脑缺血及后适应对树鼩海马内质网应激信号分子PERK及GRP78的影响

目的:探讨脑缺血及后适应对树鼩海马内质网应激信号分子蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的影响及后适应的脑保护机制。方法:光化学反应诱导树鼩局部血栓性脑缺血,于脑缺血后3.5 h夹闭、打开缺血侧颈总动脉交替3个循环(每次5 min)以复制缺血后适应模型。HE染色观察缺血侧海马神经元损伤及超微结构变化,RT-PCR检测脑缺血及后适应不同时间海马组织PERK及GRP78 mRNA表达的变化,免疫组织化学法与Western blot法检测PERK及GRP78的蛋白定位及表达变化。结果:海马神经元随脑缺血时间延长而损伤加重,缺血24 h损伤最为严重,后适应可减轻损伤。脑缺血4 h、24 h及72 h PERK的mRNA及蛋白表达较假手术组增高(P0.05),后适应组与相应的缺血组相比,PERK的mRNA及蛋白表达减少,4 h、24 h差异显著(P0.05);脑缺血4 h、24 h及72 h GRP78的mRNA及蛋白表达与假手术组无明显差异,后适应24 h组较缺血24 h组表达增高(P0.05)。结论:树鼩局部血栓性脑缺血可激活缺血侧海马内质网应激反应,引起PERK/e IF2α信号转导通路中相关分子PERK的mRNA及蛋白表达增高。缺血后适应处理通过下调PERK、上调GRP78的表达,减轻内质网应激反应,减少神经元损伤,具有一定的脑保护作用。     

树鼩脑缺血后适应升高海马区rCBF及VEGF的变化

目 的：研究树鼩局部脑缺血海马rCBF与血管内皮生长因子（VEGF）间的关系，探讨缺血后适应（PC）对rCBF与VEGF表达的改变及其机制。方 法：建立树鼩血栓性局部脑缺血及缺血PC模型，通过激光多普勒血流计测量脑缺血后4、8、12、24及72h海马CA1区rCBF的改变；用免疫组化法测定脑缺血上述时间海马VEGF的表达，并用图像分析系统测定其平均灰度值。于脑缺血后4h重复3次夹闭缺血侧颈总动脉实施缺血PC，并观察其对海马CA1区rCBF及VEGF表达的影响。结 果：树鼩脑缺血后4h海马CA1区VEGF阳性细胞数增多，以12h表达最强（P＜0.01），72h表达最低（P＞0.05）。脑缺血时海马rCBF逐渐降低，以24h的改变最显著（为2.55±0.28PU，P＜0.01）；72h时海马rCBF略有增加，为9.84±1.22 PU。实施缺血PC后，海马CA1区rCBF逐渐增加，72h最显著（P＜0.01）与此同时VEGF的表达除8h（P＞0.05）外，其余各组均比血栓性缺血组增强（P＜0.01），以12h组最明显；电镜显示缺血24h血栓性缺血组的海马线粒体应激及内质网池形成最明显，给予PC后得以缓减。结 论：树鼩脑缺血时海马CA1区rCBF减少的程度与VEGF表达增加具有密切联系；缺血PC可延长治疗的时间窗；缺血12h内VEGF表达的明显增强可能与rCBF改善有关；PC对海马rCBF的影响可能是神经元保护的关键所在。     

