自体骨髓间充质干细胞心肌移植后的分化及存活

背景:骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后是否能迁移、分化及存活,目前尚不清楚.目的:观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后,在体内的迁移、分化及其存活.方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,体外DAPI标记细胞.结扎兔左前降支制作急性心肌梗死模型,造模成功后30只新西兰大耳兔抽签法分为骨髓间充质干细胞组和对照组,每组15只.骨髓间充质干细胞组于冠状动脉结扎后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射自体骨髓间充质干细胞.对照组于相同部位注射等量生理盐水.每点注射体积30 μL.分别于移植后10 min,3 d,4周时各组各处死5只动物.取心脏行冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI标记骨髓间充质干细胞的分布情况;免疫荧光法检测标记细胞是否表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ和α-肌动蛋白.结果与结论:DAPI标记的骨髓间充质干细胞在兔急性心肌梗死模型心脏微环境中,蓝色细胞核分布广泛,呈椭圆形,似心肌细胞核,其排列方向与宿主心肌纤维方向一致,间接免疫荧光法检测胞浆心肌特异性蛋白肌钙蛋白Ⅰ、α-肌动蛋白均为阳性.说明缺血心肌内移植入骨髓间充质干细胞,可在局部微环境的刺激下向心肌细胞定向分化.     

细胞间接触诱导大鼠骨髓间质干细胞向平滑肌细胞的分化

背景:干细胞能够分化为血管平滑肌细胞,参与动脉粥样硬化发生、发展,其机制尚不清楚。“环境诱导分化学说”认为细胞-细胞接触、细胞因子可能在干细胞分化过程中起关键作用。骨髓间质干细胞具有向平滑肌细胞分化的潜能。目的:体外诱导骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞,观察已分化成熟平滑肌细胞及细胞因子对骨髓间质干细胞分化的影响。设计:以细胞为观察对象的重复观察测量,对照性体外实验。单位:西安交通大学第一医院心内实验室。材料:实验于2003-05/2004-05在西安交通大学第一医院心内实验室完成。SD大鼠60～80g、90～110g,雌雄不限,由本校动物中心提供。PE标记小鼠抗大鼠CD34(Santa Cruz),PE标记小鼠抗大鼠CD71(Oxford Biotechnology),FITC标记小鼠抗大鼠CD90(Oxford Biotechnology),小鼠抗人单克隆抗体SM-α-actin(NeoMarkers),小鼠抗人单克隆抗体Calponin(NeoMarkers),TRITC标记山羊抗小鼠IgG(SBA),pEGFP-N3(本实验室提供),Lipofectamine2000(Invitrogen)。方法:采用密度梯度离心和细胞贴壁法与组织贴块法分离培养骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞。通过流式细胞仪检测,平滑肌细胞抗体免疫荧光染色,鉴定骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞。将骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白,以未转染的骨髓间质干细胞为对照。骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞分条件培养:①取3代骨髓间质干细胞传至12孔培养板,培养液为低糖DMEM加骨髓间质干细胞条件培养液各半,胎牛血清浓度为0%、5%、7.5%。细胞固定后,应用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果。②将半透膜小室置于6孔培养板每一孔内,使每孔隔成内外两室。将骨髓间质干细胞在外室培养,平滑肌细胞在内室培养。以单独培养的骨髓间质干细胞为对照,胎牛血清浓度为3%、7.5%。用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果。③骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养:于骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白后24h,向每孔内加入等量的平滑肌细胞混合培养,观察细胞形态变化。以单独培养的骨髓间质干细胞为对照。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞流式细胞仪检测结果。②不同条件培养下平滑肌细胞抗体免疫荧光染色结果。结果:①免疫荧光染色示,平滑肌细胞抗SM-α-actin阳性,抗calponin阳性。骨髓间质干细胞抗SM-α-actin阳性,而抗calponin阴性。②流式细胞仪检测,骨髓间质干细胞不表达CD34,弱表达CD71,高表达CD90。③骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白持续表达约2周～3周。④加入平滑肌细胞培养液或不同浓度的胎牛血清,骨髓间充质干细胞生长良好。骨髓间充质干细胞与平滑肌细胞分层培养中,骨髓间充质干细胞生长对胎牛血清呈浓度依赖性。骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养7d后免疫荧光染色,可见绿色荧光蛋白和抗SM-α-actin、Calponin的双标细胞存在。而加平滑肌细胞条件培养液与分层培养组中骨髓间质干细胞均不表达Calponin。结论:①平滑肌细胞培养液及细胞因子只能促进骨髓间充质干细胞生长,细胞胞浆颗粒增多,并不能诱导骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞。②细胞间直接接触对诱导骨髓间质干细胞定向分化为平滑肌细胞起决定作用。     

