体外培养的人牙髓细胞、牙周韧带细胞几种基质表达和碱性磷酸酶分泌的研究

目的：研究并比较培养的５～７代人牙髓细胞和牙周韧带细胞几种基质表达和碱性磷酸酶分泌的情况。方法：细胞培养、免疫组化、碱性磷酸酶活性分析。结果：两种细胞均在培养的第９天进入生长静止期，两种细胞培养液中碱性磷酸酶活性在增殖期达到高峰，以后活性下降。两种细胞均表达ＦＮ、Ⅲ型胶原、ＢＭＰ。当培养的细胞密度较高时，ＦＮ和Ⅲ型胶原以纤维状结构覆盖于细胞表面。结论：传代的人牙髓细胞和牙周韧带细胞的上述几种基质表达方式、碱性磷酸酶活性相似。     

降钙素基因相关肽对人牙髓细胞的矿化影响

目的：分析降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP)对人牙髓细胞促矿化功能的影响，探讨CGRP在牙髓炎症状态下表达量增多的生物学意义。方法：人牙髓细胞分实验组和对照组培养，实验组加入适量的CGRP。分别测定细胞的碱性磷酸酶活性、骨钙素含量、I型胶原mRNA表达量变化。结果：培养3、6、9、12、15d,5个时间点实验组比对照组细胞碱性磷酸酶活性增强、骨钙素含量增加，且有显著性差异（P＜0．01）。培养6d的实验组的细胞I型胶原mRNA表达比对照组明显高。结论：CGRP刺激牙髓细胞分化，促进矿化形成，CGRP表达增高将有助于修复性牙本质形成。     

bFGF、TGF-β对人牙髓干细胞增殖和分化能力的影响

目的：探讨bFGF和TGF-β对体外培养的人牙髓f细胞增殖和分化能力的影响。方法：采用MTT法分别测定了bFGF和TGF-β作用不同浓度、不同时间单独或联合作用对人牙髓干细胞增殖能力的影响。通过碱性磷酸酶活性检测、细胞形态学观察及DSP、DMP-1免疫组化染色来检测这两种因子对人牙髓十细胞分化能力的影响。结果：0～40ng／mL范围内，bFGF单独作用能显著促进人牙髓干细胞的增殖，EL具有浓度和时间依赖性，而TGF～8促增殖作用较弱；两肯联合作用，促增殖作用无显著提高，而促分化作用显著增强，不仪细胞形态明显改变，而且碱性磷酸酶活性显著提高，DSP、DMP-1呈阳性表达，向成牙本质细胞样细胞分化。结论：bFGF和TG-β对体外培养的人牙髓干细胞增殖和分化具有重要作用，为对探讨影响人牙髓干细胞增殖和分化的因素提供参考依据。     

促红细胞生成素对人牙髓细胞增殖和成骨分化的影响

目的：探讨促红细胞生成素（EPO）对体外培养的人牙髓细胞（hDPCs）增殖和成骨分化的影响。方法：体外培养鉴定人牙髓细胞。使用 EPO 对在成骨诱导培养基中培养的牙髓细胞进行刺激,CCK-8检测 EPO 对牙髓细胞增殖的影响;20 U ／ml EPO 培养 hDPCs 7 d 和14 d,采用碱性磷酸酶活性（ALP）检测和茜素红染色观察 EPO 对牙髓细胞矿化的影响;利用 Real-time PCR 检测加入 EPO 后牙髓细胞成牙本质向分化相关基因的表达情况。结果：EPO 以时间和剂量依赖性方式促进牙髓细胞的增殖;20 U ／ml 的 EPO 后作用,牙髓细胞碱性磷酸酶活性显著提高（P ＜0．05）,钙结节形成明显增多;成牙本质向分化相关基因 DSPP、OCN、OSTERIX、RUNX2的表达明显上调（P ＜0．05）。结论：EPO 能促进人牙髓细胞的增殖和分化。     

组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

目的 研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响.方法 成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化.逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究.碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性.茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力.实时定量RT-PCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达.结果 成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达.过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达.结论 组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能.     