缺血后适应对树鼩脑缺血信号转导及转录激活因子3过磷酸化的调控作用

目的观察信号转导及转录激活因子3(STAT3)磷酸化在树鼩脑缺血后适应(PC)神经保护中的作用,并探讨其可能机制。方法将50只健康成年树鼩随机分为对照组、脑缺血4 h组、脑缺血24 h组、后适应4 h组和后适应24 h组(每组n=5),其中10只动物做HE染色(n=5)及电子显微镜观察(n=5)。本实验通过光化学反应建立树鼩血栓性脑缺血模型;于缺血后4 h夹闭患侧颈总动脉3次(每次5 min)实施缺血PC。采用TTC染色观察树鼩脑梗死面积的变化,通过HE和电子显微镜观察脑皮质和海马组织学改变及其超微结构变化,应用Western blotting检测皮层总STAT3(t-STAT3)及磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表达变化。结果脑缺血后皮层血管内皮细胞肿胀,皮层及海马神经元损伤,线粒体肿胀、嵴溶解,以缺血24 h损伤最为明显,脑梗死面积达到(24.78±2.06)%。而皮层p-STAT3蛋白表达随缺血时间延长呈增高趋势,缺血4 h p-STAT3蛋白表达明显增高(0.24±0.1,P<0.01),缺血24 h p-STAT3蛋白表达则持续增高(0.32±0.1,P<0.01)。缺血PC处理后皮层血管内皮细胞水肿好转,皮层及海马神经元损伤减轻,脑梗死面积减小为(17.67±1.90)%(P<0.01)。与缺血组相比,缺血PC 4 h p-STAT3蛋白表达进一步升高(0.41±0.09,P<0.01),缺血PC 24 h p-STAT3蛋白表达增高更加显著(0.70±0.11,P<0.01)。结论树鼩脑缺血可导致STAT3磷酸化代偿性增强,缺血PC的脑保护作用可能与其促进STAT3过磷酸化有关。     

缺血后适应对树鼩海马CA1区神经元Akt信号转导调控的机制研究

目的: 了解缺血后适应(PC)对树鼩脑缺血时海马CA1区神经元磷脂酰肌醇-3激酶/Akt(PI-3K/Akt)下游底物丝/苏氨酸蛋白激酶(Akt Ser-473/Thr-308)磷酸化(Akt /Akt )的调控,探讨Akt信号转导通路在缺血PC脑保护中的作用机制。方法: 以树鼩为实验动物,用光化学诱导法复制局部脑缺血,并于脑缺血后3 h 30 min反复夹闭缺血侧颈总动脉3个循环(5 min 1个循环)以制备后适应模型。在光镜、电镜下观察海马CA1区神经元损伤及其超微结构变化的同时,采用免疫组化法了解脑缺血树鼩海马CA1区神经元Akt /Akt 的分布及定位,并以灰度值检测磷酸化强度。结果: 脑缺血可导致树鼩海马损伤及细胞超微结构的明显异常;而缺血PC可使海马CA1区神经元超微结构的异常明显改善。免疫组化结果显示,对照组海马CA1区Akt 及 Akt 的磷酸化为阴性。缺血PC组与缺血组在不同时点的胞浆、胞膜均出现Akt ,但缺血72h Akt 减弱(灰度值146.6±2.9)。缺血组Akt 仅在4 h明显增强(灰度值135.5±2.2),随后则未检测到(灰度值分别为165.3±3.7,163.3±2.5)。而缺血PC组4 h时点Akt 呈阴性,随后24 h、72 h则持续显著的阳性。结论: 缺血PC能明显减轻海马CA1区神经元的缺血性损伤,其保护机制可能与 Akt Ser-473和Thr-308 2个位点磷酸化导致PI-3K/Akt信号转导途径的激活有关。     

亚低温后适应对树鼩局部脑缺血海马CA1区神经元的保护机制

目的： 观察亚低温后处理(HPC)对树鼩局部脑缺血后不同时间海马CA1区血管内皮生长因子（VEGF）表达及神经元缺失的影响,探讨亚低温后适应保护脑缺血后海马CA1区神经元的可能机制。方法：建立光化学诱导树鼩脑缺血模型,于缺血后6h采用局部恒温控温装置使脑温降低并维持亚低温(31-32 ℃)状态1 h。用免疫组化法及图像分析仪测定海马CA1区VEGF表达的改变;计数海马神经元并观察其超微结构变化。结果：与常温组相比,亚低温后适应组海马CA1区VEGF表达在24 h时增加而72 h时明显下降（P＜0.01）;24 h时神经元坏死减少,72 h时坏死细胞增多,缺血侧超微结构呈现相同变化。结论：在脑缺血后早期VEGF的表达可能与其直接发挥对神经元细胞的保护作用有关,亚低温后适应对脑缺血的保护作用在脑缺血的早期有明显意义,而在缺血的晚期则可能加重脑缺血的损伤,低温后适应脑保护的意义在于延长脑缺血治疗时间窗。     

