人血管内皮生长因子B的重组腺病毒制备与鉴定

血管内皮生长因子Ｂ(ＶＥＧＦ Ｂ)是一种近年来发现的血管内皮生长因子家族的新成员 ,结构与ＶＥＧＦ较为相似 ,能竞争性地与ＶＥＧＦ的受体之一ＶＥＧＦＲ 1结合〔1〕。研究表明 ,尽管ＶＥＧＦ Ｂ广泛存在于多种组织 ,但以心肌和骨骼肌为主。在胎儿发育期及缺血缺氧条件下 ,ＶＥＧＦ Ｂ在心肌中的表达量显著升高〔2〕。笔者认为 ,ＶＥＧＦ Ｂ可能对心肌缺血区的血管再生起着积极的促进作用 ,而该方面的研究国内外均未见报道。本研究在获取人ＶＥＧＦ Ｂ( 186)基因的基础上构建成ＶＥＧＦ Ｂ腺病毒重组粘粒 ,为研究其在心肌缺血区基因转染后…     

携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒对大鼠局灶性脑缺血治疗的实验研究

目的 :观察携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒 (Ad_HGF)对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用。方法 :建立大鼠局灶性脑缺血动物模型。携带人肝细胞生长因子基因的穿梭质粒与携带复制缺陷的人血清 5型腺病毒基因组的质粒在 2 93细胞进行同源重组 ,构建Ad_HGF。携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒 (Ad_GFP)载体注射到局灶性缺血大鼠的缺血侧侧脑室 ,观察其在脑内的表达部位和持续时间。动物给药治疗后 3d ,取大脑 ,平均切成 4片 ,用TTC染色评价Ad_HGF对缺血的治疗效果。结果 :Ad_GFP仅在大鼠双侧侧脑室壁及脑室内的脉络膜细胞表达 ,表达持续两周左右 ;Ad_HGF治疗组动物大脑缺血区明显小于非治疗组动物 (P <0 .0 5 )。结论 :Ad_HGF能显著缩小大鼠局灶性脑缺血区。     

同源异形盒Gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建同源异形盒Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠Gax基因,将Gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的B J5183细菌,经细菌内同源重组产生携带Gax基因的重组腺病毒载体pAd-Gax,经限制性内切酶BstⅨ和PacⅠ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带Gax基因的重组腺病毒Ad-Gax。利用GFP的表达鉴定Ad-Gax。结果:构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010pfu/L。结论:成功地构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

miR-195重组腺病毒表达载体构建及在细胞中的表达

目的:利用AdEasy系统构建miR-195的腺病毒表达载体,为研究miR-195的功能提供条件.方法:将miRNA-195前体序列从已构建的pcDNA-miR-195载体中克隆进穿梭载体pAdTrack-CMV,通过与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中高效同源重组,获得完整的重组腺病毒质粒.利用HEK293细胞包装并扩增重组腺病毒Ad-195.Ad-195感染肺癌细胞A549后,利用miRNA的定量RT-PCR技术检测Ad-195在细胞中表达miR-195情况.随后荧光素酶报告基因实验证明,Ad-195表达的miR-195能够作用于BCL2基因上预测的miR-195靶位点.结果:实时定量PCR检测显示,Ad-195感染肺癌细胞A549后,miR-195表达水平有显著的上调.结论:miR-195的腺病毒表达载体构建成功,能够用于在细胞内过表达具有生物学功能的miR-195.     

双标记基因质粒（pSVneo—gpt）DNA的重组

利用基因转移技术,将受到损伤的重组DNA分子导入哺乳动物细胞中,观察受损的外源DNA分子在细胞中的修复和表达情况,是研究细胞DNA损伤修复过程的一种新的实验手段。实验室通常用的重组DNA分子只带有单个选择标记基因,当用于上述实验时,尤其是要比较不同细胞的DNA修复效率,因受到基因转移效率、未被修复或错误修复的受损标记基因不能正确表达等因素的影响,使实验结果出现一定的误差。本试验将选择标记基因gpt和neo重组到一个质粒DNA分子中,这样在以后的研究中,可以用限制性内切酶等损伤其中一个标记基因,再将质粒     

重组腺病毒Ad-huVEGF121的制备

目的：构建能够用于骨缺血研究的能表达huVEGF121的重组腺病毒载体。方法：将huVEGF121克隆至穿梭质粒，线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，通过观察绿色荧光监测病毒产生，免疫组化检测VEGF121表达。结果：成功的将hu—VEGF121克隆至穿梭质粒pTrack—CMV，正确构建了重组腺病毒质粒，感染293细胞得到大量病毒。结论：成功构建了huVEGF121重组腺病毒，为缺血性骨病的进一步研究奠定了基础。     

