基质金属蛋白酶1、3,基质金属蛋白酶组织抑制剂1和miR-29在大鼠肺纤维化中及活性维生素D3处理后的表达与作用

目的:探讨大鼠肺纤维化发生发展中基质金属蛋白酶1(MMP1)、MMP3、基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)及miR-29的表达和作用以及活性维生素D3[1,25(OH)_2D_3]处理对这些基因表达的影响。方法:雄性SD大鼠随机分为预防组和治疗组。预防组分为对照组Ⅰ、模型组Ⅰ和给药组Ⅰ,治疗组分为对照组Ⅱ、模型组Ⅱ和给药组Ⅱ。模型组Ⅰ/Ⅱ和给药组Ⅰ/Ⅱ经气管注入博莱霉素,对照组Ⅰ/Ⅱ经气管注入生理盐水。预防组和治疗组分别于术后第2和14天腹腔注射给药,给药组给予活性维生素D3,模型组给予活性维生素D3溶剂,对照组给予生理盐水。预防组的各组分别于术后第14、21、28天处死大鼠取材,治疗组的各组分别于术后第21和28天处死大鼠取材。实时定量PCR检测大鼠肺组织中miR-29a及TIMP1 mRNA表达水平,免疫组织化学检测组织中MMP1、MMP3和TIMP1的表达水平。结果:模型组Ⅰ/Ⅱ和给药组Ⅰ/Ⅱ中的MMP1、MMP3和TIMP1的表达均明显高于相同时间点对照组Ⅰ/Ⅱ中的表达,而miR-29a的表达明显低于相应的对照组Ⅰ/Ⅱ;给药组Ⅰ/Ⅱ中MMP1、MMP3和TIMP1的表达均低于相应时间点的模型组Ⅰ/Ⅱ的表达,而给药组Ⅰ/Ⅱ中miR-29a的表达则高于模型组Ⅰ/Ⅱ中的表达。结论:MMP1、MMP3、TIMP1和miR-29在大鼠肺纤维化发生发展中具有重要作用,活性维生素D3可以促进miR-29表达,抑制MMP1、MMP3、TIMP1的表达;可能是通过miR-29调节包括MMP1、MMP3、TIMP1在内的多种靶基因来发挥抑制纤维化的作用。     

活性维生素D3对大鼠肺纤维化中蛋白激酶D1介导的抗氧化通路的影响

目的:探讨肺纤维化发生发展中蛋白激酶D1(PKD1)介导的线粒体抗氧化通路的作用以及活性维生素D3在纤维化过程中对该通路的影响。方法:雄性SD大鼠随机分成对照组、模型组和治疗组。应用实时荧光定量PCR和免疫组织化学分别从mRNA和蛋白质水平检测大鼠肺组织中PKD1、核转录因子(NF-κB)和锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的表达。结果:在第14天,治疗组和模型组中PKD1、NF-κB和MnSOD的表达量都显著低于对照组,而治疗组中3种因子的表达量又明显高于模型组;在第21天,3种因子在模型组和治疗组中的表达量明显高于对照组。在第28天,3种因子在模型组和治疗组中的表达量与对照组相比两两之间均没有差异。结论:PKD1-MnSOD线粒体抗氧化通路在博莱霉素引起的大鼠肺纤维化早期发挥重要作用,活性维生素D3能够上调这一抗氧化通路,具有一定的抗氧化作用,对大鼠肺纤维化的发生发展具有一定的抑制作用。     