骨髓间充质干细胞诱导心脏成纤维细胞向肌纤维母细胞转化:不同时期心肌梗死区域的最佳微环境

背景:骨髓间充质干细胞移植能够有效改善心肌梗死后的心功能,其作用机制可能与移植部位大量肌纤维母细胞的聚集有关,但至今仍缺少证据来证实聚集的肌纤维母细胞足由骨髓间允质干细胞还是由成纤维细胞转化而来?目的:观察不同时期心肌梗死微环境对人鼠骨髓间充质下细胞诱导心脏成纤维细胞向肌纤维母细胞转化的影响.方法:将培养组分为3组:大鼠骨髓间充质干细胞、心脏成纤维细胞单培养组,以及两种细胞共培养组,加入心肌梗死后不同时期心肌匀浆干预7～28 d,并设市不加心肌匀浆的空白对照组,运用免疫细胞化学染色方法,检测不同干预组间平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及成纤维细胞转化为肌纤维母细胞数量间的差异.结果与结论:加用心肌梗死第14天梗死周边区域心肌匀浆干预的共培养组,检测到心脏成纤维细胞转化为肌纤维母细胞的阳性率最高.提示心肌梗死后微环境下,骨髓间充质干细胞能诱导诱导心脏成纤维细胞转化为肌纤维母细胞,而心肌梗死后14 d的心肌梗死微环境是骨髓间充质干细胞诱导心脏成纤维细胞转化为肌纤维母细胞的最佳微环境.     

荷瘤兔骨髓间充质干细胞在射频消融自体血清诱导下向肝样细胞的分化

目的:鉴于目前对体外培养诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的条件掌握尚不成熟,尤其是无血清培养.实验拟将临床常用微创治疗同细胞移植结合,观察荷瘤兔骨髓间充质干细胞在射频消融兔肝肿瘤自体血清诱导下向肝样细胞的分化,寻求一种自体肝组织的修复方法.方法:实验于2006-09/2007-09在西安交通大学医学院中心实验室完成.实验室为教育部基因与环境研究重点实验室.[1]实验材料:健康新西兰大白兔,二三月龄,雌雄不限,体质量1.5～2.0kg,由西安交通大学医学院动物试验中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.荷瘤种兔包块由西安交通大学第一医院介入中心刘亚民教授馈赠.[2]实验方法:取荷瘤种兔瘤组织块,在兔在肝脏右叶做一直径为2~3mm的隧道,将肿瘤组织块植入隧道底部制备肝肿瘤动物模型.射频消融治疗灭活荷瘤兔肝脏肿瘤及边缘1cm正常肝脏组织,于72h后取全血及骨髓.应用体外细胞培养技术自骨髓血中分离、纯化兔骨髓间充质干细胞后,取P2细胞在4种不同培养基培育:对照组:含体积分数为0.1胎牛血清的低糖DMEM培养液;射频兔肝肿瘤治疗血清组:无血清低糖DMEM培养液加入射频兔肝肿瘤治疗血清;射频肝肿瘤治疗血清热灭活组:无血清低糖DMEM培养液加入射频肝肿瘤治疗灭活血清;生长因子组:含0.1胎牛血清的低糖DMEM培养液加入肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子.[3]实验评估:倒置显微镜下观查细胞形态变化,流式细胞仪测定细胞周期并观察其增殖及生长特征,免疫荧光法检测肝细胞标志物白蛋白及CK18表达,鉴定细胞性质及功能.结果:[1]原代、传代培养及流式细胞仪结果显示,射频肝肿瘤治疗兔血清及肝细胞生长因子、表皮生长因子对兔骨髓间充质干细胞的诱导能明显促进细胞的增殖,S G2 M期细胞百分数明显增高,2周后免疫荧光染色可见分化细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白.[2]射频肝肿瘤治疗兔灭活血清及胎牛血清能使兔骨髓间充质干细胞生长,但不如射频肝肿瘤治疗兔血清及肝细胞生长因子、皮细胞生长因子促进细胞增殖明显(P<0.01),传代培养2周,细胞形态未见明显变化,未见肝细胞标志物CK18和白蛋白表达.结论:肿瘤射频消融兔血清可激活、诱导自体骨髓间充质干细胞增殖并向肝样细胞分化,使射频消融肿瘤治疗的同时行肝样细胞移植修复肝损伤成为可能.     

