筛选，提取单克隆菌落质粒，进行酶切鉴定及序列测定，并进行生物信息学分析。结果 应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆29个，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到19个克隆基因，编码14种已知蛋白和一种未知功能蛋白。初步发现铁蛋白与IFNB具有结合作用。结论 应用酵母双杂交技术筛选出多种与IFNB具有结合作用的蛋白。     

人肝再生增强因子cDNA的克隆及其酵母双杂交载体的构建

目的：获取人肝再生增强因子（hALR)阅读框的cDNA及构建其酵母双杂交系统的“诱饵”质粒。方法：利用RT－PCR方法，从人胎肝组织中扩增出一约380bp的DNA片段，重组入pGBKT7载体中，构建成pGBKT7-hALR，然后研究此重组质粒在酵母AH109中的表达情况并用于筛选人肝cDNA文库，结果：获得的378bp的DNA序列与文献报道的人ALR序列一致；转化的酵母细菌在选择性培养基SD／-Trp上培养65小时，长出约Φ1mm大小的白色菌落，而在SD／－Trp/-His上不生长；酵母提取液的Western blot分析，证实ALR基因在AH109以融合蛋白的形式表达，并具有免疫活性；初步得到hALR相互作用的阳性克隆。结论：pGBKT7-hALR对宿主菌AH109没有毒性作用，也没有自身激活报告基因，可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”质粒。     

酵母双杂交技术筛选乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白的研究

目的　筛选与乙型肝炎病毒 (HBV)DNA聚合酶-N末端蛋白 (TP)相互结合的肝细胞蛋白 ,进一步探讨TP的生物学功能。方法　用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增TP片段 ,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH 10 9并在其内表达 ,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合 ,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖苷酶 (X-α-gel)上进行双重筛选阳性菌落 ,DNA序列测定并进行生物信息学分析。结果　成功获得了 4 7个与TP特异性结合的阳性克隆 ,包括人类固醇调节元件结合蛋白 1(SREBP1)、RNA聚合酶Ⅱ亚单位 (hsRPB7)、血浆铜蓝蛋白(CP)等 2 1种已知功能蛋白质基因和 19个假设蛋白基因。结论　HBVDNA聚合酶-TP可以与某些已知和未知功能蛋白相互结合 ,提示其具有较广泛的生物学功能     

应用酵母双杂交系统筛选E2F1相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交系统从人正常胃黏膜细胞的cDNA文库中筛选E2F1转录因子的相互作用蛋白。方法:以pGBKT7-E2F1为诱饵质粒筛选人正常胃黏膜细胞的cDNA文库,得到阳性克隆,反复验证,并对验证后的阳性克隆进行测序及同源性分析。结果:从人正常胃黏膜细胞的cDNA文库中筛选得到20个阳性克隆,经测序和同源性分析,筛除假阳性克隆,最终得到18个不同的候选基因序列。其中,17个为可知基因序列,它们分别是:组织蛋白酶B、SIVA1、干扰素调节因子7、鸟苷酸激酶1、ATP酶抑制因子1、核糖体蛋白SA、纤溶酶原激活物抑制剂1 mRNA结合蛋白、精氨琥珀酸合酶1、卵泡抑素类似物3、金属硫蛋白2A、内质网钙结合蛋白1、WNT1可诱导信号通路蛋白2、CDC42 效应蛋白1、可溶性半乳糖凝集素结合蛋白1、中胚层发育候选2、外切酶体成分7和含EGF腓骨蛋白样胞外基质蛋白 1,尚有一未知基因片段。结论:应用酵母双杂交系统成功筛选出18种E2F1相互作用蛋白,为进一步探讨E2F1影响胃癌细胞生物学行为的分子机制奠定了基础。     

酵母双杂交筛选与转录因子ZNF580相互作用的蛋白

目的: 寻找可能与锌指转录因子ZNF580存在相互作用的蛋白。方法: 以ZNF580基因开放阅读框作为模版,PCR扩增后连接入酵母表达质粒pGB。诱饵质粒pGB-ZNF580经测序验证后转化酵母菌株Y190,人胎脑cDNA文库亦转化到能稳定表达诱饵蛋白的Y190酵母菌株中,并铺到含有营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-His/-Leu)的培养皿上进行初步筛选。所得阳性克隆再进行β-半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验进一步去除假阳性。随机挑取部分阳性克隆,逐一转化入含有诱饵质粒的Y190 酵母菌进行一对一验证。分离阳性克隆质粒测序,并应用生物信息学方法分析阳性克隆cDNA编码的蛋白。结果: 确定了14种与ZNF580可能存在相互作用的蛋白。结论: 初步探讨了ZNF580的功能及其可能参与的信号转导通路,为进一步研究转录因子ZNF580参与动脉粥样硬化的机制奠定了实验基础。     