远端同源异型盒2和叉头盒O3a在大鼠脑皮质发育过程中的分布与表达

目的 了目的 探讨远端同源异型盒2（Dlx2）和叉头盒O3a（FoxO3a）在SD大鼠脑皮质发育过程中的表达特点。 方法 应用Real-time PCR法检测Dlx2 mRNA和FoxO3a mRNA分别在受孕11d（E11）、E13、E15、E17、E19及生后1d（P1）的表达情况;应用免疫组织化学技术显示Dlx2和FoxO3a在E11、E13、E15、E17、E19及P1蛋白的表达情况。 结果 FoxO3a与Dlx2 mRNA在E11～P1均有表达,而FoxO3a mRNA表达高峰明显早于Dlx2 mRNA;Dlx2 mRNA表达在E15～E17时大幅度上升,而在此之后始终保持这一高水平的表达;Dlx2 mRNA与FoxO3a mRNA的表达在E15～P1呈现出一致的变化趋势;Dlx2基因在E19时出现mRNA水平的高表达而未见蛋白表达。 结论 Dlx2和FoxO3a基因在胚胎后期鼠脑皮质中均有表达,且其表达趋势具有一定的一致性;两基因的分布随皮质分层而改变。     

1,25(OH)2VD3 对大鼠肺纤维化中IL-9 及PU-1 表达水平的影响

目的:探讨肺纤维化发生发展中IL-9 及PU.1 的作用以及活性维生素D3 [1,25(OH)2 VD3 ]在纤维化过程中对两种因子表达水平的影响。方法:90 只SPF 级雄性SD 大鼠随机分成三个组:对照组、模型组和治疗组(n =30)。模型组和治疗组经气管注入博来霉素(5 mg/ kg)建立肺纤维化模型,对照组注入等体积生理盐水。治疗组于手术后第2 天腹腔注射活性维生素D3 ,模型组注射等量的活性维生素D3 溶剂(丙二醇),对照组注射等量的生理盐水。各种处理均为两天一次。分别于手术后第14、21 和28 天处死大鼠取材,各小组每个时间点10 只大鼠。HE 染色法观察各组实验大鼠肺部病理变化,Masson染色法观察胶原纤维的差异,碱水解法检测羟脯氨酸含量的变化。应用Real-time PCR 和免疫组化技术分别从mRNA 水平和蛋白质水平检测大鼠肺组织中IL-9 及PU.1 的表达,ELISA 法检测血清中IL-9 的表达水平。结果:博来霉素处理后,第14 天大鼠肺部已经出现纤维化,随着时间推移,纤维化进一步加重。在三个时间点,模型组和治疗组的羟脯氨酸含量明显高于对照组,而治疗组明显低于模型组。在三个时间点,治疗组和模型组中IL-9 及PU.1 的表达量均逐渐增高,且都显著高于对照组;第14、21 天治疗组两种因子的表达量均明显低于相应时间点的模型组,第28 天时治疗组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。第21 天模型组和治疗组IL鄄9 和PU郾1 的表达水平明显高于第14 天,第28 天与第21 天比较差异无统计学意义。结论:IL-9 和PU.1 在博来霉素引起的大鼠肺纤维化早期可能发挥促纤维化作用。活性维生素D3 可能通过降低PU.1 的表达水平,进而减少IL-9 的分泌,从而对大鼠肺纤维化的发生发展起一定的抑制作用。     

维生素D3受体在人胎脑表达的研究

为研究维生素D3受体(VDR)在正常人胎脑的分布,进而探讨1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2D3]与正常人胎脑发育的关系,本实验按合法程序收集2～7月龄正常人胎脑,用免疫组织化学方法研究VDR在正常人胎脑的时空表达情况。结果显示:阳性产物在海马结构存在于胞核,3月龄出现表达的高峰,此后逐渐下降;在额叶皮质以及中脑部位的胞核和胞浆都可存在,其表达随胎龄增长。以上结果表明VDR在2～7月龄的人胎脑额叶皮质、海马结构和中脑有表达,且各部位的表达模式不同,提示1,25-(OH)2D3通过VDR可在人胎脑不同部位发育中发挥作用。     