小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化的研究

目的应用小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化。方法利用2／3肝部分切除术后36h小鼠再生肝组织浸出液定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态，应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经小鼠再生肝浸出液诱导7d后，呈肝细胞样圆形，1～2周后免疫荧光染色可见细胞表达肝细胞标记物CK8、CK18和清蛋白。结论小鼠再生肝浸出液可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞方向分化。     

胎儿肠壁结缔组织诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞

背景:间充质干细胞具有多向分化能力,在体外能诱导分化为上皮细胞,而胚胎原始消化管上皮的分化受肠壁间充质的诱导.肠壁结缔组织能否诱导骨髓间充质干细胞分化形成上皮细胞,尚不明确.目的:观察胎儿肠壁结缔组织能否诱导骨髓间充质干细胞分化形成上皮细胞.设计:体外培养,对比观察.单位:实验于2004-07/2006-07在重庆医科大学组织胚胎学教研室完成.材料:表皮生长因子为Sigma公司产品:CK,CK20为中山生物有限公司产品.收集四五个月流产胎儿标本6例的四肢骨髓,Ficoll离心,分离、培养、扩增获取骨髓间充质干细胞.取胎儿十二指肠乳头以下肠段,剥去肌层和外膜,酶消化去除上皮,剪成约15 mmx5 mm的组织块.胎儿标本由临床学院妇产科提供,产妇同意提供胎儿用于实验,实验经医院伦理委员会批准.方法:实验分4组进行:干细胞移植组和干细胞移植 表皮生长因子组分别将DAPI标记的第3代骨髓间充质干细胞(3×104)个移植于肠壁结缔组织块的黏膜下层表面:干细胞组和干细胞 表皮生长因子组为骨髓间充质干细胞爬片:其中干细胞移植 表皮生长因子组和干细胞 表皮生长因子组加入终浓度为10 μg/L表皮生长因子;4组均体外培养12 d.主要观察指标:①用荧光显微镜观察DAPI标记的骨髓间充质干细胞的形态及分布.②干细胞移植组和干细胞移植 表皮生长因子组组织块培养12 d后,采用苏木精-伊红染色观察与荧光显微镜观察同一肠壁结缔组织表面细胞形态.③免疫组化染色检测标记细胞CK及CK20的表达,以及肠学结缔组织是否表达表皮生长因子.④高碘酸-希夫反应(PAS反应)检测DAPI标记细胞与结缔组织间有无基膜样物质产生.结果:①荧光显微镜下干细胞移植组和干细胞移植 表皮生长因子组的组织块表面均有DAPI标记的荧光阳性细胞.苏木精-伊红染色显示该部位细胞呈上皮样形态,而且在培养时经多次换液末被洗去为长在结缔组织表面的细胞.②免疫组织化学染色显示两组组织块表面的细胞均可表达CK及CK20.③免疫荧光染色显示组织块表面的细胞同时有标记细胞核的DAPI蓝色荧光与标记CK的红色荧光,表明DAPI标记的骨髓间充质干细胞已经分化为上皮细胞.④干细胞组细胞CK及CK20阴性,而干细胞 表皮生长因子组则为阳性,提示表皮生长因子有诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞的作用.⑤PAS反应显示在标记细胞与结缔组织之间有基膜样结构糖蛋白出现.未经培养的结缔组织组织块内有表皮生长因子表达.结论:表皮生长因子和胎儿肠璧结缔组织在体外均能诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞;肠壁结缔组织中的表皮生长因子可能是结缔组织诱导骨髓间充质干细胞分化为皮细胞的因素之一.     

