肺癌组织细胞中CHFR基因表达水平及其启动子甲基化状态

目的：探讨CHFR（checkpoint with FHA and ring finger）基因表达水平及其启动子CpG岛甲基化状态与肺癌发生发展的关系。方法：实时定量PCR法检测CHFRmRNA在45例肺癌组织、23例癌旁组织与去甲基化剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷处理前后A549细胞株中的表达,同时用甲基化特异性PCR检测CHFR启动子CpG岛甲基化状态。结果：CHFRmRNA在癌旁组织中全部表达,在肺癌组织中表达缺失率为15．56％（7／45）,且表达量低于正常肺组织,F=9．156,P〈0．01;但在不同年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度和肿瘤分类中的差异无统计学意义,P〉0．05。CHFR基因启动子在肺癌组织中发生甲基化的频率为22．22％（10／45）,在癌旁组织未发生甲基化,χ^2=5．992,P〈0．05。10例启动子区甲基化的肺癌标本中,7例同时伴有mRNA表达缺失。结论：CHFR启动子甲基化可在肺癌发生和发展中起一定作用。     

FHIT基因甲基化检测对肺癌早期诊断的临床意义

目的探讨人原发性肺癌中FHIT基因启动子区的甲基化状态及其临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链技术（MSP）,对59例人原发性肺癌组织（肺癌组）、32例肺正常组织（正常组）、15例癌旁组织（癌旁组）及11例支气管鳞状化生组织进行FHIT基因5’-CpG岛甲基化状况检测,甲基化阳性标本采用基因克隆测序技术进行序列测定。结果肺癌组、癌旁组和正常组的FHIT基因甲基化率分别为37．3％（22／59）、20．0％（3／15）、0（0／32）,三组相比差异有统计学意义（P〈0．01）;支气管鳞状化生组织的甲基化阳性率为18．1％（2／11）。FHIT基因甲基化率肺癌吸烟者与非吸烟者差异无统计学意义（P〉0．05）。FHIT甲基化扩增产物测序结果显示,所有CpG岛中的胞嘧啶均保持不变,而CpG岛二核苷酸以外的胞嘧啶经过PCR扩增后,则被胸腺嘧啶取代。结论FHIT基因5’-CpG岛甲基化参与了肺癌的演变,可能在肺癌发生的早期阶段,采用MsP方法进行FHIT甲基化检测,可能对肺癌的早期诊断具有一定的临床意义。     

FHIT基因5''''CpG岛甲基化及与其失活的关系

目的：探讨胃肠癌细胞株FHIT基因甲基化状态及与其失活的关系。方法：用甲基化特异性PCR（methylation—specific PCR，MSP）检测7个肿瘤细胞株的FHIT基因甲基化状态，然后应用去甲基化试剂5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’deoxycytine，5-Aza—CdR）处理MKN-28细胞及HCT1116细胞，应用RT-PCR检测药物处理前后FHIT基因mRNA的表达状态。结果：7个肿瘤细胞株有6个检测到FHIT基因5’CpG岛甲基化；经5-Aza—CdR处理后MKN-28细胞的FHIT基因mRNA重新表达。结论：FHIT基因5’CpG岛的甲基化引起FHIT基因的表达缺失，与胃肠癌的发生密切相关。     

肺癌E-cadherin基因启动子CpG岛甲基化与蛋白表达的关系及其意义

背景与目的：目前认为CpG岛甲基化导致转录抑制是恶性肿瘤发生的重要机制之一.E-cadherin能抑制肿瘤细胞的浸润和转移,被公认为是浸润、转移抑制基因.本研究检测肺癌组织中E-cadherin基因启动子CpG岛甲基化的状况,并探讨基因异常甲基化与蛋白表达的关系及其意义.方法：采用甲基化特异性PCR技术,检测22例肺癌组织,相应的癌旁组织和9例正常肺组织中E-cadherin基因启动子CpG岛甲基化的状况.采用免疫组化S-P法相应检测了E-cadherin蛋白的表达.结果：肺癌中E-cadherin基因启动子CpG岛完全甲基化率为13.6%（3/22）,部分甲基化率为27.3%（6/22）,总甲基化率为40.9%（9/22）,显著高于相应癌旁组织中该基因的甲基化率9.1%（2/22） （P＜0.05）.9例正常肺组织中未检测到此基因的甲基化（0/9）.22例癌组织中E-cadherin蛋白表达减弱或缺失率59.1%（13/22）,显著高于相应癌旁组织蛋白表达减弱缺失率27.3%（6/22）.肺癌组织中发生甲基化者蛋白表达率及强度明显低于未甲基化者.结论：肺癌组织中存在E-cadherin基因启动子CpG岛的异常甲基化,E-cadherin基因启动子CpG岛的异常甲基化可能是E-cadherin蛋白表达下调的主要原因.     