自噬相关蛋白LC-3和Beclin-1在大鼠硅沉着病发生中的表达及意义

目的 观察自噬相关蛋白LC-3和Beclin-1在大鼠硅沉着病模型中的表达及意义,并探讨其机制;从细胞自噬角度研究硅沉着病形成的分
子机制。方法 将90只健康SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）组,每组30只。采用非暴露式气管插管一次
性灌注二氧化硅粉尘混悬液法建立大鼠硅沉着病模型,并给予3-MA干预,各组分别于造模后第1、3、7、14及28 天分批处死6只大鼠。留取肺组织,
HE和Masson染色观察肺组织形态变化; 免疫组织化学染色检测LC-3、Beclin-1的表达及分布;免疫印迹法检测LC-3、Beclin-1的蛋白表达量。结果
与对照组相比,模型组有显著的肺泡炎改变、明显的矽结节形成及大量胶原沉积。LC-3、Beclin-1在各时间点的表达均上调（P＜0.05）,并随
时间呈现动态变化趋势,SiO2 注入后1 d表达有升高趋势,14d达高峰（P＜0.05）,28 d回落,但仍高于基础表达。与模型组相比,3-MA组肺泡
炎减轻,矽结节减小,胶原沉积减少,LC-3、Beclin-1在各时间点的表达均下调（P＜0.05）,各时间点的变化趋势无显著性改变。结论 细胞自
噬参与大鼠硅沉着病的病理进程,并在硅沉着病的发生与发展过程中起重要作用。     

三叶因子3在甲状腺乳头状癌TPC-1细胞上皮间质转化中的作用及机制

目的 探讨三叶因子3（TFF3）基因沉默对人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞迁移、侵袭、克隆形成能力以及对上皮间质转化（EMT）的影响及机制。 方法 免疫组织化学技术检测甲状腺乳头状癌组织芯片中Snail与TFF3的表达。划痕实验、侵袭实验和克隆形成实验分别检测TFF3基因对TPC-1细胞迁移、侵袭和克隆能力的影响;实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）、免疫印迹法和免疫细胞化学染色检测上皮间质转化标志物及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路相关蛋白的变化。 结果 31例甲状腺乳头状癌组织中,Snail蛋白于癌细胞胞质表达,31例癌旁组织阴性表达;Snail蛋白与TFF3表达呈正相关(r=0.8450,P<0.05)。TFF3基因沉默后,人TPC-1细胞的细胞迁移、侵袭和克隆形成能力均明显降低(P<0.01);TPC-1细胞上皮间质转化标志物及MAPK通路相关蛋白细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2和p-ERK1/2也显著降低(P<0.05)。 结论 沉默TFF3可能通过MAPK通路相关蛋白ERK1/2抑制上皮间质转化,降低TPC-1细胞迁移、侵袭和增殖能力。     

活性维生素D3联合力学拉伸对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及OPG和RANKL表达的影响

目的体外模拟成骨细胞在体内的生存环境,考察活性维生素D3(VD3)、力学拉伸以及两者联合对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及破骨细胞抑制因子(OPG)和破骨细胞分化因子(RANKL)表达的影响。方法将10 nmol/L VD3、间断性力学拉伸以及两者联合作用于成骨细胞。流式细胞术检测细胞增殖。荧光探针试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)活性。实时定量PCR检测核心转录因子Runx2、OPG、RANKL mRNA水平,Western blotting检测其蛋白表达。结果 VD3抑制成骨细胞增殖,力学拉伸不能改变这种抑制效应。力学拉伸和VD3单独作用成骨细胞均能增加ALP活性及提高ALP、Runx2 mRNA水平,但当联合刺激后这些指标均降低,且成强度依赖性。力学拉伸增加OPG/RANKL比值,增强成骨作用,联合VD3后,OPG/RANKL比值下降。结论力学拉伸能有效诱导成骨分化,增加骨形成。VD3与力学拉伸联合抑制成骨细胞增殖和分化,并通过增加RANKL表达而影响骨重建。研究结果为骨质疏松及相关骨疾病的理论和治疗提供有意义的探索。     