人重组骨形成蛋白-1对牙髓细胞生物学效应的研究

通过细胞培养技术，噻唑盐比色测定，酶动力学方法和放射免疫技术，了解人重组骨形成蛋白－１对体外培养的人牙髓细胞增殖，碱性磷酸酶活性及骨钙素表达的影响。结果表明，ｒｈＯＰ－１牙促进牙髓细胞增殖，提高牙髓碱性磷酸酶活性及骨钙素的表达，在本实验剂量范围内呈浓度依赖关系，具有诱导牙髓细胞中成骨方向转化的趋势。     

脂多糖对人牙髓细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

目的:了解脂多糖(LPS)对人牙髓细胞的增殖和碱性磷酸酶活性的影响。方法:Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养牙髓细胞,检测细胞表面LPS受体CD14(mCD14);流式细胞术观察不同浓度LPS(0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml)对牙髓细胞细胞周期的影响,测定不同浓度LPS对牙髓细胞碱性磷酸酶活性的影响,采用χ2检验以及单因素方差分析对实验数据分别进行统计学分析。结果:人牙髓细胞不表达mCD14,LPS在浓度为0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml时可以抑制牙髓细胞增殖(P<0.01)及碱性磷酸酶活性(P<0.05)。结论:LPS具有抑制牙髓细胞增殖及牙髓细胞分化的作用。     

人牙囊细胞的分离培养和生物学特性

目的：应用酶消化法体外培养人牙囊细胞并研究其生物学特性。方法：分离合法引产人胚胎乳牙胚的牙囊组织，消化法获得人牙囊细胞，HE染色观察细胞形态、免疫组织化学染色技术检测波形丝蛋白、Ⅰ型胶原表达，RT—PCR检测细胞的骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶的表达。结果：原代培养的人牙囊细胞呈成纤维细胞形态，有部分一上皮成分混杂，经纯化后可排除；在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和波形丝蛋白的表达呈阳性，定位于细胞的胞质中；RT—PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达。结论：体外培养的人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性，具有合成Ⅰ型胶原的能力；不同程度表达Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶等矿化相关蛋白。     

不同培养条件下人牙髓细胞α-SMA表达的变化

目的：检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在正常及诱导分化的人牙髓细胞中的表达变化，探讨α-SMA与人牙髓细胞分化之间的关系。方法：体外连续人牙髓细胞，传代后分二组，一组常规培养，一组用条件培养液诱导其分化，采用免疫组化和ELISA方法检测两组细胞α-SMA的表达，分析其差异。结果：随体外常规连续培养，人牙髓细胞α-SMA表达逐渐增多；较之常规培养组，诱导分化组的细胞α-SMA表达减少。结论：人牙髓细胞在朝成牙本质细胞方向分化时，α-SMA表达逐渐减少；人牙髓细胞体外常规连续培养，细胞逐渐表现为均质成熟的成纤维样细胞。     

表达纯化釉原蛋白可溶性上清液对牙髓细胞骨钙素和碱性磷酸酶的影响

目的：探讨釉原蛋白的作用机制，为临床应用釉原蛋白进行龋病的治疗奠定基础。方法：采用细胞培养、放射免疫测定和碱性磷酸酶（AKP）检测等实验技术，探讨釉原蛋白Am对牙髓外胚间充质细胞的作用。结果：通过观察Am纯化蛋白可溶性上清液对体外培养的牙髓细胞的骨钙素含量和碱性磷酸酶活性的影响，发现Am可增加骨钙素含量，增强碱性磷酸酶活性，并呈剂量依赖性，在100ng/ml浓度下两者分别增加3和4倍。结论：Am可促进人牙髓细胞的分化和矿化。     

Determinants of Dental Pulp Stem Cell Heterogeneity

IntroductionThe aim of this review is to provide a narrative review on the determinants of dental pulp stem cell (DPSC) heterogeneity that may affect the regenerative properties of these cells.MethodsPubMed, Scopus, and MEDLINE (Ovid) literature searches were done on human dental pulp stem cell heterogeneity. The focus was on human dental pulp stem cells with a primary focus on DPSC heterogeneity.ResultsDPSCs display significant heterogeneity as illustrated by the various subpopulations reported, including differences in proliferation and differentiation capabilities and the impact of various intrinsic and extrinsic factors.ConclusionsThe lack of consistent and reliable results in the clinical setting may be due to the heterogeneous nature of DPSC populations. Standardization in isolation techniques and criteria to characterize DPSCs should lead to less variability in results reported and improve comparison of findings between studies. Single-cell RNA sequencing holds promise in elucidating DPSC heterogeneity and may contribute to the establishment of standardized techniques.     