酵母双杂交技术筛选人白细胞cDNA文库中HCV NS4A结合蛋白及CAML基因的克隆

目的应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)相互作用的蛋白。方法连接有HCV NS4A酵母表达的载体pGBKT7-NS4A,转化入单倍体酵母细胞AH109,与转化了人白细胞cDNA文库质粒的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-a-半乳糖(X-a-Gal)上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠埃希细菌(DH5α),提取质粒并测序,进行生物信息学分析。对克隆重复率较高的蛋白编码基因进行克隆和回交验证。结果筛选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-a-gal的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落45个,其中钙离子信号调节亲环素配体(CAML)29个。对CAML基因成功克隆,回交验证了HCV NS4A与CAML的相互作用。结论成功筛选出7种在人白细胞cDNA文库中与HCV NS4A特异性相互作用的蛋白,为进一步探讨HCV的致病机制提供了新的线索。     

应用酵母双杂交系统发现hALR与Na,K-ATPase间的相互作用

目的:采用酵母双杂交系统寻找与人肝再生增强因子(hALR)相互作用的蛋白质, 探讨ALR的作用机理。方法: 构建hALR诱饵质粒pGBKT7-hALR, 醋酸锂法转化AH109酵母菌, 转化菌在SD/-Trp-His培养基上培养及滤纸法β一半乳糖苷酶活性检测排除自身激活作用后, 与人肝cDNA文库质粒预转化的酵母菌Y187进行接合试验, 接合产物在QDO培养基上筛选, 阳性克隆进一步在含X-α-Gal的QDO平板上鉴定, X-α-Gal活性呈阳性的克隆, 进行PCR及酶切鉴定排除完全相同克隆, 进一步进行回交试验排除假阳性, 对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:得到数个阳性克隆, 序列分析结果表明其中1个阳性克隆是Na⁺, K⁺-ATPaseβ亚基部分基因, 长669bp, 3'端非编码区224bp, 编码区长445bp, 编码Na⁺, K⁺-ATPaseβ亚基C端的147个氨基酸残基。结论:应用酵母双杂交系统筛选出Na⁺, K⁺-ATPase与hALR具有相互作用。     

应用酵母双杂交技术筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白

目的: 应用酵母双杂交技术筛选小鼠巨噬细胞中与核因子κB受体激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白,以探寻RANKL/RANK系统中介导破骨细胞形成的RANK下游新信号转导蛋白。方法: 应用GAL4酵母双杂交系统3,构建仅包含编码新基序⁵³⁵IVVY⁵³⁸ 的一小段RANK的cDNA片段为诱饵质粒pGBKT7-IVVY,并与巨噬细胞cDNA文库质粒pGADT7-library共转化AH109酵母,筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白,通过回复性杂交实验验证其可靠性,并对阳性克隆进行测序和基因同源性分析。结果: 筛选出4个可能与IVVY基序有相互作用的蛋白,包括Ring1和YY1结合蛋白(RYBP)、ATP结合盒、E2F转录因子和热休克蛋白8,其中表达RYBP的阳性克隆出现频率高、速度快。结论: 应用酵母双杂交技术成功地筛选出4个可能与IVVY基序相互作用的候选蛋白,其中RYBP可能性最大。     

Identification of Proteins That Interact with Podocin Using the Yeast 2-Hybrid System

Purpose

As a membrane protein at the insertion site of the slit diaphragm (SD) complex in podocyte foot processes, podocin has been reported to act as a scaffolding protein required to maintain or regulate the structural integrity of the SD. In order to identify proteins that associate or interact with podocin, we screened a mouse kidney complementary DNA (cDNA) library using a yeast 2-hybrid system.

Materials and Methods

1) The full-length cDNA of podocin from the mouse kidney was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR), 2) The PCR product was cloned into a pGBKT7 vector, pGBKT7-podocin, 3) After the pGBKT7-podocin was transformed into AH109, the AH109/pGBKT7-podocin product was obtained, 4) The mouse kidney cDNA library was transformed into the AH109/pGBKT7-podocin and screened by selection steps, 5) Next, twelve clones were cultured and isolated, 6) The yeast-purified plasmids were transformed into Escherichia coli (E. coli) by heat shock, and 7) To identify the activation domain (AD)/library inserts, we digested them with Him III, and the fragments were then sequenced.