桉叶油联合维甲酸对SD胎鼠脑组织Pax3和缝隙连接蛋白43表达的影响

目的探讨桉叶油联合维甲酸(RA)对SD胎鼠脑组织转录因子Pax3、缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响。方法 SD孕鼠42只,随机分为6组,每组7只,正常对照组,RA组,溶剂对照组(花生油+RA),3个实验组(桉叶油高、中、低剂量+RA)。正常对照组自由摄食饮水,溶剂对照组于孕第7~14天每只花生油2ml灌胃,每天1次,孕第10天40mg/kg RA灌胃1次。桉叶油3个剂量组于孕第7~14天分别桉叶油300、200和100mg/kg灌胃,每天1次,孕第10天40mg/kg RA灌胃1次。RA组于孕第10天40mg/kg RA灌胃1次。各组于孕21天处死孕鼠取胚胎,Western blotting、免疫组织化学技术检测胎鼠脑组织的Pax3、Cx43蛋白的表达。Real-time PCR检测脑组织Pax3、Cx43 mRNA表达。阿利新蓝和茜素红进行骨骼染色,体视显微镜下观测椎骨发育,脊柱间隙。结果维甲酸灌胃各组胎鼠椎骨数量异常的胎鼠数与正常对照组比较差异无显著性,但在维甲酸灌胃各组中,胎鼠椎骨形态异常的异常率和胎鼠椎骨分裂的百分率最低值分别为55%(桉叶油高剂量+RA组)和45.8%(桉叶油低剂量+RA组),较正常对照组高(0)(P0.05)。在维甲酸灌胃各组中,桉叶油各组胎鼠椎骨形态异常的异常率和胎鼠椎骨分裂的百分率最高值分别为62.5%(桉叶油低剂量+RA组)和55.0%(桉叶油高剂量+RA组),较维甲酸组(73.7%,73.7%)和溶剂对照组低(68.2%,63.6%,P0.05)。与正常组胎鼠比较,维甲酸灌胃各组大脑组织的Pax3、Cx43蛋白及其mRNA的表达较正常组高(P0.05),在维甲酸灌胃各组中,桉叶油灌胃各组胎鼠脑组织Pax3、Cx43蛋白及其mRNA的表达较单纯RA灌胃组低,其差异有统计学意义(P0.05)。结论桉叶油对维甲酸引起胎鼠神经管缺陷有一定的拮抗作用。其机制可能与桉叶油拮抗维甲酸上调胎鼠神经组织的Pax3、Cx43蛋白过度表达有关     

地塞米松对大鼠肝细胞BRL-3A增殖和凋亡的影响

目的探讨地塞米松对体外培养大鼠肝细胞BRL-3A增殖和凋亡的影响。方法用不同浓度的地塞米松处理BRL-3A细胞,于12、24、48、72、120 h后用MTT检测地塞米松对BRL-3A细胞活性的影响,同时分别用Annexin V-FITC双染法、PI单染色法、实时定量-聚合酶链反应(Real-time PCR)等方法检测地塞米松对BRL-3A细胞周期和凋亡的影响。结果 MTT检测表明,地塞米松能够抑制BRL-3A细胞的活性;Annexin V-FITC双染法分析显示,地塞米松具有显著促进BRL-3A细胞凋亡的效果;PI单染色法检测细胞周期分布情况表明,地塞米松处理后的细胞与对照组相比增殖能力减弱;用Real-time PCR检测促细胞凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和促增殖基因Ccnd1和Jun的mRNA表达情况,结果显示,用地塞米松处理后的细胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9均表达上调,而Ccnd1和Jun均表达下调,说明地塞米松能促进BRL-3A细胞的凋亡。结论地塞米松可以促进BRL-3A细胞的凋亡,并抑制其增殖。     