9例鼻咽癌患者局部注射重组人5型腺病毒效果观察

随着环境污染严重及一些其他有害因素的不断增多,使鼻咽癌发病率明显升高。我科于2008年3月至2009年12月对9例单侧鼻咽癌的患者在放疗、化疗的同时使用了重组人5型腺病毒注射液,利用电子内镜导管系统进行局部瘤体注射治疗,获得了较好的效果,现将结果报道如下。     

脑红蛋白重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的：为进一步研究脑红蛋白（NGB）的生理功能并为基因治疗缺血性脑损伤提供有效的表达载体，应用细菌内同源重组方法分别构建含NGB及绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体，并对其进行鉴定。方法：用电转方法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌，制备BJ5183-pAdEasy-l细菌，再以后者作为电感受态细菌，与线性化质粒pShuttle-CMV-NGB进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-NGB，转染293细胞。制备含脑红蛋白基因的重组腺病毒。结果：通过PCR、序列测定和Western印迹杂交鉴定，确认该重组腺病毒表达载体可正确表达脑红蛋白。结论：成功地构建了表达NGB基因的重组腺病毒载体，为深入开展脑红蛋白的功能研究以及用于缺血性脑损伤疾病的基因治疗奠定了基础。     

重组腺病毒mIκBα基因联合γ射线治疗肝细胞癌的实验观察

目的 探讨重组腺病毒mIkBα基因（AdmIkBα）联合γ射线对人高转移性肝细胞癌HCC9204细胞和裸鼠HCC9204移植瘤生长的影响。方法利用有限稀释法测定病毒滴度，以不同感染复数（MOI）的AdIxBαm（10、20、30、50）转染HCC9204细胞，Westemblotting法检测转染前后细胞1：）65表达和mIxBa表达。采用4Gyγ射线对各组细胞进行治疗。MTT法检测转染组、转染组＋放射组、对照组细胞生长抑制率。建立裸鼠HCC9204肝癌动物模型，肿瘤局部注射AdmIkBα30MOI并联合6Gyy射线治疗，在不同时间测量肿瘤体积。结果病毒滴度1．252×10^9pfu／ml。mIkBa蛋白随AdmlteBa剂量增加而进行性增加，P65蛋白随AdmIkBα剂量的增加呈进行性递减。转染组体外细胞生长随AdmIkBα剂量的增加逐渐受抑制，经7射线照射后生长抑制更加明显。AdmIkBα转染和放射联合治疗后7～28d，裸鼠肿瘤生长速率明显低于单纯照射组、单纯转染治疗组。结论AdmIkBα转染联合Y射线治疗可增强对肝痛细胞杀灭作用．联合治疗明品优于单纯放疗组和单纯基因治疗组。     

人Toll样受体2胞外区基因重组腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含有人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的重组腺病毒载体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增TLR2胞外区全长基因,克隆人pMD18-T载体并经测序验证后,通过KpnⅠ和HindⅢ双酶切将目的 片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中.将构建止确的重组质粒pAdTrack-CMV-TLR2用Pme Ⅰ酶切线性化后转化感受态AdEasier-1细菌,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒.将鉴定正确的重组质粒pAd-TLR2经PacⅠ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞中进行包装并扩增病毒.观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并测定病毒滴度,用PCR法鉴定重组腺病毒.结果 RT-PCR扩增得到的目的 基因片段与GenBank中的序列一致,经酶切鉴定及PCR检测证实携带人TLR2胞外区全长基因的重组腺病毒制备成功,获得高滴度(3×109pfu/ml)的重组腺病毒.结论 成功制备了表达人TLR2胞外区基因的重组腺病毒,为后续研究奠定了基础.     

