重组人促红细胞生成素对小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响

目的初步观察外源性细胞因子重组人促红细胞生成素（NEPO）对小鼠胚胎干细胞（ESC）向心肌细胞分化的影响。方法将NEPO加到细胞培养基中配成终浓度分别为0．5、1．O、5．0U／ml的诱导分化液，分别在分化第8、12天观察ESC自发及在rhEPO诱导情况下心肌细胞分化率；在分化第7天应用RT-PCR检测自发分化组及NEPO诱导组心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2．5mRNA的相对表达。结果在分化第8、12天rhEPO诱导（1．0U/ml）心肌细胞分化率分别显著高于对应分化天数的自发心肌细胞分化率（0．11±0．02对0．05±0．01，P〈0．05；0．86±0．02对0．65±0．05，P〈0．05）；与自发分化组比较．NEPO干预（1．0U／ml）上调GATA-4、Nkx2．5mRNA的相对表达。结论外源性rhEPO早期干预能够促进ESC向心肌细胞分化。     

促红细胞生成素体外诱导神经干细胞的分化

背景：近年来,神经干细胞被认为是治疗脊髓损伤的理想移植细胞,但其在宿主体内自然分化为神经元的比例较低,严重制约了其修复脊髓损伤的效果。 目的：分析促红细胞生成素体外诱导神经干细胞分化的作用。 方法：从新生 Wistar 大鼠海马组织中无菌条件下分离神经干细胞,进行体外分离、培养及免疫荧光鉴定。然后取第3代的神经干细胞,随机分为0.5,5,50 U/mL促红细胞生成素组和对照组,分别加入0.5,5,50,0 U/mL促红细胞生成素。 结果与结论：0.5,5,50 U/mL促红细胞生成素组神经元的转化率较对照组明显提高(P < 0.05),5,50 U/mL促红细胞生成素组神经元的转化率高于0.5 U/mL促红细胞生成素组(P < 0.05),但5,50 U/mL促红细胞生成素组中神经元数量接近(P > 0.05)。说明促红细胞生成素在体外能够有效地诱导神经干细胞向神经元的分化,并可明显提高其向神经元的转化率。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

促红细胞生成素体外培养鼠胚脑皮质神经干细胞的分化

背景：促红细胞生成素最早作为生长因子被认识,近些年来其对中枢神经系统保护作用的体内研究较多。 目的：观察促红细胞生成素对体外培养大鼠胚脑皮质神经干细胞凋亡及分化的影响。 方法：无菌条件下取孕14 d SD大鼠胚脑皮质,体外先悬浮增殖培养后贴壁诱导分化。巢蛋白免疫细胞荧光染色检测神经干细胞,以微管相关蛋白2、神经胶质原纤维酸性蛋白检测神经干细胞分化。取第3代神经干细胞向培养基中添加0.5,5,50,500 U/mL的促红细胞生成素,另设不添加促红细胞生成素的对照组。应用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3检测神经干细胞凋亡,微管相关蛋白2检测神经干细胞向神经元方向的分化。 结果与结论：加入≥5 U/mL促红细胞生成素,神经球内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达显著下降(P < 0.01),分化培养后微管相关蛋白2阳性细胞较对照组明显升高(P < 0.01)。提示促红细胞生成素可降低体外培养鼠胚脑皮质神经干细胞的凋亡率,促进其神经干细胞向神经元方向分化。     