聚乳酸-聚乙醇酸共聚物复合心肌样细胞体外构建工程化心肌组织

背景:研究证实,在一定的诱导条件下,骨髓间充质干细胞可能向心肌细胞等多种中胚层来源的间质细胞分化.目的:探索以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,体外构建工程化心肌组织的可行性.方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞加入含5-氮胞苷的培养液进行诱导分化,培养4周.将诱导成功后的细胞制成细胞悬液,缓慢滴注于预先制备好的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物上,培养14 d.以倒置相差显微镜观察诱导前后细胞的形态学变化,免疫荧光染色法鉴定诱导后骨髓间充质干细胞中心肌特异性肌钙蛋白l的表达,大体观察工程化心肌组织在培养期间的形态,透射电镜观察工程化心肌组织的超微结构.结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞14 d形成集落,传代细胞体积变大,5-氮胞苷诱导后细胞呈长梭形,呈一致性生长.免疫荧光染色结果显示诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ.透射电镜可见肌丝、Z线样物质.结果证实,以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,可于体外构建出类似天然心肌的工程化心肌组织.     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化

背景:骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议.目的:体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力.方法:分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化.另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周:单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10 μg/L 转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照.结果与结论:小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达.小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24 h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约70%的细胞呈阳性,RT-PCR显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和CD34.提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化前后离子通道基因表达的变化

目的:观察体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化前后某些离子通道mRNA表达的变化,以进一步探讨离子通道在骨髓间充质干细胞增殖和向心肌细胞分化中的作用。方法:实验于2004-12/2005-07在哈尔滨医科大学病理生理学实验室和组织与胚胎学实验室完成。实验选用Wistar大鼠,雌雄不限,体质量100～120g。分离、培养和纯化大鼠骨髓间充质干细胞,以DAPI(5mg/L)标记第三代的骨髓间充质干细胞后,采用10μmol/L5-氮胞苷诱导,于诱导后第4周做细胞免疫荧光化学检测细胞肌钙蛋白的表达。采用反转录聚合酶链反应技术检测诱导分化前后钙通道的α1c,α1D,α1G,α1H,α1S亚基;钾通道:ERG,IK1,KvLQT1和钠通道SCN5AmRNA的表达结果:①5-氮胞苷诱导后第4周细胞可见心肌细胞特异性肌钙蛋白的表达。②反转录聚合酶链反应结果显示分化后的细胞表达L-型钙通道的α1c,α1D,T-型钙通道的1G亚基和钾通道:ERG-1,Kir2.1,KvLQT-1和钠通道SCN5AmRNA的表达,与成熟心肌细胞相似。③在诱导分化前的骨髓间充质干细胞也发现了L-型钙通道的α1c亚基,ERG-1和KvLQT-1钾通道的表达。结论:骨髓间充质干细胞可被诱导分化为心肌样细胞,分化后的细胞表达形成动作电位的相关离子通道基因,进一步表明骨髓间充质干细胞可作为心肌细胞移植的种子细胞。实验观察到未分化的骨髓间充质干细胞也有L-型钙通道,ERG-1和KvLQT1钾通道的表达,推测这些离子通道可能在骨髓间充质干细胞的增殖和向心肌细胞分化中具有重要的作用。     