后适应对树鼩不同脑缺血模型同一"时间窗"海马神经元保护的比较

目的: 观察缺血后适应(PC)对血栓性脑缺血(TC)及大脑中动脉闭塞(MCAO)2种脑缺血模型同一"时间窗"的脑保护效果,并探讨其可能机制。方法: 建立树鼩TC及MCAO脑缺血模型,于脑缺血后4 h夹闭同侧颈总动脉实施缺血PC。用TTC染色显示皮层梗塞面积,采用电镜及激光多普勒(LD)技术分别观察脑缺血后4 h、24 h及72 h海马CA1区神经元超微结构及局部脑血流(rCBF)的变化,比较PC对2种中风模型海马 rCBF和神经元超微结构的影响。结果: 脑缺血后海马CA1区神经元的超微结构改变以线粒体肿胀、嵴断裂以及内质网扩张为主,MCAO的梗塞面积和细胞损伤程度明显高于TC组,且PC缓减TC组海马线粒体损伤的作用较MCAO的明显。TC和MCAO后海马rCBF明显降低,TC组rCBF的降低以24 h明显(P＜0.01),而MCAO组rCBF的降低则以72 h明显(P＜0.01)。脑缺血后4 h实施PC可改善TC组海马rCBF(P＜0.01)和减轻线粒体损伤,而MCAO组rCBF及神经元形态学改善不明显。结论: 脑缺血后4 h实施缺血PC能有效对抗缺血性脑损伤,其脑保护效果与rCBF的增加有关。缺血PC对TC组的脑保护作用较MCAO组明显。     

缺血后适应对脑缺血树鼩海马TLR4表达的影响

目的: 观察血栓性脑缺血树鼩海马Toll 样受体4(TLR4)表达的改变,进一步探讨缺血后适应对海马TLR4表达的影响。方法: 用光化学法建立血栓性脑缺血模型;并于缺血4 h夹闭缺血侧颈总动脉5 min,再通5 min,重复3个循环,实施后适应处理。用HE染色观察海马组织学改变,Western blotting测定海马TLR4蛋白表达,RT-PCR测定海马TLR4 mRNA。结果: 脑缺血4、24、72 h海马神经元损伤进行性加重,24 h达高峰,后适应后损伤减轻。脑缺血海马TLR4蛋白表达明显增强(P＜0.05)。与脑缺血组比较,后适应4 h及24 h TLR4蛋白表达减少 (P＜0.05),后适应72 h TLR4蛋白表达增加(P＜0.05)。海马TLR4 mRNA的表达趋势与蛋白表达基本一致。结论: 脑缺血时海马TLR4表达明显增强,缺血后适应的脑保护机制可能与调控TLR4表达有关。     

缺血后适应对树鼩海马CA1区脑血流及星形胶质细胞活化的影响及可能机制

目的：研究缺血后适应（PC）对树鼩局部脑缺血海马CA1区脑血流（rCBF）与星形胶质细胞（AS）活化的影响，探讨缺血PC影响AS表达胶质纤维酸蛋白（GFAP)的可能机制。方法：建立树鼩血栓性局部脑缺血及缺血PC模型，通过激光多普勒（LD）血流计测量脑缺血后4 h、8 h、12 h、24 h及72 h海马CA1区rCBF的改变；用免疫组化法测定脑缺血上述时间海马GFAP的表达，并用图像分析系统测定其平均灰度值。于脑缺血后4 h重复3次夹闭缺血侧颈总动脉实施缺血PC，并观察其对海马CA1区rCBF和AS活化以及GFAP表达的影响。结果：树鼩脑缺血后4h海马CA1区GFAP阳性细胞数增多，AS表达GFAP增强，24h可见AS胀亡；72h海马CA1区AS表达GFAP达高峰（120.0±2.1，P＜0.01）。脑缺血时海马CA1区rCBF逐渐降低，以24 h的改变最显著,为(2.55±0.28) PU，P＜0.01；72 h时海马CA1区rCBF略有增加，为(9.84±1.22) PU。实施缺血PC后，海马CA1区rCBF逐渐增加，72 h最显著,为(18.74±1.60) PU，P＜0.01；此时海马GFAP表达进一步增强（111.0±1.3),P＜0.01。但AS胀亡的病理改变基本消失。结论：多次短暂的闭塞动物的颈动脉可延长树鼩脑缺血治疗的“时间窗”；缺血PC的脑保护机制可能与增加海马rCBF、调控AS活化及改善海马微环境有关。     