体外电刺激对维生素C诱导的多能干细胞向心肌细胞分化的影响

目的 探讨电刺激在体外对诱导性多能干细胞(iPSCs)向心肌细胞分化的作用.方法 复苏小鼠来源的iPSCs,悬滴培养法形成拟胚体,维生素C诱导其分化,诱导过程按是否给予电刺激分为电刺激组与非电刺激组.观察各组细胞生长情况,记录各组拟胚体出现跳动的时间和跳动拟胚体的数量,计算心肌细胞分化率.共聚焦显微镜成像结合免疫荧光细胞化学检测心肌特异性肌钙蛋白T(c-TnT)的表达.RT-PCR检测干细胞多能性标志因子Oct-4、心肌早期特异性转录因子GATA-4和心肌特异性肌球蛋白0重链(α-MHC)的基因表达.结果 电刺激组拟胚体较非电刺激组分化更快,更早出现搏动,心肌细胞分化率更高[(68.89 +5.09)％ vs(52.22±3.85)％,P＜0.05].两组搏动区域细胞均表达c-TnT,电刺激组细胞c-TnT表达更明显.在诱导过程中,Oct-4表达水平随诱导时间延长逐渐减少,电刺激组较非电刺激组递减更快(P＜0.05).两组均检测到心肌特异性标记分子GATA-4和α-MHC的表达.在诱导分化相同时间点,电刺激组GATA-4和α-MHC表达水平高于非电刺激组(P＜0.05).结论 模拟心脏电学微环境的电刺激有助于维生素C诱导的iPSCs在体外向具有心肌细胞表型特征的细胞分化.     

阿尔茨海默病患者尿液细胞向诱导多能干细胞及神经细胞的诱导转化

目的:获得阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)患者来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)。方法:选取3例临床诊断明确的AD病例,收集病人尿液,分离出尿路上皮细胞,对所得细胞进行原代培养。利用电转染的方法将带有Oct4、Sox2、Klf4和SV40LT的质粒导入原代细胞内,将其重编程为i PS细胞。随后利用双向抑制Smad通路的方式继续诱导其神经分化。结果:AD病人尿液来源的细胞(以下称为尿液细胞)均成功诱导成i PS细胞,其诱导效率与正常人来源的细胞无明显差异。且病人的i PS细胞可成功分化为神经细胞,分化效率亦与正常人来源细胞相近。结论:阿尔茨海默症患者来源的尿液细胞可重编程为i PS细胞,所得到的i PS细胞可成功分化成有功能的神经元以及神经胶质细胞。     

红细胞生成素激活的星形胶质细胞条件培养液对神经干细胞促分化作用及对分化后细胞的保护作用

目的 观察红细胞生成素激活的星形胶质细胞条件培养液（EACM）对神经干细胞促分化作用及对分化后细胞的保护作用。 方法 原代培养神经干细胞和1型星形胶质细胞,收集红细胞生成素(EPO)刺激的星形胶质细胞上清液,用于神经干细胞分化实验的研究。对分化后的细胞进行免疫细胞化学染色,计算其分化为神经元的比率;同时利用FeSO₄和H₂O₂制造细胞损伤模型,用EACM继续培养48h,然后检测细胞活性和存活细胞数。 结果 EACM组神经干细胞分化明显,神经元比率较星形胶质细胞上清组和对照组均有明显增加。分化后的细胞中加入H₂O₂后,继续用EACM培养的实验组吸光度(A)值和细胞存活百分比均较对照组高。 结论 红细胞生成素激活的星形胶质细胞条件培养液对神经干细胞有促其向神经元分化的作用,并对分化后的细胞有保护作用。     

小鼠来源诱导多能干细胞定向分化为神经元的体外实验研究*

 目的： 探讨源于小鼠的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）体外定向分化为神经元的方法,为大量稳定地获得神经元及提供种子细胞治疗脊髓损伤奠定体外实验基础。方法: 源于小鼠的iPSCs在不同的诱导培养基中经悬浮、贴壁、再悬浮和再贴壁培养。免疫荧光检测iPSCs多能性标志物、神经干细胞及其分化细胞标志物的表达。RT-PCR检测神经元及胶质细胞基因表达并行神经元基因测序鉴定,流式细胞术检测iPSCs定向分化为神经干细胞及进一步分化为神经元的比例。结果: 源于小鼠的iPSCs表达干细胞多能性标志物Sox2、Oct4和SSEA1。悬浮培养可以形成类球形拟胚体;经诱导及机械分离后的细胞可形成神经球,神经球经诱导后可分化为神经元。免疫荧光显示iPSCs可诱导出表达nestin的神经球,贴壁培养的神经球可分化为分别表达微管相关蛋白2（MAP-2）、胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）及髓磷脂碱性蛋白(MBP)的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。RT-PCR及基因鉴定结果显示形成小鼠神经元;流式细胞术检测结果显示分化细胞中神经干细胞和神经元的比例分别为63.93%±1.47%和21.40%±1.70%。结论: 源于小鼠的诱导多能干细胞能够稳定地在体外定向分化为神经元,为脊髓损伤的治疗提供了一个可靠的细胞来源。     

