多重逆转录-聚合酶链反应快速检测登革病毒及其临床应用

目的 建立登革1～4型病毒的多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)快速检测及分型方法。方法 参照登革1～4型病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物，并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性，随后对PCR反应条件进行优化，以同属于黄病毒科的黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒为对照，验证其特异性。并对2003年30份临床疑似登革患者血清标本进行了检测，阳性片段克隆测序验证扩增片段特异性。结果 采用多重PCR引物对登革1～4型病毒进行扩增，分别获得295、237、118、347bp片段，与设计相符；而黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果，30份疑似患者血标本RT-PCR扩增阳性率为83．3％(25／30)，其核酸序列与登革1型病毒柬埔寨株以及中国1997、1999年流行株GD14／97、G1305／99同源性分别为97％、97％、98％。结论 实验证明，所建立的多重PCR方法能够快速地检测和鉴定登革1～4型病毒，为登革病毒的检测及分型提供了一种方便易行的方法。     

南昌市1例输入性登革热病例的型别鉴定及基因特征

目的通过实验室检测技术分析1名输入性发热病例的病毒性病原体,并判定其型别,为临床防治提供实验室依据。方法将采集到的血标本采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time PCR)检测登革病毒核酸,使用通用引物和型特异性引物行逆转录-套式PCR扩增保守区域特异性核酸片段进行型别鉴定,通过登革病毒E基因扩增和序列测定对登革病毒进行亚型基因分型。结果病例血标本核酸经RT-PCR和逆转录-套式PCR方法鉴定为登革病毒2型(DENV-2),基因分类属于DENV-2全球型。结论该例输入性疑似登革热病例系DENV-2全球型引起。     

人副流感病毒HPIV多重RT—PCR快速检测方法的建立

目的建立快速检测人副流感病毒的多重PCR方法。方法通过查阅文献获取副流感病毒的PCR引物序列，并利用分子生物学软件对其进行评估，同时设计合成半巢式PCR引物。提取分离病毒的总RNA，以RNA抽提物为模板，一步法一次反转录扩增HPIV-1，2，3，4等4种型别的副流感病毒。以多重RT—PCR产物作为模板，用半巢式PCR进一步扩增确认。结果利用多重RT—PCR方法一次扩增出人副流感病毒的4个不同型别，条带大小分别是317、507、189和451bp，与目的片段大小一致；半巢式PCR扩增出相应的特异条带，条带大小分别是261、340、145和390bp，扩增结果与目的片段大小一致。结论人副流感病毒多重RT—PCR快速检测方法已初步建立。     

人副流感病毒HPIV多重RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立快速检测人副流感病毒的多重PCR方法。方法通过查阅文献获取副流感病毒的PCR引物序列,并利用分子生物学软件对其进行评估,同时设计合成半巢式PCR引物。提取分离病毒的总RNA,以RNA抽提物为模板,一步法一次反转录扩增HPIV-1,2,3,4等4种型别的副流感病毒。以多重RT-PCR产物作为模板,用半巢式PCR进一步扩增确认。结果利用多重RT-PCR方法一次扩增出人副流感病毒的4个不同型别,条带大小分别是317、507、189和451bp,与目的片段大小一致;半巢式PCR扩增出相应的特异条带,条带大小分别是261、340、145和390bp,扩增结果与目的片段大小一致。结论人副流感病毒多重RT-PCR快速检测方法已初步建立。     