JAK2-STAT3信号通路在树鼩脑缺血后适应中的作用机制

 目的：观察JAK2-STAT3信号转导通路在树鼩缺血后适应（ischemic postconditioning,IPoC）神经保护中的调控作用,探讨阻断JAK2-STAT3通路后脑损伤加重的机制。方法：通过光化学反应建立树鼩血栓性脑缺血模型;于缺血后4 h夹闭患侧颈总动脉3次（每次5 min）实施IPoC。于IPoC前10 min侧脑室注射AG490（JAK2抑制剂）后,采用TTC染色观察树鼩脑梗死面积的变化,通过HE染色和电镜观察脑皮层神经元形态改变及超微结构变化,应用Western blot检测IPoC及AG490处理后皮层t-STAT3和p-STAT3蛋白水平的变化。结果：缺血24 h,皮层神经元固缩,线粒体肿胀,嵴溶解;脑梗死面积占半脑面积的（24.78±3.30）%;此时皮层神经元STAT3磷酸化水平明显增高（P<0.01）。IPoC后皮层神经元损伤减轻,线粒体肿胀改善,脑梗死面积占半脑面积的百分比减小为（17.67±1.83）%（P<0.01）,STAT3磷酸化水平进一步增高（P<0.01）。然而,给予AG490处理后,皮层神经元损伤加重,脑梗死面积再次增大为（23.85±2.77）%（P<0.05）,STAT3磷酸化水平则明显降低（P<0.05）。结论：IPoC可能通过调控STAT3的磷酸化而减轻树鼩缺血性脑损伤,抑制JAK2-STAT3信号通路可抵消IPoC的保护效应而加重脑损伤。     

树鼩血栓性脑缺血中心区及半暗区神经元PAF受体结合特性的研究

目的：观察血栓性局部脑缺血过程中缺血中心区及半暗区血小板活化因子（PAF）受体的消长变化,探讨PAF在脑缺血中心区及半暗区神经元继发性脑损伤中的分子机制。方法：建立光化学诱导树鼩血栓性局部脑缺血模型并提取树鼩脑细胞膜蛋白,用[³H]-PAF放射配体结合试验检测中枢神经细胞膜不同特性的PAF结合位点（受体）。结果：树鼩脑细胞膜上存在两种亲和性不同的PAF受体,即高亲和性和低亲和性受体,其亲和力（kD）分别为(3.61±0.72) nmol/L（kD₁）和17.04±2.41) nmol/L（kD₂）相应的最大结合容量（B_max）分别为(1 457.94±168.01) pmol/g蛋白和(5 017.40±742.16) pmol/g蛋白。脑缺血4、24及72 h中心区、半暗区及对侧区高、低亲和性受体的kD值、B_max值均显著低于假手术组（P<0.01）,中心区及半暗区尤为明显,其中以缺血后24 h的变化最为显著。结论：PAF受体在介导缺血性脑损伤过程中起着重要作用,缺血中心区及半暗区机能代谢的不同与PAF受体亲和特性及最大结合容量改变不同有关,亦是PAF介导继发性脑损伤的重要分子基础。     