促红细胞生成素的神经保护作用

促红细胞生成素 (EPO)是一个调节血细胞生成的细胞因子 ,近来发现EPO在大脑中广泛存在 ,具有神经保护作用 ,其保护机制为抗神经细胞凋亡、抗氧化、抗炎症和维持脑血管结构和功能正常。EPO神经保护作用具有时间、剂量依赖性。     

人诱导性多能干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 观察人诱导性多能干细胞（iPS细胞）定向分化为神经干细胞（NSCs）的潜能。方法 用维甲酸（RA）诱导人iPS细胞向NSCs分化。倒置显微镜下观察iPS细胞的形态变化,RT-PCR检测NANOG, OCT4, SOX2的表达;免疫组织化学方法检测NESTIN、SOX2、β-TUBULIN Ш和GFAP的表达。结果RA诱导后第4天,贴壁的拟胚体出现了早期神经祖细胞特有的神经管样结构并不断增多,细胞表达神经巢蛋白NESTIN,而对照组未观察到神经管样结构。神经管样结构内的细胞能分化为β-TUBULIN Ш阳性的神经元,但GFAP阳性的星形胶质细胞少见。结论 人iPS细胞具有定向分化为NSCs的潜能,并能模拟神经发育过程。     

无血清单层细胞诱导法培养猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞

背景:诱导多能性干细胞是一种新型的干细胞来源,具有多向分化潜能。猪作为人类心血管及代谢性疾病研究的良好模型,对其多能性细胞向血管内皮细胞定向分化体系的建立,将为创建心血管疾病模型提供保障。目的:建立一种无血清单层诱导分化方法,使猪诱导多能性干细胞定向分化为CD31阳性血管内皮细胞,并对获得的内皮细胞进行鉴定。方法:使用CHIR99021、骨形态发生蛋白4、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子等对猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞进行单层细胞诱导分化,使干细胞经历3个分化阶段最终成为血管内皮细胞,检测并比较分化过程中2种干细胞的胚层标记基因的表达,对流式分选后获得的血管内皮细胞进行鉴定。结果与结论:①通过无血清单层细胞诱导法从猪诱导多能性干细胞定向诱导分化获得的内皮细胞具有与猪永生化主动脉血管内皮细胞类似的基因表达模式及生物学功能——能够吸收低密度脂蛋白并在Matrigel上形成微血管样结构;②该诱导体系下,猪诱导多能性干细胞的分化效率高于人胚胎干细胞的分化效率,这可能与诱导过程中2种细胞谱系基因表达模式上的差异相关。     