Cell Wall Mannan of Candida Attenuates Osteogenic Differentiation by Human Dental Pulp Cells

IntroductionCandida spp. has recently been introduced to interact with conventional carious bacteria, leading to dental caries progression and virulence ability. Evidence regarding the influence of Candida spp. on human dental pulp cell response remains unknown. This study aimed to investigate the effects of Candida albicans mannans on cytotoxicity, cell proliferation, osteogenic differentiation, and inflammatory-related gene expression in human dental pulp cells (hDPCs).MethodshDPCs were treated with cell wall mannans isolated from C. albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida tropocalis, Candida parapsilosis, and Candida dubliniensis. Cell viability was performed using a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide assay. Osteogenic differentiation– and inflammatory-related gene expression were determined using a real-time polymerase chain reaction. Mineralization was examined using alizarin red S staining.ResultsThe treatment of mannans isolated from C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropocalis, C. parapsilosis, and C. dubliniensis at concentrations ranging from 10–100 μg/mL did not affect cytotoxicity or cell proliferation. Mannans isolated from C. albicans, C. glabrata, and C. tropocalis significantly attenuated mineralization. However, cell wall mannans isolated from C. krusei, C. parapsilosis, and C. dubliniensis did not significantly influence mineral deposition in hDPCs. C. albicans cell wall mannans significantly attenuated osteogenic differentiation–related gene expression (RUNX2, ALP, and ENPP1). Interestingly, IL12 messenger RNA expression was significantly upregulated when treated with C. albicans cell wall mannans. The addition of recombinant IL12 significantly decreased mineralization in hDPCs.ConclusionsC. albicans cell wall mannans attenuated osteogenic differentiation in hDPCs and up-regulated inflammatory-related gene IL12 expression.     

内皮素促人牙髓细胞生长作用的体外研究

目的探讨不同浓度内皮素－１（ＥＴ－１）对人牙髓细胞的促增殖作用。方法采用人牙髓细胞体外培养技术和四唑盐（ＭＴＴ）显色分光光度法。结果不同浓度ＥＴ－１均有程度不同的促人牙髓细胞生长作用,并呈浓度依赖性。结论ＥＴ－１为促人牙髓细胞生长因子,可能对牙髓组织的再生修复起作用。     

人牙髓细胞诱导牙本质再生的实验观察

目的:观察人成体牙髓细胞体内诱导牙髓组织修复反应的能力.方法:在矿化诱导液作用下,将一定数量级的人牙髓细胞与β-TCP生物陶瓷颗粒进行复合,植入免疫缺陷鼠磨牙穿髓孔处,7 d、14 d后分别取材进行组织学观察.对照组采用氢氧化钙(Oycal)和空白对照组.结果:组织学观察表明,盖髓术后7 d,各组均出现了牙髓细胞向穿髓孔处迁移、聚集.术后14 d,牙髓细胞组炎症反应仅局限于穿髓孔处,有明显的修复性牙本质桥形成;Dycal组炎症反应涉及到少量冠髓,有部分矿化的纤维性屏障形成;空白对照组炎症反应涉及了大部分冠髓,仅有弥散的骨样牙本质形成.结论:在矿化诱导液作用下,牙髓细胞具有向成牙本质细胞样细胞定向分化的能力,将牙髓细胞植入鼠磨牙的穿髓孔处,显示其具有良好的维持牙髓活力和诱导修复性牙本质形成的能力.     