氟代柠檬酸抑制缺血后适应对树鼩脑缺血后海马HIF-1α/iNOS信号通路调控的脑损伤机制

目的:观察缺血后适应(PC)对树鼩脑缺血时海马HIF-1α/i NOS信号通路的调控作用,探讨抑制星形胶质细胞(AS)代谢加重脑损伤的机制。方法:光化学法建立血栓性脑缺血动物模型,氟代柠檬酸盐(FC)作为AS代谢抑制剂,于脑缺血后4 h闭/开缺血侧颈总动脉5 min,共3个循环以建立缺血PC模型。67只雄性树鼩随机分为对照组(n=9)、缺血4 h组(n=9)、缺血24 h组(n=9)、缺血PC 4 h组(n=9)、缺血PC 24 h组(n=9)、FC预处理4 h组(n=11)和FC预处理24 h组(n=11)。采用TTC染色观察树鼩脑梗死体积的变化,通过HE染色观察海马神经元病理学改变,用激光多普勒监测缺血区区域性脑血流(r CBF),免疫组化及Western blot检测海马i NOS表达,用分光光度计测定海马NO产量,用ELISA分析海马HIF-1α水平的变化。结果:脑梗死体积随缺血时间延长而增大,以缺血24 h为显著(P 0. 05);脑缺血后4 h和24 h皮层r CBF均下降(P 0. 05);而海马HIF-1α和i NOS表达增强,NO生成显著升高(P 0. 05)。缺血PC可增加皮层r CBF(P 0. 05),显著缩小脑梗死体积(P 0. 05),下调海马i NOS表达并减少NO的生成(P 0. 05)。而FC预处理组r CBF显著低于缺血组(P 0. 05),海马神经元损伤程度较缺血组加重,脑梗死体积随之增大(P 0. 05)。结论:缺血PC通过调控HIF-1α和i NOS表达而减轻缺血性脑损伤,抑制AS功能可削弱缺血PC介导的保护效应而加重脑损伤。     

缺血后适应促进树鼩血栓性脑缺血时紧密连接occludin/ZO-1蛋白表达及抑制脑水肿的机制

 目的: 研究脑缺血及缺血后适应(postconditioning,PC)条件下,树鼩脑缺血时局部脑血流(regional cerebral blood flow,rCBF)、脑水肿及紧密连接(tight junction,TJ)的occludin和zonula occludins(ZO)-1蛋白表达的改变;探讨TJ表达对脑水肿及脑梗死的影响及其可能机制。方法: 将72只健康成年树鼩随机分为对照组、脑缺血组和脑缺血+PC组,其余3只动物用于磁共振成像(MRI)观察。通过光化学反应诱导树鼩局部血栓形成;缺血PC组于缺血后4 h夹闭患侧颈总动脉3次(每次5 min)实施PC处理。用电镜观察神经超微结构,用TUNEL法检测海马神经元的凋亡数量,用激光多普勒血流监测仪检测缺血区的rCBF,用免疫组化及Western blot法观察缺血海马occludin/ZO-1蛋白的表达,MRI技术监测脑梗死体积,组织干湿法检测脑含水量的改变。结果: 树鼩脑缺血后海马CA1区的正常神经元明显减少以及神经元超微结构明显异常。脑缺血组TUNEL阳性细胞数明显增加(P<0.01),rCBF明显降低,occludin/ZO-1表达减弱(P<0.01),脑含水量和脑梗死体积明显增加(P<0.01)。经PC处理的动物,缺血区rCBF增加,TJ表达增强,脑含水量降低,且TUNEL阳性细胞数和脑梗死体积明显减小(P<0.01)。结论: 缺血PC可增加树鼩缺血区rCBF但不增加局部含水量;提示缺血PC缩小脑梗死体积可能与occludin/ZO-1表达增强而抑制脑水肿有关。     