mdx鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及向肌细胞的诱导分化

背景:自体干细胞移植治疗可以克服异体干细胞移植治疗的局限性,但目前对于进行性肌营养不良模型mdx鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及肌分化潜能研究未见报道.目的:拟建立体外分离培养mdx鼠骨髓间充质干细胞的方法,并观察其成肌分化能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,丁2006-01/07在中山大学附属第一医院神经病学实验宅完成.材料:4～6周龄纯系雄性mdx鼠10只,购自美国Jackson实验室,饲养于中山大学北校区动物实验中心.碱性成纤维细胞生长因子和兔抗鼠MHC抗体为Chemicon公司产晶.方法:全骨髓法体外分离mdx鼠骨髓间充质干细胞,差速贴壁法纯化扩增,胰酶+EDTA消化传代.取传至第3代的细胞,按1×104/孔接种于24孔板,置于含两性霉素B、碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清的DMEM培养基中向肌细胞方向诱导分化,2周后更换为不含两性霉素B、但添加马血清的DMEM培养基继续培养2周.主要观察指标:鼠骨髓间充质干细胞形态、表面标志、生长曲线及成肌诱导分化.结果:原代培养24 h后,鼠骨髓间充质干细胞约80%贴壁生长,第3代细胞多旱梭形,形态比较均一.鼠骨髓间充质干细胞农达CD29和CD44等间质类细胞的表面分子,不表达CD11B和CD45等淋巴造血细胞的表面分子.接种后第一两天细胞处于潜伏期,第3天细胞增殖旺盛,进入对数生长期,至第4天细胞数增长一倍,第5天进入平台期.两性霉素B诱导后细胞有少量死亡,停用后更换马血清促进细胞成肌,7～10 d可见有肌管样细胞形成,免疫荧光染色可见肌管样细胞呈MHC阳性,DAPI复染后可见肌细胞内有多个细胞核.结论:在两性霉素B与马血清依次诱导条件下,体外可成功分离培养基因缺陷mdx鼠骨髓间充质干细胞,并证明其具有成肌分化潜能.     

干细胞因子促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

背景:骨髓间质干细胞体内、外均能分化为心肌细胞,但数量少且定向分化率较低。目的:探讨干细胞因子促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的作用。设计:开放性实验。单位:咸宁学院心血管疾病研究所,华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科。材料:实验于2003-10/2004-08在咸宁学院心血管疾病研究所实验中心完成。选取出生1～2d的SD新生大鼠20只,用于心肌细胞的培养。另选取清洁级成年SD大鼠25只,随机数字表法分为干细胞因子组、空白对照组,12只/组,剩余1只大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取、培养及纯化。方法:①在共培养前用4,6-联脒-2-苯基吲哚标记骨髓间充质干细胞。干细胞因子组对大鼠进行体内动员,连续5d皮下注射重组鼠干细胞因子,20μg/(kg·d),然后提取其骨髓间充质干细胞于心肌细胞培养第3天进行共培养。空白对照组皮下注射相等剂量的生理盐水,未施加任何干预的骨髓间充质干细胞于心肌细胞培养第3天进行共培养。②用数码显微摄像及免疫荧光技术分别记录和检测MHCα/β、肌钙蛋白T的表达,测定4,6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的百分率。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞生长情况。②检测4,6-联脒-2-苯基吲哚对骨髓间充质干细胞的核标记率。③拟做共培养的心肌细胞活力、纯度分析。④共培养后骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化情况。结果:①骨髓细胞悬液接种于塑料培养皿,细胞呈圆形散在分布于瓶底,24h换液后可见稀少的长梭形贴壁细胞,4d后梭形贴壁细胞开始增多,进入对数增长期,8～12d达到80%的融合。传代细胞增殖更加迅速,随着换液与传代,骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化。②4,6-联脒-2-苯基吲哚对骨髓间充质干细胞的胞核标记率为100%。③心肌细胞体外培养第3天,搏动细胞的百分比为63%,搏动频率40～60次/min。免疫细胞化学技术检测肌钙蛋白T表达的阳性细胞百分比为75%。④在共培养的第2,3天,干细胞因子组4,6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞表达MHCα/β的阳性百分率均显著高于空白对照组(P<0.01);在共培养的第3,4,5天,干细胞因子组4,6-联脒-2-苯基吲哚-骨髓间充质干细胞表达肌钙蛋白T的阳性百分率亦均显著高于空白对照组(P<0.01)。结论:干细胞因子对骨髓间充质干细胞具有明显的促增殖分化作用。     

