16S rRNA基因序列在分枝杆菌分类鉴定的研究进展

16S rRNA基因序列高度保守,其核苷酸位点的变化具有种的特异性,用分子生物学技术分析16S rRNA基因,能够将分枝杆菌鉴定到种的水平.本文就用16S rRNA基因进行PCR扩增、DNA直接测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析、DNA探针杂交来鉴定分枝杆菌进行综述.     

54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列分析

目的分析54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列,为临床分离株的鉴定提供参考。方法用16S rRNA序列分析法对54株分枝杆菌国际参考株进行分析,构建系统发育树,计算相似性百分比。结果除11株（共9种4组）分枝杆菌,即产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌;溃疡分枝杆菌与海分枝杆菌;堪萨斯与胃分枝杆菌;3株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌16S rRNA基因序列完全相同无法相互鉴别,其它41株（共41种）分枝杆菌菌种间16S rRNA均不相同可以得到很好的鉴别。结论 16S rRNA基因序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法,国际参考株16S rRNA基因序列的研究弥补了基因数据库的不足。     

54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列分析

目的分析54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列,为临床分离株的鉴定提供参考。方法用16S rRNA序列分析法对54株分枝杆菌国际参考株进行分析,构建系统发育树,计算相似性百分比。结果除11株(共9种4组)分枝杆菌,即产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌;溃疡分枝杆菌与海分枝杆菌;堪萨斯与胃分枝杆菌;3株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌16S rRNA基因序列完全相同无法相互鉴别,其它41株(共41种)分枝杆菌菌种间16S rRNA均不相同可以得到很好的鉴别。结论 16S rRNA基因序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法,国际参考株16S rRNA基因序列的研究弥补了基因数据库的不足。     

不同分子生物学方法快速鉴别非结核分枝杆菌的应用评价

目的 评价3种分子生物学方法快速鉴定非结核分枝杆菌的优缺点.方法 收集41株临床分离的非结核分枝杆菌,以16S rRNA基因测序方法为标准,同时以hsp65基因测序方法及PCR-RFLP方法鉴定菌株,与16S rRNA基因测序结果进行比较.结果 41株非结核分枝杆菌16SrRNA基因测序结果:9株龟分枝杆菌复合群,7株偶发分枝杆菌,7株胞内分枝杆菌,3株鸟分枝杆菌,3株堪萨斯分枝杆菌复合群,3株耻垢分枝杆菌,3株土分枝杆菌,2株草分枝杆菌,2株无色分枝杆菌,1株瘰疬分枝杆菌,1株M.arupense.与16S rRNA基因测序相比较,hs65 PCR-RFLP能鉴定9株龟分枝杆菌复合群至亚种脓肿分枝杆菌,3株堪萨斯分枝杆菌复合群鉴定至亚种堪萨斯分枝杆菌;1株偶发分枝杆菌及1株无色分枝杆菌与其不符;其余菌株鉴定结果一致,符合率为95.1%(39/41).hsp65基因测序结果显示,1株爱尔兰分枝杆菌与16S rRNA测序结果不符,其余菌株鉴定结果与其一致,符合率为97.6%(40/41),并且能进一步将9株龟分枝杆菌复合群鉴定至亚种脓肿分枝杆菌,3株堪萨斯分枝杆菌复合群鉴定至亚种堪萨斯分枝杆菌.结论 3种方法均能快速鉴定非结核分枝杆菌.与16S rRNA基因测序相比,hsp65基因测序及hsp65 PCR-RFLP更容易鉴定临床最常见非结核分枝杆菌(如堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌),可在临床推广使用.     

3株马赛分枝杆菌的分离鉴定及特征分析

摘要:目的：报告对临床分离的3株马赛分枝杆菌的种型鉴定和特征分析。 方法：对3株临床分离株进行生化鉴定、16S rRNA和rpoB基因测序鉴定,用微量肉汤稀释法进行药敏实验。 结果：生化鉴定无法确定种型,且光滑型/粗糙型菌落差异明显;16S rRNA鉴定结果显示,其与龟-脓肿分枝杆菌群高度同源（相似度>99.7%）,联合rpoB基因测序分析可鉴定为马赛分枝杆菌;药敏试验结果显示,其对万古霉素、利奈唑胺、头孢西丁等耐药,其中粗糙型菌耐药性更强。 结论：马赛分枝杆菌是近年来出现的新型致病菌,其粗糙型感染应予以重视。     

常见分枝杆菌种内不同株之间16S rRNA基因和16S-23SrRNA ITS序列分析结果的比较

目的 针对常见分枝杆菌不同株对其基因序列进行分析,比较分析结果.方法 利用16S rRNA Gene和16S-23S rRNAITS(转录间隔区序列)分析法分别对97株共7种DSMZ/ATCC引进的常见分枝杆菌进行种内不同株之间基因差异性分析,对比两种分型结果的异同.结果 16S rRNA基因可将13株草分枝杆菌分为3...     