缺血后处理局灶性脑缺血再灌注模型大鼠相关通路以及白细胞介素8的表达

背景：缺血后处理能够激发内源性保护作用,抑制缺血再灌注后的炎症反应,但具体机制目前尚不明确。目的：观察缺血后处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠Toll样受体4-核因子κB信号转导通路以及白细胞介素8表达的影响,进一步阐述缺血后处理的神经保护机制。方法：将110只大鼠随机分为假手术组10只、模型组和缺血后处理组各50只,将大鼠按照Zea-Longa法建立局灶性脑缺血再灌注模型,再进行缺血后处理,即大脑中动脉闭塞2 h后进行3个循环的再灌注15 s/缺血15 s,设模型组和假手术组作对照。对各组进行神经行为学评分,TTC染色测定脑梗死体积,免疫组织化学法检测脑组织Toll样受体4、核因子кB和白细胞介素8蛋白表达,原位杂交法检测其mRNA表达。结果与结论：模型组、缺血后处理组大鼠都出现神经行为学缺失及缺血侧大脑半球梗死。再灌注6,12,24,48,72 h,与模型组相比,缺血后处理组大鼠神经行为学评分显著改善(P < 0.05)、脑梗死体积明显减少(P < 0.05)。模型组和缺血后处理组Toll样受体4、核因子кB、白细胞介素8蛋白和mRNA表达于再灌注6 h时已升高,24 h达峰值。再灌注6,12,24,48,72 h,与模型组各对应时间点亚组比较,缺血后处理组上述各因子表达均显著降低(P < 0.05)。结果证实,缺血后处理可抑制缺血再灌注引起的炎症反应,通过抑制Toll样受体4-核因子κB信号转导通路和下调白细胞介素8的表达,以此发挥神经保护作用。  中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程     

缺血后适应调控树鼩脑缺血海马CA1区Akt（pS473）和Akt（pT308）过磷酸化的抗凋亡机制

观察树鼩脑缺血海马神经元Akt（pS473）和Akt（pT308）磷酸化改变对CA1区细胞凋亡的影响,探讨缺血后适应（PC）抑制细胞凋亡的可能机制。方法 用光化学诱导法诱导树鼩脑缺血并建立缺血PC模型;用免疫组织化学TACS原位凋亡检测试剂盒检测皮层及海马CA1区神经元凋亡数量,用免疫组织化学法检测Akt（pS473）和Akt（pT308）表达的空间分布,用ELISA法检测海马CA1区神经元Akt（pS473）和Akt（pT308）磷酸化水平;用电子显微镜观察其神经元超微结构改变。 结果 脑缺血后神经元皱缩,核消失以缺血24h为著。脑缺血后4 h、24 h及72 h皮层及海马CA1区神经元TUNEL阳性细胞数明显增加（P<0.01）,海马CA1区神经元Akt (pS473) 和Akt (pT308)的表达及磷酸化水平明显升高,以脑缺血4 h的改变最明显,分别为(152.3±3.5) units/mg、(130.8±2.6) units/mg和(149.5±4.7)units/mg和 (42.35±2.49) units/mg、(19.23±1.41) units/mg和(23.38±1.32) units/mg (P<0.01）。缺血PC组神经元损伤明显减轻,皮层及海马CA1区TUNEL阳性细胞明显减少（P<0.01）,且与海马神经元Akt (pT308)活化水平呈平行改变(P<0.05）。结论 树鼩脑缺血海马CA1区细胞凋亡与Akt(pS473) 和Akt (pT308)过磷酸化的信号机制有关,缺血PC抑制海马神经元Akt(pS473) 和Akt(pT308)双磷酸化可能具有抗凋亡作用。     

远隔缺血后处理对脑缺血模型大鼠再灌注损伤炎性反应相关信号的影响

背景：虽然目前已有一些研究表明远隔缺血后处理可以发挥神经保护作用,但是具体的机制尚不明了。 目的：探讨远隔缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。 方法：应用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型,并进行远隔缺血后处理,同时设假手术组和缺血再灌注组作对照。于缺血再灌注24 h后进行神经功能评分,检测梗死体积及脑含水量;RT-PCR检测缺血周围区脑组织内白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和单核细胞趋化蛋白1 mRNA表达情况;Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白表达情况。 结果与结论：与缺血再灌注组相比,远隔缺血后处理组神经功能评分有所降低,但差异无显著性意义,梗死范围和脑组织含水量显著降低(P < 0.05)。远隔缺血后处理组与缺血再灌注组相比,大鼠缺血周围区脑组织白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化蛋白1 mRNA和Bax蛋白表达降低(P < 0.05),Bcl-2蛋白表达升高(P < 0.05)。结果证实,远隔缺血后处理可以减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注产生的损伤,其机制可能与减轻炎性反应有关。  中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程