Results

12 positive clones that interacted with podocin were obtained by screening a mouse kidney cDNA library using pGBKT7-podocin. Among them, only 4 clones were found to function at the podocyte where podocin is present.

Conclusion

Additional studies are needed to clarify the role and interaction with podocin and candidates.     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白基因的筛选

目的筛选并克隆人肝细胞中与乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)相互作用的蛋白质基因。方法将重组诱饵质粒pGBKT7eAg转化酵母细胞AH109后与预转了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,提取质粒后转化大肠埃希菌并进行序列测定,进行生物信息学分析。结果配合后筛选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xα半乳糖(Xαgal)的4缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落245株。完成了101株克隆的测定,经过序列分析排除了重复同源序列后,最终确定其中有41株不同的基因,其中人类同源基因35条,其余6株为未知基因。结论成功克隆出肝细胞中的HBeAg结合蛋白基因,为进一步研究HBeAg的功能提供了新线索。     

核因子-κB p50亚基同源结构域的克隆鉴定及自主报告基因活性的检测

目的：获得NF-κB p50亚基同源结构域(RHD)cDNA及构建酵母双杂交系统的“饵”载体,并检测靶基因的酵母细胞毒性及自主报告基因的活性。方法：提取人外周血单个核细胞(PBMC)的总RNA,以RT—PCR扩增NF—κB p50亚基RHD基因片段,重组入酵母双杂交载体pGBKT7中。应用乙酸锂法,将重组质粒转化酵母细胞AH109,在SD／-Trp选择培养基上培养,观察转化株的生长情况;用滤膜影印法验证靶基因有无自主报告基因的活性。结果：经酶切及PCR鉴定,重组质粒中插入片段的大小与预期的结果相符。测序结果表明,其基因序列正确,无读码框移位,命名为pGBKT7-p50。转化酵母细胞后,对酵母细胞无毒性也无自主报告基因的活性：结论：pGBKT7-p50可作为酵母双杂交系统中的“饵”载体,用于后续的肽库筛选,捕捉与靶基因相互作用的多肽。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1“饵”载体的构建及在酵母中的表达

目的 构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1（ HBEBP1）真核表达载体,并在酵母细胞中进行表达.方法 以HepG2细胞来源的eDNA为模板,PCR扩增获得HBEBP1基因,克隆至pGEM-T载体.测序正确后双酶切pGEM-T-HBEBP1,回收目的片段并连接至酵母表达载体pGBKT7中,转化酵母菌AH109,在色氨酸缺陷型培养基（SD/-Trp/卡那霉素）上筛选阳性菌落后大量表达并提取重组蛋白,再进行SDS-PAGE和Western Blot分析.结果 成功构建酵母表达载体pGBKT7-HBEBP1,Western Blot结果显示重组蛋白表达产物存在于胞内,条带清晰、大小正确,相对分子质量约33 × 103.结论 利用真核表达载体在酵母细胞中成功表达HBEBP1蛋白,为研究HBEBP1蛋白的生物学功能奠定了基础.     

乙型肝炎病毒e抗原基因作为酵母双杂交体系结合域载体的构建及表达

目的　以乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)全基因为外源片段 ,构建酵母双杂交体系中结合域载体 ,研究其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用及毒性作用 ,验证其适用性。方法　根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物 ,取患者血清 ,通过PCR方法分离HBeAg全基因片段 ,克隆入T载体 ,酶切鉴定及序列测定后 ,克隆入酵母双杂交体系结合域载体pGBKT7,构建pGBKT7 eAg载体。再次酶切鉴定阳性克隆后转入酵母 ,验证毒性作用 ;通过Western blot实验证实外源基因在酵母中的表达 ;并进一步验证自身激活作用。结果　由血清中分离的及 2次酶切鉴定的片段大小分别为 6 5 7bp和 6 39bp ,与预期大小一致 ;序列测定与报道的HBV分离株核酸及氨基酸同源性分别为96 %和 10 0 % ;转人酵母后无毒性及自身激活作用 ;Western blot实验出现阳性与预期大小 (2 4 .3× 10 3)一致的条带。结论　pGBKT7 eAg载体在酵母细胞中表达出融合蛋白 ,进一步验证无自身激活及毒性作用 ,此载体构建成功 ,适用于酵母双杂交体系。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HCVNS4B基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和Xα半乳糖(Xαgal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌,接种在氨苄西林LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析。结果成功克隆出HCVNS4B基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xαgal的4缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落5个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞代谢、生物氧化、生长调节等多种生物学过程。结论成功克隆出HCVNS4B蛋白与肝细胞相互作用蛋白,为进一步研究NS4B蛋白的功能,阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索。