21株快速生长分枝杆菌的鉴定与特征

目的 对临床分离的21株快速生长分枝杆菌进行种型鉴定和特征分析。方法 对广东省中医院2010～2015年收集的21株快速生长分枝杆菌进行传统的表型形态学鉴定,16S rRNA基因和ropB基因测序鉴定和微量肉汤稀释法的药敏试验,结合光滑/粗糙型变异分析其菌型特征和耐药性。结果 21株分离株均为血平板上7天内生长良好的抗酸阳性菌,经16S rRNA基因和ropB基因测序鉴定均为分枝杆菌。根据生长的菌落特性,12株为光滑型,7株为粗糙型,2株为中间型。涂制湿片显示,12株光滑型分枝杆菌和2株中间型分枝杆菌均能在生理盐水表面形成一层漂浮的油脂(可能为分枝菌酸)。药敏试验显示,快速生长分枝杆菌对阿米卡星、头孢西丁、克拉霉素的敏感性较好。统计学分析显示,粗糙型具有比光滑型菌株更高的耐药性。结论 快速生长分枝杆菌可分为光滑型、粗糙型和中间型3种菌落表型,其中油脂飘浮现象能用于中间型和光滑型分枝杆菌的快速鉴定。     

分枝杆菌特殊DNA序列检测及其在分类鉴定中的应用进展

分子生物学技术已应用于分枝杆菌菌种快速鉴定。目前分子鉴定靶序列主要有四种 :即hsp6 5基因、dnaj基因、16SrRNA基因、16S 2 3SrDNA间隔区序列。其他一些序列如IS6 110、mce基因内 45 3bp重复序列、SenX3 RegX3IR、mtp40、DT1/DT6 ,属于种特异性或群特异性DNA序列。本文对这些DNA序列在分枝杆菌鉴定应用进行综述     

分枝杆菌特殊DNA序列检测及其在分类鉴定中的应用进展

分子生物学技术已应用于分枝杆菌菌种快速鉴定，目前分子鉴定靶序列主要有四种：即hsp65基因，dnaj基因16SrRNA基因，16S－23SrDNA 间隔区序列，其他一些序列如IS6110，mce基因内453bp重复序列，SenX3-RegX3 IR,mtp40,DTI/DT6,属于种特异性或群特异性DNA序列，本文对这些DNA序列在分枝杆菌鉴定应用进行综述。     

非结核分枝杆菌菌种ITS-PCR测序鉴定法与表型鉴定法对比观察

目的评价16S～23S rRNA基因转录间隔区聚合酶链反应(ITS-PCR)在非结核分枝杆菌(NTM)菌种鉴定中的临床价值。方法采用ITS-PCR鉴定随机抽取的80株NTM,应用生长特性鉴定试验及鉴定性药物敏感性试验鉴定其表型特征,将3种鉴定方法所示结果进行对比分析。结果 80株NTM中,鸟-胞分枝杆菌复合群(MAC)与脓肿分枝杆菌共占85%,运用ITS-PCR可将脓肿分枝杆菌、堪萨分枝杆菌、偶发分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌准确鉴定,与生长特性鉴定试验及鉴定性药物敏感性试验结果基本符合;MAC采用3种方法鉴定其结果符合率存在偏差。结论 NTM ITS-PCR鉴定法与表型鉴定法相结合更适合临床应用。     

MALDI-TOF MS鉴定分枝杆菌的可靠性及潍坊地区分枝杆菌菌种分布

目的 评估分枝杆菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定与多靶位基因测序结果的一致率，为MALDI-TOF MS鉴定分枝杆菌的临床应用提供理论依据，进一步了解当地的分枝杆菌菌种分布。方法 将潍坊市第二人民医院2016年7月到2017年10月期间经MALDI-TOF MS（生物梅里埃公司）鉴定的751例分枝杆菌菌株进行RNA聚合酶β亚基（rpoB）、热休克蛋白65（hsp65）、16S rRNA 基因的部分序列测序，以3个靶基因联合鉴定的结果作为“金标准”，评估MALDI-TOF MS对分枝杆菌鉴定的准确度，同时分析近5年临床分离的6350株分枝杆菌MALDI-TOF MS鉴定的菌种分布情况。结果 以rpoB、hsp65、16S rRNA测序鉴定结果为参考，MALDI-TOF MS（生物梅里埃公司）对结核分枝杆菌复合群鉴定的准确率为99.66%，对非结核分枝杆菌（non-tuberculosis Mycobacteria，NTM）鉴定的准确率为97.40%。近5年潍坊地区临床分离的分枝杆菌中NTM占15.51%，NTM种类主要为缓慢生长型（90.46%），其中胞内分枝杆菌占比最高（73.20%），其次为堪萨斯分枝杆菌（12.08%）；快生长型分枝杆菌以脓肿分枝杆菌为主（64.90%）。结论 MALDI-TOF MS鉴定分枝杆菌结果可靠，具有重要的临床应用价值；潍坊地区NTM以胞内分枝杆菌为主。     