非小细胞肺癌中FHIT基因异常甲基化对其蛋白、mRNA表达的影响

背景与目的 脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)是一种新的抑癌基因,其启动子甲基化在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用.本研究的目的 是通过检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中抑癌基因FHIT启动子CpG岛异常甲基化和蛋白、转录表达情况及其相互关系,探讨FHIT基因在NSCLC发生发展中的作用.方法 应用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)、免疫印迹(Western Blot)及RT-PCR测定52例NSCLC组织及其癌旁正常组织(>5 cm)中FHIT的甲基化、蛋白表达和转录水平.结果 NSCLC癌组织中FHIT甲基化率为38.46%(20/52),在癌旁正常组织中FHIT甲基化率为7.6996(4/52),两者差异存在统计学意义(P<0.05);癌组织中FHIT蛋白表达率为28.8%(15/52),癌旁正常组织FHIT蛋白表达率为88.5%(46/52),两者差异存在统计学意义(P=0.000);FHIT mRNA在癌组织中表达率为51.9%(27/52),在癌旁正常组织中全部表达,且表达量明显高于癌组织(P=0.000).结论 在NSCLC中,FHIT基因启动子甲基化频率明显升高,其蛋白表达率明显下降,mRNA表达率下降,提示FHIT启动子甲基化在肺癌的发生和发展中起着一定作用,而且FHIT基因的甲基化与蛋白及mRNA的表达存在一定的关系.     

肺癌E-cadherin基因启动子CpG岛甲基化的研究

目的检测肺癌组织、相应的癌旁组织及正常肺组织中E-cadherin基因启动子CpG岛甲基化水平，探讨肺癌的发病机制。方法采用甲基化特异性PCR技术检测22例肺癌组织、相应的癌旁组织和9例正常肺组织中E-cad-herin基因启动子CpG岛甲基化水平。结果肺癌中E-cadherin基因启动子CpG岛完全甲基化率为13.6%（3/22），部分甲基化率为27.3%（6/22），总甲基化率为40.9%（9/22），显著高于相应癌旁组织中该基因的甲基化率9.1%（2/22）。9例正常肺组织中该基因未发生甲基化。此外，E-cadherin基因启动子CpG岛异常甲基化与患者性别、年龄无关，甲基化的发生率随着肿瘤的分期早晚有上升的趋势。结论E-cadherin基因启动子CpG岛的异常甲基化是肺癌发生中的常见分子事件，可能参与了肺癌的发生发展过程。     

胃癌BRCA1基因甲基化与BRCA1 mRNA表达的关系研究

目的：探讨乳腺癌易感基因1（BRCA1）启动子CpG岛甲基化与BRCA1 mRNA表达的相关性及其意义。方法采用甲基化特异性PCR技术检测37例胃癌组织和对应癌旁组织及6例正常胃组织中BRCA1基因启动子CpG岛甲基化状态;采用逆转录PCR技术检测37例胃癌组织和对应癌旁组织及6例正常胃组织中BRCA1 mRNA 表达水平。结果胃癌组织中 BRCA1基因启动子 CpG 岛总甲基化率为48.6%（18/37）,显著高于癌旁组织[5.4%（2/37）]和正常胃组织[0.0%（0/6）],差异有统计学意义（χ2=17.541、5.021,P均〈0.05）。胃癌组织中BRCA1 mRNA阳性表达率为48.6%（18/37）,显著低于癌旁组织[94.6%（35/37）]和正常胃组织[100.0%（6/6）],差异有统计学意义（χ2=19.215、5.520,P均〈0.05）。BRCA1基因启动子CpG岛甲基化与BRCA1 mRNA表达成负相关（ r=-0.515,P〈0.05）。结论 BRCA1基因启动子CpG岛甲基化可能是导致BRCA1 mRNA失表达的主要原因之一。     