铜绿假单胞菌外毒素A表达载体的构建及可溶性表达

目的 实现铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)全基因的可溶性表达。方法 用基因重组技术构建pMAL-PEA原核分泌型表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,然后利用直链淀粉树脂对表达蛋白进行亲和层析纯化。结果 酶切鉴定及测序结果表明pMAL-P2X载体上成功地插入了PEA全基因。用IPTG诱导目的基因表达,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的20％。表达产物经超声处理后,80％的融合蛋白存在于上清液中,说明实现了PEA的可溶性表达。表达的融合蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳,显示为一条蛋白带,分子量约为112kD。结论成功地对PEA全基因进行了可溶性表达和纯化,获得了稳定表达的工程菌,为深入研究：PEA的致病机制和制备用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础。     

pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒的构建

目的 构建pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒,并进行鉴定。方法提取Wistar乳鼠大脑组织总RNA,逆转录合成cDNA,经PCR扩增UCH-L1基因,定向克隆至载体pEGFP-N1,构建重组质粒,经测序进行鉴定。结果 UCH-L1基因重组质粒经测序鉴定证明构建正确。结论成功构建了UCH-L1基因重组质粒,可用于神经细胞转染,进行后续研究。     

SPECT心肌灌注显像对糖尿病心肌缺血损伤的研究

近年来糖尿病和冠心病发病率逐年增高,糖尿病可使患者患动脉粥样硬化和心血管疾患尤其是冠心病的危险性大大增加。糖尿病患者总死亡率的75%与冠心病有直接关系。SPECT心肌灌注显像可早期发现糖尿病患者中潜在的心肌缺血患者,对糖尿病患者进行危险度分级、预后和疗效判断,为临床制定治疗方案提供重要依据。     

运动平板试验诊断无症状心肌缺血的临床价值

 目的 评价运动平板试验（treadmill exercise testing,TET）检出冠心病无症状心肌缺血(slient myocardial ischemia,SMI)的诊断价值。方法 对经动态心电图检查拟诊为SMI患者145例进行TET及冠状动脉造影(coronary angiography,CAG）检查,并以后者作为判定标准,计算TET诊断SMI的敏感性、特异性、准确性指数、阳性预测值及阴性预测值。结果 TET检出SMI的敏感性为89.3%,特异性为67.2%,准确性为80.0%,阳性预测值为78.9%,阴性预测值为82.0%。多支冠脉病变患者的运动平板试验阳性率与单支病变患者的对比差异无统计学意义(P>0.05)。女性运动平板试验假阳率高于男性(P <0.01)。结论 检出SMI的特异性较低,但敏感性较高,能较准确评价SMI 的缺血情况。     

经肝动脉插管注射重组腺病毒的体内基因转染效率及“靶向性 …

目的　将动脉插管方法应用于重组腺病毒 (Ad .LacZ)介导的标记基因体内导入 ,观察标记基因在大鼠内脏中的转染效率和维持时间。方法　 9组大鼠 ,7组于胃十二指肠动脉分别注入Ad .LacZ[2× 10 9pfu/ml(空斑形成单位 /ml) ]各 1ml,2组注入单纯培养液各 1ml,7组实验组分别于 12h、18h、72h、7d、14d、2 1d、2 8d取动物的肝、脾、肺和肾脏 ,2组对照组于 7d取上述脏器 ,采用 β 半乳糖苷酶 (X Gal)染色方法检测LacZ基因在各个脏器的表达。结果　实验组于 12h取材 ,经染色LacZ基因在肝脏中即有表达 ,而此时脾、肺、肾等内脏器官尚未见表达 ;此后 ,18h、72h、7d、14d直至 2 1d该基因在肝脏仍有表达 ,而在其他脏器如脾、肺及肾表达仅维持 14d。对照组动物各个脏器皆无染色。结论　经动脉途径注入重组腺病毒 ,其体内的表达具有器官靶向性。如经此途径注入治疗性的目的基因重组腺病毒 ,其于肝脏表达产物出现时间早 ,并且持续时间较长。本实验结果为将来应用插管方法进行肝病基因治疗奠定了理论基础     

Effect of combined treatment of radiation and tissue-specific recombinant oncolytic adenovirus on bladder cancer cells

Purpose: Gene therapy combined with radiation has shown promising potential for the treatment of tumors. This paper aimed to clarify the synergistic effect of radiotherapy combined with the bladder cancer tissue-specific oncolytic adenovirus (Ad-PSCAE-UPII-E1A) on bladder cancer cells and to study the underlying synergy mechanisms of the combined treatment.

Materials and methods: The Adenovirus carrying E1A under control of UPII promoter and prostate stem cell antigen enhancer (PSCAE) were successfully constructed. The viability of bladder cancer cells BIU-87 and EJ was determined by MTT assay. The apoptotic assay was demonstrated by flow cytometry and TEM. Virus titer was determined by TCID50 assay, and proteins Mre11, Chk2-Thr68, and E1A were analyzed by Western blot method.