4株威克汉姆无绿藻的鉴定及基因特征分析

目的对临床分离的4株无绿藻进行菌种鉴定和基因特征分析。方法对临床分离的4株酵母样微生物进行培养特性和形态学特征分析,商品化Vitek 2细菌鉴定系统(配套YST卡)和MALDI-TOF MS微生物鉴定系统鉴定;PCR扩增其16S rRNA基因和28S rRNA基因,并进行系统发育分析,以确定其分类学地位。结果该4株微生物在沙保氏葡萄糖琼脂培养基上培养3 d可形成灰白色、光滑、湿润的"酵母样真菌"菌落;光镜下观察可见大量圆形、卵圆形或椭圆形的孢子囊,且其内含内孢子,形似桑葚状或草莓状,与酵母菌的菌体形态差异显著;Vitek YST和MALDI-TOF MS系统,均鉴定为威克汉姆无绿藻。该4株微生物同时存在代表原核生物的16S rRNA基因以及代表真核生物的28S rRNA基因,其中,16S rRNA基因序列与威克汉姆无绿藻相似度最高,在99.7%以上;28S rRNA基因经克隆测序发现其存在多拷贝,且同一菌株不同克隆序列之间相似度在91.9%～100%。16S rRNA基因和28S rRNA基因系统发育分析均显示,该4株微生物与威克汉姆无绿藻聚类在同一个分枝。结论该4株微生物可鉴定为威克汉姆无绿藻,且单拷贝的小亚基16S rRNA更适合作为其菌种鉴定的靶基因。     

痰标本中金黄色葡萄球菌的分离鉴定方法研究

目的：探索一种基于16S rRNA 基因的细菌快速鉴定方法,为临床标本中未知病原菌的诊断提供新的方法思路。方法对1份临床发热伴呼吸道症候群患者的痰标本进行分离培养,获得3种不同的菌落。直接以纯菌落为模板,以通用引物扩增未知菌的16S rRNA 基因片段,产物直接测序后进行基于局部比对算法的搜索工具比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果3种菌落分别为不易致病的表皮葡萄球菌、龋齿罗特放线菌及致病性的金黄色葡萄球菌,后者继续用特异性引物扩增检测鉴定,确认为金黄色葡萄球菌。结论本研究建立了一种利用16S rRNA 基因扩增快速鉴定临床标本中未知病原菌的简便方法。     

应用16S rRNA基因序列分析鉴定从痰培养中分离的假肺炎链球菌

目的对含有革兰阳性球菌的痰培养分离出的草绿色链球菌样菌落进行16S rRNA基因序列分析与质谱鉴定,探讨16S rRNA基因序列分析与质谱在临床病原菌鉴定方面的意义。方法将分离的菌株采用奥布托辛(OP)试验、Vitek MS质谱鉴定以及16S rRNA基因测序进行鉴定。结果OP试验结果在5%CO2气体环境中抑菌圈直径为15mm,在大气中培养抑菌圈直径为25mm。Vitek MS质谱鉴定显示为假肺炎链球菌,可信度99.9%。16S rRNA基因测序鉴定结果显示该菌与肺炎链球菌的相似度为99.63%,与假肺炎链球菌的相似度更高为99.75%。结论结合表型鉴定结果,可进一步确定分离株为假肺炎链球菌。     

16S rRNA 测序鉴定1株条件致病性人苍白杆菌

目的：探索一种基于16S rRNA 基因的细菌快速鉴定方法,为临床未知病原菌的诊断及治疗提供科学依据。方法对临床患者的痰标本分离培养纯菌落,直接以菌液为模板,以通用引物 PCR 扩增未知菌的16S rRNA 基因片段,产物直接测序。将测序结果进行 BLAST 比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果未知病原菌经本实验鉴定为人苍白杆菌,经 ABI 细菌快速鉴定板条检测,确认结果一致。结论该研究简化了临床标本未知病原菌分离培养鉴定的步骤,建立了一种利用16S rRNA 基因扩增快速鉴定病原菌的简便方法。     

