在大肠杆菌中表达和提取纯化变形链球菌GTF—I

葡糖基转移酶是变形链球菌 (Ｓ ｍｕｔａｎｓ)的重要致龋毒力因子 ,其中ｇｔｆＢ基因编码的ＧＴＦ Ⅰ能够催化水不溶性葡聚糖的合成 ,介导变链菌与牙面的蔗糖依赖性粘附 ,在龋病的发生和发展中起重要作用。目前我们已研制了针对变链菌的表面蛋白ＰＡｃ和ＧＴＦ的融合防龋ＤＮＡ疫苗[1 ] ,为了进一步鉴定和加强其免疫效果 ,我们以金属螯合亲和层析法从大肠杆菌中表达、提取和纯化了重组葡糖基转移酶ＧＴＦ Ⅰ。一、材料和方法1 .重组葡糖基转移酶ＧＴＦ Ⅰ表达质粒的构建 :根据Ｓ ｍｕｔａｎｓＧＳ 5株葡糖基转移酶基因ｇｔｆＢ的序列设计扩…     

变形链球菌ComE蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的:构建变形链球菌comE基因原核表达载体,诱导ComE 融合蛋白高效表达,获取高质量的ComE 融合蛋白.方法:提取变形链球菌基因组,PCR 扩增得到变形链球菌comE基因片段,BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后定向克隆到pET28a(+) 表达载体中,并转化入E. Coli BL21(DE3).IPTG 诱导融合蛋白表达,Western blot 鉴定表达产物.进行蛋白表达的可溶性鉴定,并优化诱导时菌液的A600值、IPTG 浓度、诱导时间和温度4 个表达条件.然后用优化的条件大量诱导表达ComE 融合蛋白,采用镍柱和分子筛两步法进行纯化.结果:经PCR、双酶切反应以及测序鉴定,重组质粒中的插入序列为comE基因的全长片段(753 bp),无碱基的突变与读码框架的偏移.Western blot 证实表达产物确为6×His-ComE 融合蛋白,相对分子质量约为33 000.目的蛋白在上清和沉淀中均有表达,且当A600 为0.4 时,加入IPTG 至终浓度0.10 mmol/L,37 ℃诱导4 h后表达量最大.结论:成功构建pET28a(+)-comE 原核表达载体,用优化后的6×His-ComE 融合蛋白在E. Coli BL21(DE3) 中的表达条件,获得纯化的变形链球菌ComE 融合蛋白.     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :在大肠杆菌中表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因 (glucanbindingproteinB ,gbpB) ,并对重组蛋白进行初步纯化 ,为下一步制备多抗和进行相关的研究奠定基础。方法 :将克隆到的gbpB全长编码区基因克隆到表达载体 pPROEXTMHTb ,构建表达质粒 pPROEXTMHTb - gbpB ,以大肠杆菌E .coliBL2 1(DE3)为宿主菌进行诱导表达 ,表达产物经镍 -次氮基三乙酸 (Ni-NTA)柱进行亲和层析纯化。结果 :工程菌经IPTG诱导 3h后 ,在SDS -PAGE上出现一条新的蛋白条带 ,相对分子量 (Mr)为 4 .5～ 5 .0× 10 3 ,以可溶形式存在 ,经Ni-NTA柱纯化后获得纯度较高的重组葡聚糖结合蛋白B。结论 :获得Mr为 4 .5～ 5 .0× 10 3 的重组葡聚糖结合蛋白B     

变形链球菌表面蛋白P1的提取纯化

目的：探索高效率、条件温和的方法分离纯化有黏附活性的变形链球菌表面蛋白P1,为进一步分析表面蛋白P1生物学特性奠定实验基础。方法：硫酸铵分级沉淀法提取变形链球菌表面蛋白P1粗提物,在AKTAexDlorer100快速纯化工艺开拓系统中采用SepharoseXL填料（强阴离子交换剂）分离纯化变形链球菌表面蛋13P1。通过黏附抑制实验检测蛋白的黏附活性。结果：蛋白乡电化后SDS—PAGE电泳可见分子量约185kD的单一蛋13条带。该蛋白可明显抑制变形链球菌在唾液包被羟基磷灰石表面的黏附（P〈0．05）。结论：运用硫酸铵分级盐析沉淀粗提变形链球菌表面蛋白,在AKTAexplorer100快速纯化工艺开拓系统中采用强阴离子交换层析可获得较高得率的、保持黏附活性的纯化P1蛋白。     