高浓度葡萄糖诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化

目的探讨高浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化（EMT）的影响,建立大鼠腹膜间皮细胞EMT模型。方法体外培养的大鼠腹膜间皮细胞经含60、120 mmol/L葡萄糖的M199培养基分别培养48、72 h;以正常M199培养基和含120 mmol/L甘露醇的M199培养基为对照。采用相差显微镜观察细胞形态学改变,应用实时定量PCR法检测间皮细胞E-cad-herin、α-SMA、Collagen I mRNA的表达;应用Western印迹法检测E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果高浓度葡萄糖（60、120 mmol/L）刺激后,大鼠腹膜间皮细胞由典型的上皮细胞形态逐渐变为梭形及不规则形,类似肌成纤维细胞;大鼠腹膜间皮细胞α-SMA、Collagen I mRNA和α-SMA蛋白表达水平显著增加（P〈0.05）;大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA和E-cad-herin蛋白表达水平显著下降（P〈0.05）。结论高浓度葡萄糖能上调α-SMA、Collagen I表达和下调E-cadherin表达,高浓度葡萄糖诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT。     

高浓度葡萄糖诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化

目的探讨高浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化(EMT)的影响,建立大鼠腹膜间皮细胞EMT模型。方法体外培养的大鼠腹膜间皮细胞经含60、120 mmol/L葡萄糖的M199培养基分别培养48、72 h;以正常M199培养基和含120 mmol/L甘露醇的M199培养基为对照。采用相差显微镜观察细胞形态学改变,应用实时定量PCR法检测间皮细胞E-cad-herin、α-SMA、Collagen I mRNA的表达;应用Western印迹法检测E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果高浓度葡萄糖(60、120 mmol/L)刺激后,大鼠腹膜间皮细胞由典型的上皮细胞形态逐渐变为梭形及不规则形,类似肌成纤维细胞;大鼠腹膜间皮细胞α-SMA、Collagen I mRNA和α-SMA蛋白表达水平显著增加(P0.05);大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA和E-cad-herin蛋白表达水平显著下降(P0.05)。结论高浓度葡萄糖能上调α-SMA、Collagen I表达和下调E-cadherin表达,高浓度葡萄糖诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT。     

诊断超声联合微泡增强骨髓间充质干细胞归巢兔缺血心肌的研究

目的 探讨诊断超声联合微泡对经静脉移植兔骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)归巢缺血心肌的靶向能力.方法 采用密度梯度离心与贴壁法培养兔BM-MSCs,用DAPI标记细胞.完全结扎冠状动脉左前降支(LAD)法建立兔心肌梗死模型.将分离培养的BM-MSCs经静脉途径移植人心肌梗死兔体内.根据移植时是否介入超声与微泡分成单纯静脉移植MSCs组与超声辐照+微泡+MSCs组,移植后48 h荧光显微镜下观察缺血梗死区域及其周围的荧光标记阳性细胞数目,并对两组进行计数和统计学分析.HE染色观察局部缺血心肌的病理学改变.透射电镜观察心肌血管及内皮细胞情况.结果 荧光显微镜下显示超声辐照+微泡+细胞组较单纯静脉细胞移植组阳性细胞分布更为密集.单纯静脉细胞移植组与超声辐照+微泡+细胞组阳性细胞个数分别为(146.8±18.78)个和(213.2±26.5)个,差异有统计学意义(P<0.01).HE染色结果显示超声+微泡+细胞组缺血心肌及周围区心肌组织间隙可见红细胞成分漏出,而单纯细胞组无此发现.透射电镜显示在超声联合微泡的介导下,心肌血管内皮细胞间隔增大,血浆成分渗出.结论 超声联合微泡经静脉移植MSCs后能增加MSCs在缺血及周围区心肌的聚集与归巢,增强其靶向性.     

兔大腿VX2软组织肿瘤模型的建立与介入放射学研究

目的:建立软组织恶性肿瘤动物模型并探讨其在介入放射学研究中的应用价值。材料和方法:24只新西兰大白兔,一侧大腿近段种植VX2肿瘤成功后,随机分为实验A组(8只)、实验B组(8只)和对照组(8只),于肿瘤植入第15天分别给予经导管动脉内灌注化疗药物、明胶海绵颗粒和生理盐水。然后于介入治疗后第3天、第7天分别处死实验A组、B组和对照组模型兔各4只,取出肿瘤,观察3组肿瘤最大径、体积以及内部坏死百分比的差异。结果:所有模型兔大腿VX2肿瘤均有丰富的血液供应,介入治疗后,实验B组肿瘤的最大径、体积明显小于实验A组及对照组,而坏死百分比则明显高于其它两组。结论:兔大腿VX2肿瘤是一种较好的研究介入放射学治疗的实验肿瘤模型。     