人牙髓细胞体外培养的方法学研究

作者观察了组织块法和酶消化法以及DMEM和RPMI1640二种常用培养液在人牙髓细胞体外培养中的效果。结果表明，组织块法培养出的牙髓细胞为单一的成纤维细胞样细胞，用DMEM时，其传代成功率明显高于用RPMI1604；胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶和胶原酶联用可培养出成纤维细胞样细胞，少量的校形细胞和内皮样细胞，但细胞数量较少，生长缓慢，达不到传代要求。DMEM在培养板和组织培养瓶中均较适合牙髓细胞的生长，而RPMI1640效果不理想。提示组织块法和DMEM适合于人牙髓细胞的体外培养。     

人牙本质基质蛋白1基因启动子在不同细胞中的活性比较和分析

目的观察并比较不同长度的人牙本质基质蛋白1(Dmp1)基因上游启动子片段在人牙髓干细胞(HDPSC)、成骨细胞(OC)和子宫颈癌上皮细胞株Hela中的启动子活性,为进一步研究Dmp1基因在矿化组织中的特异性转录调控特点和作用机制奠定基础。方法以获得正确序列的2 195 bp Dmp1基因上游启动子重组T载体为模板,通过 PCR方法获得不同长度的Dmp1基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染至HDP- SC、OC和Hela细胞,荧光素酶检测这些细胞中启动子活性并进行分析。结果成功地获得了6段不同长度的Dmp1 启动子目的片段。酶切鉴定表明不同长度启动子报告基因载体构建成功,不同片段的Dmp1启动子在不同细胞中活性不同,在HDPSC和OC中活性较强,而在Hela细胞中活性最低。在-505--193 bp区和-935--505 bp区可能分别存在HDPSC和OC较为特异的转录调控作用区域点,该区可能包含Dmp1表达的基础调控元件。结论成功克隆了不同长度的Dmp1上游启动子的序列,不同启动子片段在牙髓干细胞和成骨细胞等矿化性细胞中活性较强,并初步确定了Dmp1启动子在矿化性细胞中的基本启动子区域,而在非矿化性细胞Hela细胞中活性较低。     

脐静脉内皮细胞外泌体和内皮祖细胞外泌体对hDPSCs增殖及迁移能力的比较研究

目的 将人脐静脉内皮细胞外泌体(human umbilical vein endothelial cells-derived exosome,HUVECs-exo)和内皮祖细胞外泌体(endothelial progenitor cells-derived exosome,EPCs-exo)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖和迁移能力的影响进行比较研究,以期为外泌体在牙髓再生中的应用积累经验。方法 采用超速离心法分离提取外泌体,透射电镜观察外泌体形态,纳米粒子跟踪分析技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)检测外泌体粒径大小,Western blot蛋白印迹检测外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101的表达。将两种外泌体按照5、10、20 μg/mL浓度梯度分别作用于hDPSCs,通过CCK-8实验检测hDPSCs增殖能力,细胞划痕实验和Transwell实验检测hDPSCs迁移能力。结果 透射电镜下观察两种外泌体均呈圆盘状,粒径集中在30～150 nm,阳性表达CD9、CD63、TSG101三种标志蛋白。与对照组(Control组)相比,两种外泌体在不同浓度下均对hDPSCs增殖能力无显著促进作用,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞划痕实验和Transwell实验表明,与对照组相比,两种外泌体均可促进hDPSCs迁移,差异有统计学意义(P<0.05),其中10 μg/mL外泌体浓度作用效果最明显(P<0.01)。相同浓度的两种外泌体组间作用效果差异无统计学意义(P>0.05)。结论 本实验成功分离提取到两种细胞来源的外泌体并进行鉴定,将不同浓度的两种细胞来源的外泌体作用于hDPSCs,发现对其增殖能力无明显促进作用,但可以促进其迁移,尤以10 μg/mL外泌体浓度促进迁移效果最为明显。     

体外培养的人牙髓细胞表型分析

目的：分离培养来源于人体的牙髓细胞并对其细胞表型进行分析。方法：采用组织块法培养人牙髓细胞,根据牙髓的细胞成分选择特异性抗体,利用免疫组化技术对其细胞表型进行分析。结果：Ⅲ型胶原在体外培养的牙髓细胞中广泛表达,ON和OPN表达也较广泛,阳性细胞呈星形,伸出多个胞浆突起互相连接;α-平滑肌肌动蛋白和CD34表达细胞为集落状,前者呈细长的梭形,后者呈圆形;Ⅰ型胶原、BSP和OC仅在少量细胞中表达,且细胞形态不规则;DSP、NF、CD14及CD45均为阴性。结论：体外培养的人牙髓细胞表型呈现多样性,表达平滑肌、内皮细胞及骨的标志物。