变形链球菌基因在埃希氏大肠杆菌中的克隆与表达

本研究在掌握 DNA 重组克隆技术的基础上,分离变链菌目的基因 DNA 片断,在体外与大肠杆菌载体 DNA 连接,将重组的 DNA 分子引入受体细胞,从分子水平上了解变链茵的致龋机制。     

变形链球菌表面蛋白PAc的原核表达及纯化

目的：对在大肠杆菌中表达重组变形链球菌表面蛋白抗原PAc的培养条件进行优化,制备高纯度重组蛋白rPAc。方法：载体构建原核表达载体pET20b（＋）-AP对不同培养基、诱导浓度,温度和时间等进行筛选确定最佳条件,采用亲和层析分离纯化rPAc蛋白。结果：含原核表达载体pET20b（＋）-AP的大肠杆菌在LB培养基中培养至A600—0．6时,终浓度为1mM的IPTG诱导,30℃继续振荡培养4h,可使rPAc的表达量达到最大。分离纯化的蛋白在SDSPAGE中显示为单一条带。结论：对PAcA～P区的重组质粒pET20b（＋）-AP表达的rPAc经纯化后可用于动物免疫,为探索防龋DNA疫苗pCIA—P的新型免疫策略奠定必要的物质基础。     

变形链球菌pac基因在乳链球菌中的表达

为了分析变形链球菌ｐａｃ基因在乳链球菌中的表达，采用抗ＰＡｃ抗体点免疫印迹分析，测定基因重组乳链球菌ＨＬ１０７（ｐＬＦ１０７）产生的表面蛋白ｒＰＡｃ含量。结果显示，ＨＬ１０７细胞均化物和培养物上清液中均可测出ｒＰＡｃ，含量为变形链球菌细胞均化物中测出量的１／６。乳链球菌无质粒对照菌株未测出ｒＰＡｃ。这一结果证实了克隆化基因ｐａｃ在乳链球菌中的表达，提示基因重组乳链球菌克隆的成功。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段在大肠杆菌中的表达

目的原核表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因(glucan-bindingproteinCgene,gbpC)特异片段。方法将克隆获得的约0.45kb的gbpC基因特异片段经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy1-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白GST-GbpCE,SDS-PAGE检测表达产物。结果在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白质条带,其相对分子质量约为43000,与预计大小相符合。结论成功表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpCE,可用于制备GbpC抗体。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的：克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因（Glucan-binding protein C gene,gbpC）编码序列的特异片段,并在大肠杆菌中实现原核表达。方法：根据gbpC序列设计并合成一对寡核苷酸引物,PCR扩增位于gbpC编码序列1342bp～1794bp间的一段特异片段,扩增产物经回收、酶切后,定向插入克隆载体puc18中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定。将克隆获得的约0．45kb的gbpC基因特异片段经EcoRI／SalI双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1／gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达融合蛋白GST-GbpC^E,SDS-PAGE检测表达产物。结果：测序结果与Sato等报道的序列一致;原核表达后,在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白条带,其相对分子量约43000,与预计大小相符合。结论：成功克隆并表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpC^E,为制备GbpC抗体打下了基础。     

釉成熟蛋白amelotin在大肠杆菌中的表达和纯化

目的:观察釉成熟蛋白(amelotin)基因聚合酶链反应产物在大肠杆菌中的表达,并获得纯化的釉成熟蛋白.方法:利用His融合蛋白表达载体pET32a(+)转化大肠杆菌BL21,通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,并改变诱导时间、温度、IPTG浓度来优化表达条件,然后在优化的条件下进行大量表达并收菌;His镍柱纯化表达的蛋白.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白表达、纯化情况.结果:电泳结果分析表明:amelotinPCR扩增产物在大肠杆菌中获得高效表达,大小约4×104,纯化得到的amelotin纯度较高.结论:成功得到纯化的amelotin,为进一步制备抗体奠定基础.     

变形链球菌表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ提取方法的改良

变形链球菌表面蛋白质抗原Ⅰ／Ⅱ提取方法的改良杜民权樊明文边专张平汪喻忠变形链球菌具有多种表面蛋白质抗原，其中分子量为１８５０００的表面蛋白质抗原Ⅰ／Ⅱ在细菌粘附过程中起着重要作用。它存在于细胞壁的表面，在细菌生长过程中分泌到上清液中。我们用改良方法从...     