白细胞介素-1β在人肾小管上皮细胞转分化中的作用及Janus激酶2抑制剂AG490的影响

目的 探讨Janus激酶2抑制剂AG490对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响. 方法 将体外培养人肾近曲小管上皮细胞株(HKCs)分为空白对照组、IL-1β(5 ng/ml)刺激组及AG490干预组(IL-1β 5 ng/ml+AG490 10 μmol/L).分别于处理后24、48、72 h收集细胞,采用免疫细胞化学染色和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测细胞角蛋白-18(CK-18)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达. 结果 正常肾小管上皮细胞内其自身标志物CK-18高表达(1.25±0.08),而α-SMA表达很少(0.17±0.01).IL-1β刺激组随刺激时间延长CK-18表达逐渐减少(24 h:0.69±0.04,48 h:0.52±0.03,72 h:0.30±0.01),而α-SMA蛋白合成逐渐增加(24 h:0.56±0.04,48 h:1.05±0.07,72 h:1.43±0.07),与空白对照组比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).AG490干预能使CK-18的表达逐渐恢复(24 h:1.07±0.07,48 h:0.93±0.06,72 h:0.83±0.06),并减弱IL-1β对肾小管上皮细胞α-SMA蛋白的诱导作用(24 h:0.33±0.01,48 h:0.52±0.01,72 h:0.61±0.04),且作用显著(均P＜0.05).免疫细胞化学染色观察结果与其一致. 结论 炎症因子IL-1β通过降低肾小管上皮细胞CK-18表达,上调α-SMA表达,促使肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞;Janus激酶2抑制剂AG490能部分阻断IL-1β对肾小管上皮细胞的促转分化作用.     

超声引导瘤内注射凝血酶对兔VX2皮下移植瘤的影响

目的探讨超声引导下瘤内注射凝血酶对实体肿瘤生长的影响。方法48只新西兰大白兔建立VX2皮下移植瘤模型,随机平均分为6组：对照组（0．9％生理盐水）;超声引导下瘤内注射凝血酶50U／ml、100U／ml、150U／ml、200U／ml和250U／ml组。在实验前1d,实验第3、14天监测凝血功能变化情况,同时三维超声观测肿瘤生长情况及肿瘤血管生成变化;处死瘤兔后,肿瘤组织行用TUNEL法检测细胞凋亡指数。结果随着浓度增高,抑瘤率及凋亡指数均增加（P〈0．05）,200U／ml与250U／ml组比较差异无统计学意义（P〉0．05）,凝血功能中纤维蛋白原（FIB）先升高后降低,凝血酶原时间（PT）、活化的部分凝血活酶时间（APTT）无明显变化。结论超声引导下瘤内注射凝血酶可抑制肿瘤生长,且具有一定的浓度依赖性,凝血功能不发生显著改变。     