小鼠诱导型多潜能干细胞定向分化为功能性肝细胞

目的:探讨在体外诱导型多潜能干细胞(IPS)能否遵循正常肝脏发育途径定向分化为具备良好生理功能的肝细胞。方法:根据正常肝脏体内发育的规律,序贯应用肝脏发育所需的生长因子,设计特色培养基,诱导IPS细胞遵循正常发育途径定向高效分化为肝细胞:首先将IPS细胞定向分化为前层确定性内胚层细胞(ADE),再进一步分化为肝细胞。结果:在本研究中IPS细胞在体外可循正常发育通路定向诱导为肝细胞:先分化为前层内胚层细胞,再继续分化为肝细胞。分化的各时段实时定量RT-PCR检测显示:在mRNA表达的水平,IPS细胞经历了肝细胞在体内从胚胎干细胞的发育过程,内胚层细胞特异性RNA如CXCR4、Sox17和FOXA2在分化的早期明显升高,而早期肝细胞特异性RNA如HNF4和AFP在分化的中期开始升高,肝细胞成熟特异性RNA如白蛋白在分化的晚期才达高峰,同时IPS细胞的未分化标记RNA如OCT4在早期就明显下调。同mRNA表达一致,在分化的第20d,大部分的肝脏细胞表达甲胎蛋白和白蛋白(阳性率80%)。更为重要的是IPS来源肝细胞在体外具有典型成熟肝细胞的功能,能够摄取和释放靛青绿(ICG)并具有药物代谢酶细胞色素P450酶的活性。结论:IPS细胞在体外能够遵循正常肝脏发育通路,序贯表达肝脏发育各阶段的特色基因和蛋白,能够高效分化为有功能的肝细胞,本研究可能为临床终末期肝病进行细胞治疗提供肝细胞。     

诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立

背景：目前,大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立,但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。 目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。 方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞,获得了诱导多能性干细胞;在诱导分化体系中添加了Y-27632,克服干细胞扩增中的凋亡现象;运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。 结果与结论：①前3代细胞克隆传代时,诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多,很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断ROCK活化的抑制剂,能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在OP9细胞条件培养液作用下,经过体外诱导分化,形成CD34+造血祖细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

质粒重编程诱导多潜能干细胞及定向分化神经干细胞

目的 　探讨游离质粒载体重编程诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)为非整合型诱导多潜能干细胞,并在体外定向分化为神经干细胞(neural stem cells, NSCs), 为神经干细胞移植治疗神经损伤提供稳定、安全的细胞来源。 方法　使用电转仪将质粒pEP4-EO2S-ET2K转入小鼠MEFs, 经诱导培养重编程为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs), iPSCs在不同诱导培养基中经2次悬浮及贴壁培养分化为NSCs,在体内及体外实验鉴定iPSCs多向分化潜能特性及NSCs特性。 结果　体内外实验显示iPSCs具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)相似的多向分化潜能, 且不整合外源性基因。iPSCs进一步分化的NSCs其相关标志基因表达与野生型NSCs相近,且较iPSCs显著增加,免疫荧光显示NSCs高表达NSC标志物 NESTIN及PAX6,在体外存活能分化为神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞。 结论　游离质粒能重编程诱导非整合型iPSCs, 并定向分化为神经干细胞及神经元, 是神经损伤修复的理想种子细胞。     

miR-375对人类诱导多能干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响

目的:探讨微小RNA-375(miR-375)在调控人类诱导多能干细胞(hiPSCs)分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)过程中的作用及可能机制。方法:构建miR-375过表达的慢病毒载体,转染hiPSCs获得miR-375稳定表达的miR-375-hiPSCs,体外诱导其定向分化为IPCs,采用real-time PCR、流式细胞术及ELISA等方法对其标志性基因、分化效率、胰岛素和C肽释放量等进行检测;生物信息学结合萤光素酶报告基因实验预测并验证miR-375的靶基因,real-time PCR及Western blot检测靶基因的表达。结果:过表达miR-375可上调胰岛β细胞标志性转录因子HNF4α、MafA、Pdx1、Pax6、Nkx6.1、glucokinase和insulin的表达,分化效率由对照组的22.3%提高至38.6%;高糖刺激后胰岛素释放量由成年胰岛细胞分泌量的1/8提高到1/5;过表达miR-375可影响靶基因REST和WNT5A的蛋白翻译水平。结论:miR-375可通过干扰靶基因REST和WNT5A的翻译水平,开启胰岛素分泌相关特异性基因的表达,从而促进hiPS...     