HHIP基因CpG岛高甲基化水平参与胃癌的发生

目的：观察人胃癌、癌旁组织与胃癌AGS细胞中人音猬因子相互作用蛋白（human hedgehog interacting protein,HHIP）基因启动子区域CpG岛的甲基化水平,探索其与胃癌发生的关系。方法：RT-PCR检测30例人胃癌组织、癌旁组织及AGS细胞中HHIP mRNA的表达,免疫组织化学方法和甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）分别检测胃癌组织和癌旁组织的HHIP表达和HHIP基因启动子区域甲基化状态。AGS细胞予甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycitydine,5-Aza-dc）处理前后,RT-PCR、MSP和硫化测序PCR（bisulfite sequencing PCR,BSP）分别检测AGS细胞中HHIP mRNA表达、启动子区域甲基化水平变化、CpG岛甲基化位点数量的变化;分析HHIP基因启动子区CpG岛甲基化水平变化与HHIP mRNA表达水平变化之间的相关性。结果：胃癌组织中的HHIP mRNA（0.82± 0.38 vs 1.60±0.26,P=0.000）和蛋白（0.51±0.03 vs 0.83±0.27,P<0.05）的表达均低于癌旁组织,并且与年龄、性别、TNM分期、分化程度、淋巴结转移均无显著相关性（均P>0.05）。癌旁组织中HHIP基因启动子区甲基化水平显著低于胃癌和AGS细胞\[（17.7±3.59）% vs （62.9±614）%、（99.7±0.67）%,均P<0.05\]。AGS细胞在5-Aza-dc干预后HHIP mRNA表达明显增高（4.68±022 vs 0.21±012,P<0.01）,HHIP基因启动子区甲基化水平明显下降\[（10.1±0.21）% vs （90.2±0.67）%,P<0.01\], CpG岛甲基化位点明显减少,并且HHIP基因启动子区甲基化水平与mRNA表达呈负相关（r=-0.693,P=0.00）。结论：HHIP基因启动子区CpG岛的高甲基化水平可能通过抑制HHIP基因表达参与胃癌的发生。     

PTEN基因甲基化及其表达异常与胃癌的关系

目的：探讨PTEN基因表达、启动子区甲基化与胃癌及其临床病理特征的关系。方法：采用甲基化特异性PCR法（MSP）和逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法，分析胃癌组织及相应癌旁正常组织中PTEN基因启动子区甲基化及其mRNA表达情况。结果：48．2％（27／56）的胃癌组织和3．6％（2／56）的癌旁胃组织PTEN基因启动子区发生甲基化．癌组织PTEN基因启动子区甲基化率显著增高（P〈0．05）：其中，2例甲基化癌旁胃组织均为胃癌组织中有甲基化的病例．发生淋巴结转移的29例胃癌组织中．19例PTEN基因启动子甲基化；发生淋巴结转移的PTEN基因启动子甲基化显著高于无淋巴结转移组（P〈0．05）。RT—PCR结果显示，所有甲基化的胃癌组织中PTEN mRNA均无表达，结论：胃癌中PTEN基因mRNA失表达与其启动子区甲基化有关，这可能是胃癌发生、发展以及转移的原因之一。     