Results: Oncolytic adenovirus combined with radiotherapy improved antitumor efficacy compared with the single treatment at a time and was X-ray dosage-dependent. When the adenovirus infection was scheduled at 24?h after irradiation, cancer cells had the lowest viability. Adenovirus and irradiation induced cell death through the caspase-3 related apoptotic pathway, and bladder cancer cells were arrested at the G1 (BIU-87) or S phase (EJ). Autophagic vacuoles were observed in bladder cancer cells treated with radiation and adenovirus. After irradiation, more virus particles were observed in the BIU-87 and EJ cells. However, by a TCID50 assay, there was no difference in virus titter between irradiated bladder cancer cells and unirradiated cells. The proteins Mre11, Chk2-Thr68 which involved in the DNA break repair pathway were decreased while γ-H2AX-Ser139 increased; at the same time, the E1A gene and the hexon proteins of oncolytic adenovirus were increased after irradiation.

Conclusions: Our results proved synergistic antitumor effect of adenovirus Ad-PSCAE-UPII-E1A and radiation, which might be a potential therapeutic strategy for bladder cancer.     

心血通胶囊对犬急性心肌缺血的影响

目的：观察收血通胶囊对实验性犬急性心肌缺血的影响,为进一步临床研究提供理论依据。方法：心血通胶囊经消化道给药后,采用心外膜标测和定量组织学硝基四氮唑蓝染色法,测定心肌梗塞范围及损伤程度。结果：心血中明显减轻由心外膜电图所标测的心肌缺血程度（∑－ＳＴ）及心肌缺血范围（Ｎ－ＳＴ）;明显减小通过Ｎ－ＳＴ染色所显示的梗塞区。结论：心血通对犬急性心肌缺血有明显的改善作用。     

核素心肌灌注显像诊断代谢综合征心肌缺血的研究

目的评估代谢综合征（Ms）患者心肌缺血及相关危险因素,探讨核素心肌灌注显像诊断冠心病的价值。方法140例住院患者分为3组：MS组（82例）,高血压病组（EH组,38例）,2型糖尿病组（T2DM组,20例）。3组均又分为运动负荷组和静息组,采用单光子发射计算机断层核素心肌灌注显像（SPECT MPI）的方法检测各组心肌缺血情况。结果MS组心肌缺血率为81．7％,重度缺血率为56．8％,均高于其他两组（P〈0．05）。核素检查运动负荷组缺血率为81．7％,明显高于静息组（P〈0．01）。BMI、腹围、血TG、血HDL-C与缺血有相关性。结论与EH组和T2DM组患者相比,MS组患者心肌缺血率和严重程度最高;其中MS某些组分与心肌缺血密切相关;心肌核素检查用于诊断早中期心肌缺血、判断中度危险的冠心病有临床价值。     

气溶胶发生对质粒DNA损伤的研究

目的：采用气溶胶吸入方式对呼吸道进行基因转移有可能成为呼吸系统疾病基因治疗的一种重要的基因转移方法：本项工作应用于基因治疗的功体主要包括病毒和质粒，研究了质粒ＤＮＡ耐受气溶胶发生的能力。方法：采用ＴＫ－２型气溶胶发生器对带有Ｅ．ｃｏｌｉＬａｃＺ报告基因的ｐＣＭＶβ质粒水溶液进行气溶胶发生实验，采用电泳，ＣＯＳ－７细胞转染和细菌质粒转化等方法检测，分析回流液及采样液中质闰的损伤情况，结果：当喷雾压力     

异丙酚对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤时心肌c-fos基因表达的影响

目的观察异丙酚对离体大鼠全心缺血再灌注损伤心肌c-fos基因表达的影响,探讨其对缺血再灌注损伤心肌保护作用机制。方法Wistar大鼠36只,随机分为对照组和异丙酚组,每组又分为缺血前、缺血30min和复灌30min3个亚组。通过离体心肌灌注模型,采用免疫组化及RT-PCR观察心肌c-fos蛋白及c-fo smRNA表达水平的变化。结果与缺血前相比,缺血30min及再灌注30min亚组的c-fos蛋白的光密度值及c-fos mRNA表达水平均增加（P〈0．01）;与对照组相比,异丙酚各亚组的c-fos蛋白光密度值及c-fos mRNA表达水平均降低（P〈0．01）。结论c-fos基因参与了心肌缺血再灌注损伤的基因调节。异丙酚可减轻心肌c-fos基因的表达,并可避免或减轻心肌缺血再灌注损伤。