小鼠诱导性多能干细胞的神经细胞分化与突触连接的建立及其功能分析

目的探讨小鼠诱导性多能干细胞(i PSCs)在体外某些因素的诱导下能否分化成功能性的神经细胞,以及神经细胞之间突触的发生与建立。方法首先将i PSCs悬浮培养形成拟胚体,利用维甲酸(RA)将其诱导分化成神经前体细胞,最后撤去RA贴壁培养,利用免疫荧光染色技术观察小鼠i PSCs在体外分化成神经细胞以及神经细胞之间突触发生的形态特征,利用FM1-43染色技术分析突触末端的功能活性。结果小鼠i PSCs能够在RA的诱导下向神经细胞分化,这些神经细胞可以被成熟神经元与胶质细胞标记物标记,新分化的神经元还可以观察到树突棘及突触连接的形成,在去极化刺激下突触活动增强,表现为轴突末端大量FM1-43阳性内吞颗粒。结论由小鼠i PSCs分化而来的神经细胞在体外形成突触连接的过程,提示其可以进一步分化为功能性的神经元和神经胶质细胞。     

PcG蛋白EZH2在全反式维甲酸诱导的小鼠iPS细胞系分化过程中的作用

目的探讨组蛋白甲基转移酶EZH2在小鼠iPS细胞系IP14D-1向生殖细胞分化过程中的作用。方法将小鼠iPS细胞系IP14D-1通过悬浮培养分化形成拟胚体(iEBs)作为向生殖细胞分化的启动步骤,1μmol/L全反式维甲酸(atRA)持续诱导iEBs 2、4和7 d,采用实时RT-PCR、荧光定量RT-PCR、免疫荧光检测atRA处理前后EZH2和生殖细胞分化标志性基因Stra8在iEBs中的表达。结果在atRA诱导IP14D-1来源的iEBs中,EZH2表达在诱导后2 d达到高峰,伴随atRA诱导,EZH2表达减弱;而生殖细胞分化标志性基因Stra8其变化特点与EZH2相反,无atRA诱导时EBs表达Stra8较弱,伴随atRA诱导,Stra8表达增强。EZH2和Stra8阳性信号分别定位于胞膜和胞质,其变化特点与PT-PCP结果相一致。结论 atRA诱导使EZH2低水平表达时期提前出现,伴随Stra8增强表达,启动了小鼠iPS细胞向生殖细胞的分化进程。     

从多潜能干细胞诱导成神经前体细胞及其分化探讨

目的探讨诱导多潜能干细胞在体外分化为神经前体细胞。方法采用N2B27作为选择培养基,多步法贴壁培养把诱导多潜能干细胞诱导为神经前体细胞。结果免疫荧光染色发现,该细胞神经干细胞的标记物巢蛋白阳性,有极个别的β-微管蛋白Ⅲ(β-Tub-Ⅲ)阳性细胞。在分化培养基内培养7d后,β-Tub-Ⅲ阳性细胞增多。结论本实验初步表明,诱导多潜能干细胞在体外可以被诱导为有一定神经特征的神经前体细胞,该细胞有望用于细胞移植治疗缺血性脑损伤。     

The immunogenicity of cells derived from induced pluripotent stem cells

With their ability to undergo unlimited self-renewal in culture and to differentiate into all cell types in the body, human embryonic stem ceils （hESCs） hold great potential for the treatment of currently incurable diseases. Two hESC-based cell therapies for spinal cord injury and macular degeneration have been advanced into human clinical trials. Despite this rapid progress, one key challenge of hESC-based cell therapy is the allogeneic immune rejection of hESC-derived cells by recipients. This problem could be mitigated by a recent breakthrough in the technology of induced pluripotent stem cells （iPSCs） by nuclear reprogramming of patient-specific somatic cells with defined factors, which could become a renewable source of autologous ceils for cell therapy. However, recent studies revealing the abnormal epigenetics, genomic stability and immunogenicity of iPSCs have raised safety concerns over iPSC-based therapy. Recent findings related to the immunogenicity of iPSC derivatives will be summarized in this review.