胃癌环氧化酶-2 、hMLH1 及hMSH2 微卫星不稳定与基因调控的关系

 目的 检测临床手术切除43例胃癌及相应正常组织COX-2、hMLH1和hMSH2微卫星不稳定状态MSI及三种基因启动子甲基化情况，并进一步探讨它们与胃癌发生的关系。方法 采用聚合酶链反应（PCR）技术检测5个位点的MSI状态；甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR，MSP）方法检测胃癌及正常组织COX-2、hMLH1及hMSH2三种基因启动子CpG岛甲基化状态。结果 43例胃癌中MSI总检出率为48．84％（21／43），五个位点的MSI检出率无显著差别。COX-2和hMLH1基因启动子CpG岛甲基化在43例胃癌中分别有8例和13例，正常组织中未检测到。hMSH2基因启动子CpG岛在胃癌及正常组织中均未检测到甲基化。在MSI-H组hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率显著高于MSS组（P〈0．01）；而在MSI-H和MSI-L组间以及MSI-L和MSS无差别。MSI-H组中COX-2基因启动子CpG岛甲基化8例，且有7例胃癌同时出现hMLH1和COX-2基因启动子CpG岛甲基化。结论 在MSI胃癌（尤其是MSI-H型胃癌）的发生、发展过程中可能同时出现了hMLH1和COX-2基因启动子CpG岛的甲基化（即表型遗传修饰）。MSI胃癌hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率高于MSS胃癌，提示检测hMLH1基因启动子CpG岛甲基化对于判断肿瘤类型有一定意义。     

肺鳞癌、腺癌中p14 ARF基因启动子区甲基化及蛋白表达的研究

背景与目的 p14^ARF基因是新近发现的抑癌基因，其异常表达与多种人类肿瘤发生有关，启动子区异常甲基化作为p14^ARF基因失活的重要形式可能参与了肿瘤的发生。本研究通过检测肺鳞癌、腺癌中p14^ARF启动子区甲基化状态和蛋白表达，探讨p14^ARF启动子区甲基化与肺癌的关系。方法 通过免疫组织化学（IHC）、甲基化特异性PCR（MSP）和相关限制性内切酶PCR（RF-PCR）方法，检测40例肺鳞癌、腺癌组织中p14^ARF启动子区甲基化状态和蛋白表达水平。结果 癌组织及癌旁正常组织中p14^ARF启动子区甲基化阳性率分别为17．5％（7／40）和2．5％（1／40）（P-0．025）。RE-PCR检测结果相同。癌组织及癌旁正常组织中p14^ARF蛋白阳性率分别为70．0％（28／40）和95．0％（38／40）（P-0．003）。p14^ARF基因启动子区甲基化和蛋白表达均与肿瘤分期、组织类型、分化程度、淋巴结转移等临床病理特征无明显关系（P＜0．05）。p14^ARF启动子区甲基化与蛋白表达呈负相关（r=-0．56，P=0．001）。结论 启动子区甲基化是p14^ARF基因失活的重要机制。p14^ARF启动子区异常甲基化可能参与了非小细胞肺癌的发生，是肺癌发生过程的早期事件。     

5' CpG island methylation of the FHIT gene is correlated with loss of gene expression in lung and breast cancer

Allele loss and loss of expression of fragile histidine triad (FHIT), a putative tumor suppressor gene located in chromosome region 3p14.2, are frequent in several types of cancers. Tumor-acquired methylation of promoter region CpG islands is one method for silencing tumor suppressor genes. We investigated 5' CpG island methylation of the FHIT gene in 107 primary non-small cell lung cancer (NSCLC) samples and corresponding nonmalignant lung tissues, 39 primary breast carcinomas, as well as in 49 lung and 22 breast cancer cell lines by a methylation-specific PCR assay. In addition, we analyzed brushes from the bronchial epithelium of 35 heavy smokers without cancer. FHIT methylation was detected in 37% of primary NSCLCs, 31% of primary breast cancers, and 65% of lung and 86% of breast cancer cell lines. The frequency of methylation in small cell and NSCLC cell lines were identical. Methylation was found in 9% of the corresponding nonmalignant lung tissues and in 17% of bronchial brushes from heavy cigarette smokers. FHIT methylation was significantly correlated with loss of FHIT mRNA expression by Northern blot analysis in lung cancer cell lines and with loss of Fhit expression in NSCLC and breast tumors by immunostaining. We conclude that methylation of FHIT is a frequent event in NSCLC and breast cancers and is an important mechanism for loss of expression of this gene. Methylation of FHIT commences during lung cancer pathogenesis and may represent a marker for risk assessment.     