Effectiveness of ozonated saline in the treatment of VX2 tumors in rabbits

Objective To investigate the efficacy, safety, and associated mechanisms of injected ozonated saline in the treatment of VX2 tumors.Methods A total of 90 rabbits bearing VX2 tumors on their left hind legs were randomly divided into three groups. The control group (A) received normal saline, while groups B and C received 20 μg/mL and 40 μg/mL O₃/O₂ ozonated saline, respectively. Rabbits were anesthetized and 2 mL of blood was drawn directly from the heart to measure serum concentrations of interleukin (IL-6) and tumor necrosis factor (TNF-α). The skin covering the VX2 tumor was cut in each rabbit and the maximum and vertical diameters of the tumors were measured under direct visualization. Several milliliters of saline, saline pre-treated with 20 μg/mL O₃/O₂, or saline pre-treated with 40 μg/mL O₃/O₂ were directly injected into the tumors of groups A, B, and C, respectively (injection volume (milliliter) =1/2 volume of the tumor, V = 1/2ab²). On days 4, 8 and 12 following treatment, 10 rabbits were randomly selected from each group for blood sample collection, and serum IL-6 and TNF-α were measured. The tumor growth rate was calculated by measuring the maximum and vertical diameters of the VX2 tumors under direct visualization. All selected rabbits were euthanized and the tumors, livers, and lungs were removed for pathological examination. The tumor necrosis rate was calculated by cutting the tumors into half along the longitudinal axis and measuring the maximum diameters of the intratumoral necrotic regions.Results The average tumor volume in the three groups increased to different degrees at each time point; however, the average tumor growth rates in groups B and C were substantially lower than that in group A, exhibiting a statistically significant difference. The difference in the tumor growth rate between group B and group C was not statistically significant. The serum concentrations of IL-6 and TNF-α increased in the three groups at each time point, with larger increases occurring in groups B and C; however, the greater increases did not reach statistical significance. Although the diameters of the necrotic areas were larger in both groups B and C than that in group A, significant differences in necrotic area diameters were only found when comparing groups A and C on days 4 and 12 following treatment.Conclusion Direct injection of different concentrations of ozonated saline into VX2 tumors significantly increased intratumoral necrosis and reduced the tumor growth rate. The associated mechanism may be partially mediated by IL-6 and TNF-α, as the serum concentrations of these molecules increased after the treatment.     

高糖对大鼠腹膜间皮细胞整合素连接激酶、结缔组织生长因子及α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

目的研究高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞(rat peritoneal mesothelial cells,RPMC)整合素连接激酶(integrin liked kinase,ILK)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的情况,为防治腹膜透析相关性腹膜纤维化提供新的思路。方法胰蛋白酶消化法原代及传代培养RPMC,经鉴定后第2代用于实验。细胞随机分组:①正常对照组;②高糖组:不同浓度的高糖(1.5%、2.5%、4.25%)作用24h;2.5%高糖分别作用RPMC12h、24h、48h、72h。实时定量PCR检测ILK及α-SMAmRNA的表达。Western印迹法检测ILK蛋白的表达。ELISA法检测细胞培养上清液中CTGF的表达。结果与正常对照组相比,高糖可刺激RPMCILK及α-SMA的表达增高(均P<0.05),高糖诱导RPMCCTGF的表达增高(P<0.05)。结论高糖可上调RPMCILK、CTGF及α-SMA的表达。ILK及CTGF参与了高糖诱导的大鼠腹膜间皮细胞腹膜纤维化过程,为防治腹膜透析相关性腹膜纤维化提供新的思路。     

透明质酸钠复合外周血间充质干细胞修复软骨缺损

背景：近几年外周血来源的间充质干细胞被重视,但并未见应用其修复软骨缺损的报道。目的：将动员后外周血来源的间充质干细胞与透明质酸钠复合后注入关节腔内,探讨修复关节软骨缺损的可行性。方法：联合应用干细胞因子及粒细胞集落刺激因子动员2月龄兔,取外周血后分离间充质干细胞,进行原代及传代细胞培养。以透明质酸钠为细胞载体材料,将它与第3代间充质干细胞混合制成细胞混悬液。于3月龄兔双膝关节股骨内外髁负重区制造软骨缺损区,随机选取10只以左膝为实验组,术后1周关节腔内注射含透明质酸钠的细胞悬液0.5mL,右膝为透明质酸钠对照组,注射透明质酸钠0.5mL,其余5只作为生理盐水对照组,每周1次,连续3次。治疗后12周时处死取材,观察缺损处修复情况、新生组织类型及有无免疫反应。结果与结论：①兔外周血中分离培养的间充质干细胞与骨髓来源的形态相似,能够进行原代培养。②膝关节内注射外周血间充质干细胞与透明质酸钠的混悬液后未见红肿等现象发生,关节活动良好。③治疗后12周时,实验组部分缺损区基本被软骨样组织填满,表面较平整光滑。但部分边界尚可见,浅层纤维化较明显。实验组的修复效果明显优于透明质酸钠对照组及生理盐水对照组。说明动员后外周血间充质干细胞与透明质酸钠的混悬液短期内对关节软骨缺损具有一定的修复作用。