16S rDNA序列在艾伯特埃希菌鉴定中的应用

目的 通过16S rRNA基因序列分析快速鉴定艾伯特埃希菌。方法 以30株疑似艾伯特埃希菌为材料,使用通用引物扩增其16S rRNA基因并进行测序。获得的序列与艾伯特埃希菌型菌株LMG 20976,基因组测序菌株KF1、NBRC107761、TW07627以及其他密切相关的细菌种(大肠埃希菌、赫曼埃希菌、费格森埃希菌、志贺菌和Shimwellia blattae)的16S rRNA基因序列进行比较,并使用N-J法构建进化树来分析其相关性。结果 30株疑似艾伯特埃希菌的16S rRNA基因序列与艾伯特埃希菌参考菌株的序列相似性最高,并与其聚类为一簇,为艾伯特埃希菌。结论 16S rRNA基因测序分析可用于艾伯特埃希菌的快速鉴定。     

基于16S rRNA和gyrB基因的施万菌种水平鉴定分析

目的 构建基于16S rRNA和gyrB基因对施万菌(Shewanella)进行种水平鉴定的方法,比较2个基因的鉴定能力差异.方法 利用DnaSP 6.0软件对施万菌16S rRNA和gyrB基因的信息位点数及其百分比、核苷酸多态性值、平均G+C含量、非同义突变率与同义突变率的比值(Ka/Ks)、Tajima检验进行基...     

多位点PCR技术用于四川267株分枝杆菌临床分离株的鉴定

目的 初步了解四川省肺结核患者分枝杆菌菌种类型。 方法 收集267株分枝杆菌临床菌株,经PNB/TCH鉴别培养基进行培养鉴定后,采用聚合酶链反应(PCR)对16S rRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8和Rv3120 基因位点进行扩增,鉴定至种,再经PRA-rpoB、hsp65基因测序进行验证。 结果 267株分枝杆菌临床分离株多位点PCR结果显示结核分枝杆菌262株,非洲分枝杆菌Ⅰ型3株,非结核分枝杆菌2株。PNB/TCH鉴别培养基培养鉴定结果为结核分枝杆菌复合群266株,非结核分枝杆菌1株。2株非结核分枝杆菌分别为鸟分枝杆菌(M. avium)和脓毒分枝杆菌(M. septicum)。多位点PCR结果与rpoB-PRA、hsp65基因测序结果一致。 结论 多位点PCR技术鉴定分枝杆菌菌种结果准确可靠,且具有简便和快速等优点,有较大的分子流行病学应用价值,且对于临床诊断和治疗都具有重要意义。     

基于DPO的四重荧光PCR检测常见分枝杆菌方法的建立与应用

目的 利用多重荧光PCR技术,建立一种快速、准确、特异的检测常见分枝杆菌的方法.方法 以分枝杆菌16S rRNA作为检测靶基因,设计双启动寡核苷酸(DPO)引物和TaqMan探针,探针的5’端分别用FAM 、ROX、HEX和JOE进行荧光标记,3’端标记淬灭荧光.通过对4种分枝杆菌标准株基因组DNA的扩增,评价多重荧光PCR方法的特异性和灵敏度.采用建立的多重荧光PCR方法,采用该方法检测2010年6至12月杭州市红十字会医院68例结核科住院患者清晨痰液标本,结果与细菌培养和抗酸染色镜检进行比较.采用x2检验比较3种方法的阳性率.结果 该方法可准确、特异地鉴定结核分枝杆菌和3种常见非结核分枝杆菌,检测灵敏度均为1 ×101 cfu/ml.对68份痰液标本进行检测,结果显示31份检测结果阳性,阳性率45.6％,明显高于涂片染色镜检(阳性率14.7％),差异具有统计学意义(x2=15.4,P ＜0.05),其中28例为结核分枝杆菌,1例为鸟分枝杆菌,2例为胞内分枝杆菌,与细菌培养鉴定方法一致.1例培养阳性而PCR检测结果阴性标本经16SrRNA扩增测序鉴定为龟分枝杆菌.结论 本研究建立的多重荧光PCR方法敏感、特异、快速,能有效检测结核分枝杆菌和常见非结核分枝杆菌,可用于分枝杆菌感染者的实验室快速诊断.     

1例生痰二氧化碳嗜纤维菌的实验室鉴定及药敏试验

目的全面鉴定1株尿毒症患者血液中分离的生痰二氧化碳嗜纤维菌。方法用血培养仪对尿毒症患者静脉血标本进行需氧和厌氧培养,分离培养阳性培养物,用生化鉴定卡进行生化鉴定,用质谱分析及16S rRNA基因序列分析进行补充鉴定,并用E-test法进行药敏试验。结果该菌为革兰阴性长梭状杆菌,常规方法无法鉴定至种。结合质谱分析及16S rRNA基因序列分析结果,鉴定为生痰二氧化碳嗜纤维菌。该菌对阿米卡星最低抑菌浓度(MIC)为64μg/mL,对其他药物MIC值较低。结论质谱分析和16S rRNA基因序列分析为常规方法无法鉴定至种的细菌鉴定提供了可靠依据,成功将本例细菌鉴定为生痰二氧化碳嗜纤维菌。