过表达miRNA-29a对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的作用

目的:检测微小RNA(miRNA)-29a在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉血管壁组织中的表达,研究过表达miRNA-29a对肺动脉高压大鼠的影响,并探讨其初步机制。方法:在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠模型上,用实时荧光定量PCR测定肺组织miRNA-29a的表达水平;尾静脉注射miRNA-29a-mimic后,记录大鼠肺动脉压和体循环动脉压,苏木素-伊红染色观察肺动脉组织的形态,Western blot检测肺动脉组织中p-Akt与peNOS的蛋白水平。结果:野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉血管壁组织中miRNA-29a呈低表达;过表达miRNA-29a后,大鼠肺动脉压明显下降,体循环血压无显著变化,肺动脉中膜增厚程度显著减弱,肺血管重构现象不明显,p-Akt与p-eNOS的蛋白水平上调。结论:过表达miRNA-29a对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压具有改善作用,可能与激活PI3k/Akt-eNOS信号通路有关。     

内皮素的表达与鼠肺纤维化的关系

目的：动态观察肺纤维化大鼠的内皮素合成和分布,了解ET与肺纤维化发生发展的关系。方法：采用放射免疫法和SP免疫组织化学方法,观察博莱霉素（BW）组（n＝25）和对照组（n＝25）在用药后1、3、7、14、28d时血浆EF浓度及肺组织财的合成和分布情况。结果.BLM组大鼠血浆ET含量明显高于正常对照组（P＜0．01）,ET在支气管上皮细胞和炎性细胞表达增强P＜0．01。结论：ET可能与肺纤维化的发生发展有密切关系,参与了肺纤维化的渗出和增生过程。     

利用肾系膜细胞3D培养体系探讨高糖环境下miR-382与肾纤维化的相关性

目的　采用LBL技术构建肾系膜细胞3D细胞球,研究miR-382在糖尿病肾病系膜病变及肾纤维化中的作用。 方法　采用LBL技术构建肾系膜细胞3D细胞球,研究不同葡萄糖浓度对肾系膜细胞的影响及miR-382在其中的作用。实验组分为3组（葡萄糖浓度分别设为5.6 mmol/L、25 mmol/L、40 mmol/L）,采用qRT-PCR、Western blotting、免疫荧光等手段检测各组细胞中转化生长因子（TGF-β1）、纤连蛋白（Fn）的表达,miR-382及其可能的靶基因第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因（PTEN）的水平。 结果　高糖可使系膜细胞miR-382表达上调,分泌PTEN减少,TGF-β1、Fn表达显著增加。 结论　miR-382可能通过负向调控PTEN的表达,参与糖尿病肾病早期系膜病变及肾纤维化过程。     

Immunohistochemistry of cyclin D3 in pulmonary carcinomas

Cyclin D3, a cell cycle regulator, is encoded in the 6q21 chromosome region. Abnormalities of this gene and its protein product have not been found in normal tissues or in malignancies from human subjects. The expression of cyclin D3 was studied immunohistochemically in archival formalin-fixed, paraffin-embedded specimens from normal organs obtained from three autopsy cases and 237 human primary pulmonary carcinomas. In normal organs, nuclear positivity for cyclin D3 was observed in reactive type-2 pneumocytes, islets of Langerhans, lymphocytes from lymph nodes, superficial cells of transitional epithelium, epithelium of oesophagus, stomach, small intestine and gallbladder, endothelium, smooth muscles, and brain. Proliferating cells such as lymphocytes in the germinal centres and non-proliferating cells such as neurons both demonstrated cyclin D3 immunoreactivity. Cyclin D3 showed obvious nuclear immunoreactivity in 168 pulmonary carcinomas (71%). The proportion of tumour cells that were cyclin D3-positive ranged from 1% to 73% (median, 16%). There was no relationship between cyclin D3 immunoreactivity and histological typing, tumour differentiation, or pathological TNM staging. In pulmonary carcinomas, distinct expression of the cyclin D3 protein is unlikely to be implicated in tumorigenesis, because of its expression in only a small fraction of cancer cells. It may relate to cancer progression. The distribution of cyclin D3 reactivity in the normal tissues suggests that cyclin D3 affects other processes than cell cycle regulation in a lineage-specific manner.     