变形链球菌表面蛋白真核表达载体pcDNA3-PAc的构建——Ⅰ.质粒DNApPC41和pcDNA3的提取与纯化

目的:从大肠杆菌克隆子中提取和纯化质粒DNApPC41和pcDNA3。方法:采用碱裂解法将质粒DNA从菌体细胞中分离出来,进一步用聚乙二醇沉淀法、透析袋电洗脱法、低溶点胶回收法、玻璃纤维柱层析法纯化质粒DNA。用分光光度法测其A260、A280值,确定其浓度和纯度。通过酶切分析确定其质粒大小。结果:4种方法获得的质粒DNA浓度为0.12～0.24g/L,聚乙二醇沉淀法、透析袋电洗脱法、低溶点胶回收法和玻璃纤维柱层析法的A260/A280比值依次为1.9、2.2、2.2、2.6。酶切鉴定质粒pPC41大小为10.6kb,pcDNA3大小为5.4kb。结论:4种方法均能有效地从大肠杆菌克隆子中提取和纯化得到质粒DNA。其中玻璃纤维柱层析法获得的质粒DNA纯度最高,是获取高纯度质粒DNA的有效方法之一。     

小鼠牙本质涎磷蛋白在大肠杆菌的表达和纯化

目的：在大肠杆菌中表达牙本质涎磷蛋白,并对重组蛋白进行纯化,为进一步制备抗牙本质涎磷蛋白抗体和功能研究奠定基础。方法：构建ＤＳＰＰ－ ｐＰｒｏＥＸＨＴｃ 表达载体,重组子以大肠杆菌ＢＬ２１ 为宿主细胞进行诱导表达,表达产物经镍－ 次氮基三乙酸（Ｎｉ－ ＮＴＡ）柱进行亲和层析纯化。结果：工程菌经２０ｈ 诱导后,在ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ上出现一条新的蛋白带,Ｍｒ１０７ ×１０３ 左右,经Ｎｉ－ ＮＴＡ 柱纯化后获得纯度为９５ ％ 的小鼠牙本质涎磷蛋白。结论：获得Ｍｒ １０７×１０３ 的牙本质涎磷蛋白。     

变形链球菌牙面粘附唾液受体的筛选和纯化

目的：筛选和纯化变形链球菌血清型ｃ（简称变链）的牙面粘附唾液受体。方法：用全唾液包被羟基磷灰石形成实验性获得性膜（ＳＡＰ）,后用１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ和０．５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液分步洗脱,再用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５分子筛层析和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５离子交换层析对ＳＡＰ组分进行分离纯化,用细菌粘附实验和细菌粘附竞争抑制实验筛选受体,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,等电聚焦电泳,淀粉酶活性测定等     

变形链球菌的葡萄糖基转移酶的分离和纯化

选用AHT(a)、MTA6R(C)、LM7(e)3种菌株作实验,对其所产生的葡萄糖基转移酶的分离和纯化方法进行探讨。细菌培养物上使用硫酸铵盐析,得葡萄糖基转移酶的粗酶;再用40％和55％乙醇沉淀,分别得水溶性和非水溶性葡萄糖基转移酶粗酶,再将MT6R菌的55％乙醇沉淀提取的酶进行羟基磷灰石层析,得两个蛋白吸收峰,第一、二两峰分别是纯化的非水溶性和水溶性葡萄糖基转移酶,经圆盘电泳鉴定,前者为均一的,后者为非均一的。     

柱层析法纯化变形链球菌表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ的研究

用硫酸铵沉淀、阴离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析从变形链球菌培养上清液中提取、纯化了表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ(简称抗原Ⅰ/Ⅱ),该抗原能与特异性抗抗原Ⅰ/Ⅱ血清发生免疫学沉淀反应;SDS-PAGE显示纯抗原Ⅰ/Ⅱ为单一蛋白区带,分子量为190546 d;Lowry法测定蛋白质含量为0.8mg/ml;氨基酸组成分析表明丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸含量较多,酸性氨基酸占24.1％,碱性氨基酸占11.4％,表明蛋白质的等电点偏低。     

柱层析法纯化变形链球菌表面蛋白质抗原Ⅰ／Ⅱ的研究

用硫酸铵沉淀，阴离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析从变形链球菌培养上清液中提取，纯化了表面蛋白质抗原Ⅰ／Ⅱ，该抗原能与特异性抗原Ⅰ／Ⅱ血清发生免疫学沉淀反应。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B的纯化

目的：从变形链球菌S.mutans Ingbritt(serotype c)培养液上清中纯化葡聚糖结合蛋白B。方法：Sephadx G-200凝胶（α-1,6键葡聚糖）亲和层析和Q－SephroseFF离子交换层析。结果：纯化出约10μg具有葡聚糖结合特性的GbpB蛋白。结论：通过Sephadx G-200凝胶（α-1,6键葡聚糖）亲和层析和Q－Sephrose FF离子交换层析纯化出变链菌葡聚糖结合蛋白B。