HYPERMETHYLATION OF p14^ARF PROMOTER REGION AND EXPRESION OF p14^ARF GENE PRODUCT IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER

Objective： This study was designed to investigate promoter methylation status and protein expression of p14^ARF gene in non-small cell lung cancer, and value the role of p14^ARF promoter methylation in carcinogenesis of non-small cell lung cancer. Methods： Promoter methylation status and protein expression of p14^ARF gene in 40 cases of non-small cell lung cancer were analyzed by methylation specific polymerase china reaction （MSP）, restriction enzyme-related polymerase chain reaction （RE-PCR） and immunohistochemistry （IHC）. Results： The positive rates of p14^ARF promoter methylation in tumor tissues and normal tissues adjacent to cancer were 17.5% （7/40） and 2.5% （1/40） respectively. There were statistically significant differences between them, P〈0.05. The results of RE-PCR were consistent with that of MSP. The expression rate of p14^ARF protein in tumor tissues was significantly lower than that in normal tissues adjacent to cancer, p〈0.01. Promoter methylation status and protein expression of p14^ARF gene in non-small cell lung cancer showed significantly an inverse correlation （r=-0.56, P〈0.01）, and both of them did not relate statistically with the clinicopathologic characteristics of patients such as histological classification, clinical stage, differentiation grade and lymph node involvement. Conclusion： Promoter methylation is a crucial mechanism of inactivation of p14^ARF gene. Promoter methylation of p14^ARF gene might he involved in carcinogenesis of non-small cell lung cancer, and is an early event in development process of non-small cell lung cancer. It might be used as a new target in gene treatments in the future.     

肝细胞癌中APC基因启动子甲基化及蛋白表达的研究

目的：探讨肝细胞癌中APC基因启动子甲基化状态及蛋白表达的临床意义。方法：应用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）和免疫组织化学方法检测61例HCC及相应的癌旁肝组织中APC基因启动子甲基化状态和蛋白表达水平,分析甲基化与临床资料及蛋白表达的关系。结果：癌组织及癌旁组织中APC基因启动子甲基化阳性率分别为26.23%和11.47%（P〈0.05）。癌与癌旁组织APC蛋白表达无统计学差异（P〉0.05）。APC基因启动子甲基化与临床分期、门脉癌栓、术后复发、肝外转移、肿瘤大小、肿瘤分化、肿瘤个数及血清AFP值无关。APC基因启动子甲基化与蛋白表达无相关性。结论：APC启动子区甲基化可能参与了肝癌的发生,但在HCC的发展中的作用仍需进一步研究。     

FHIT和p16基因甲基化与胃癌的关系研究

目的探讨FHIT和p16基因甲基化在胃癌发生发展中的作用。方法应用甲基化特异性PCR（MSP）,检测胃癌组织和正常胃黏膜组织中FHIT基因和p16基因的启动子CpG岛的甲基化状态。结果胃癌组织中FHIT和p16基因甲基化阳性率分别为51.4%和56.8%,两者的甲基化均与胃癌患者年龄、性别、Lauren分型、Borrmann分型、淋巴结转移以及TNM分期无关（P〉0.05）,且两者的甲基化不存在明显正相关关系（P〉0.05,γ=0.17）。结论 FHIT基因和p16基因的甲基化修饰在胃癌发生发展中均起重要作用,两者可能是胃癌发生的早期事件。     

uPA基因启动子区低甲基化在鼻咽癌侵袭转移中的作用

目的探讨uPA基因启动子区低甲基化状态与鼻咽癌侵袭转移的关系。方法用甲基化特异性PCR及RT－PCR法检测分析鼻咽癌及鼻咽部慢性炎症组织中uPA基因甲基化状态及其基因表达情况,分析uPA基因低甲基化与鼻咽癌侵袭转移的关系。结果58例鼻咽癌组织中有51例为uPA基因低甲基化,其余7例为高甲基化,而鼻咽部慢性炎症组织中uPA基因均为高甲基化;低甲基化的鼻咽癌组织中均见uPA mRNA强表达,而高甲基化的鼻咽癌和鼻咽部慢性炎症组织中仅见uPAmRNA弱表达或无表达。结论鼻咽癌中uPA基因的高表达与其基因启动子区低甲基化有关,uPA基因低甲基化可能与鼻咽癌的侵袭转移有关。