MicroRNA-21 and microRNA-29a modulate the expression of collagen in dermal fibroblasts of patients with systemic sclerosis

MicroRNAs (miRNAs) are well-known candidates for modulating the dysregulated signaling pathways during fibrosis. In this study, we investigated the expression pattern of 16 miRNAs, which have previously been confirmed or predicted to target genes involved in extracellular matrix (ECM) homeostasis. Primary culture of dermal fibroblasts was obtained from skin biopsies of diffused cutaneous SSc (dcSSc) patients and healthy controls. Expression of let-7a, miR-1, miR-15a, miR-17, miR-19a, miR-20a, miR-21, miR-27b, miR-26a, miR-29a, miR-29b, miR29c, miR-141, miR-125a-5p, miR-193a-3p, and miR-200a were quantified by Real-time PCR. Functional analysis of microRNAs was performed using synthetic oligonucleotides. To further confirm the pro- or anti-fibrotic effects of miRNAs, normal fibroblasts were treated with 10 ng/mL of transforming growth factor (TGF)-β to generate an in vitro model of dermal fibrosis. miR-21 and miR-29a were upregulated and downregulated, respectively, in both dcSSc and TGF-β-treated fibroblasts. We observed that restoration of miR-29a expression or blockade of miR-21 function negatively affected collagen production. COL1A1 expression in SSc fibroblasts is more sensitive to changes of miR-29a and miR-21 expression in compare to normal fibroblasts. miR-29a alone was effective to decrease TGF-β-induced collagen production in dermal fibroblasts. miR-21 and TGF-β had synergistic effects on induction of collagen production. However, neither miR-21 nor miR-29a affected alpha smooth muscle actin (α-SMA) expression in the presence or absence of TGF-β in dermal fibroblasts. miR-21 and miR-29a as pro- and anti-fibrotic miRNAs modulate collagen production in an opposing manner. Focusing on miR-21 and miR-29s as therapeutic targets would be effective in patients with SSc or other fibrotic diseases which show aberrant expression of collagen expression.     

利用肾系膜细胞3D培养体系探讨高糖环境下miR-382与肾纤维化的相关性

目的　采用LBL技术构建肾系膜细胞3D细胞球,研究miR-382在糖尿病肾病系膜病变及肾纤维化中的作用。 方法　采用LBL技术构建肾系膜细胞3D细胞球,研究不同葡萄糖浓度对肾系膜细胞的影响及miR-382在其中的作用。实验组分为3组（葡萄糖浓度分别设为5.6 mmol/L、25 mmol/L、40 mmol/L）,采用qRT-PCR、Western blotting、免疫荧光等手段检测各组细胞中转化生长因子（TGF-β1）、纤连蛋白（Fn）的表达,miR-382及其可能的靶基因第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因（PTEN）的水平。 结果　高糖可使系膜细胞miR-382表达上调,分泌PTEN减少,TGF-β1、Fn表达显著增加。 结论　miR-382可能通过负向调控PTEN的表达,参与糖尿病肾病早期系膜病变及肾纤维化过程。     

Immunolocalization of cathepsin D in pneumocytes of normal human lung and in pulmonary fibrosis

Cathepsin D expression has been assessed by immunohistochemistry and immunoelectron microscopy in fetal, normal adult and injured lungs of human beings. In addition to the well known positivity of alveolar macrophages and the bronchial epithelial cells, normal type I and to a lesser extent type II pneumocytes showed a granular, cytoplasmic staining pattern. Using immunogold labelling of lowicryl embedded human lung, cathepsin D was present in lysosomes of epithelial cells. Double immunofluorescence labelling employing type I and type II specific antibodies or lectins confirmed the epithelial staining for cathepsin D. At the terminal sac period during lung development cathepsin D appears in the alveolar epithelium. In fibrotic specimens, enhanced immunoreactivity was found in epithelial and non-epithelial cells. Proliferative epithelial formations were strongly stained with cathepsin D antibodies, whereas detached, desquamated epithelial cells were weakly positive or negative. We suggest that cathepsin D plays a role in the remodelling process during fibrogenesis.