临床标本中未知病毒基因芯片检测方法探索

目的探索可用于检测临床标本中未知病毒的基因芯片技术。方法设计合成1～4型登革病毒基因芯片探针,制备成登革病毒基因芯片。提取1～4型登革病毒标准毒株的核酸RNA,以phi29DNA聚合酶结合带标签序列的随机引物进行全基因组扩增,再以Cy3荧光染料标记的标签序列引物进行PCR随机扩增标记,标记产物进一步用登革病毒芯片进行杂交检测,随后用广州白云机场出入境检验检疫局国境口岸收集的登革热病人血清标本对新建立的方法进行验证。结果1～4型登革病毒标准毒株培养液提取的RNA,经扩增、标记及芯片杂交检测,相应探针阵列均可检测到明显杂交信号,探针阳性率均达100％;从3份临床登革热病人血清标本中提取的RNA,同样也可得到明显的杂交信号,而背景干扰信号很低,从相应达到100％探针阳性率的探针阵列可判断,3份病人血清标本中分别为含1、2、3型登革病毒。结论该研究新建立的基因芯片方法,可用于检测临床血清标本中的登革病毒,如果设计更多针对不同病原体的特异性芯片探针,该方法还可用于临床标本中一些未知病原体的鉴定。     

TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒

目的 建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT—PCR方法用于检测登革1、2型病毒核酸，并初步应用于登革热的临床标本检测。方法 根据GenBank登录的登革热毒株序列。应用生物学软件进行序列比对，分别在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对荧光定量RT—PCR反应条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度和稳定性。同时对疑似登革热病例血清标本进行检测。结果 该方法对登革1、2型病毒的检测有高度的特异性，与登革病毒的4个血清型之间以及流行性乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒等均无交叉反应，检测的灵敏度均达0．1TCID50，可从疑似登革热病例血清标本中直接检测登革病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论 本研究建立的TaqMan荧光定量RT—PCR是一种快速检测登革1、2型病毒特异、敏感的方法，适用于临床早期诊断。     

多重PCR特异检测布鲁氏菌方法的建立

目的建立一种快速检测布鲁氏菌的多重PCR方法,为临床快速检测、准确诊断布鲁氏菌提供依据。方法针对布鲁氏菌外膜蛋白31 kD、22 kD和2a基因,各设计一对引物,扩增片断大小分别为427 bp3、17 bp和830 bp。利用纯培养物和模拟标本,分析这3对引物的特异性和敏感性。结果3对引物均能特异扩增布鲁氏菌的DNA,31 kD、22 kD和2a,扩增纯培养物的敏感性分别为2.8×103、4.6×103和2.1×104cfu,将3对引物组合在一起建立了多重PCR方法,能从模拟的细胞和血液标本中扩增出特异的产物,对模拟的细胞感染标本的敏感性为1×105cfu,对模拟的血标本的敏感性为1.2×106cfu。结论针对外膜蛋白基因,建立了能特异地检测标本中布鲁氏菌的多重PCR检测方法。     

多重聚合酶链反应检测流感嗜血杆菌

目的 建立检测流感嗜血杆菌的多重聚合酶链反应(M-PCR)方法 .方法 合成扩增流感嗜血杆菌编码P6外膜蛋白基因的引物(Hi),鉴定流感嗜血杆菌种特异性;合成扩增流感嗜血杆菌编码荚膜基因的引物(Hi-cap),鉴定菌株是否具有荚膜;设计并合成6对扩增流感嗜血杆菌不同血清型(荚膜型)编码摹因的引物(Hia-Hif),鉴定菌株的血清型,以其他呼吸道常见病原体菌株做对照,应用M-PCR方法 对200株临床分离的疑似流感嗜血杆菌菌株进行鉴定和血清分型.结果 M-PCR方法 检测流感嗜血杆菌具有高度的敏感性和特异性.对照菌株应用种(Hi)、荚膜(Hi-cap)和荚膜型(Hia-Hif)特异引物没有扩增出DNA片段.M-PCR方法 检测DNA的最低检测量为0.935 Pg.对临床分离的200株疑似流感嗜血杆菌鉴定,189株为流感嗜血杆菌,与API R NH鉴定结果 一致.其中1株具有荚膜,为f血清型,与玻片凝集法鉴定结果 一致.结论 M-PCR方法 检测流感嗜血杆菌具有较高的敏感性和特异性,可用于流感嗜血杆菌感染病例标本的快速检测和病例诊断.     

多重聚合酶链反应技术诊断疟疾及混合感染的研究

目的建立一种特异、敏感、简便的疟疾聚合酶链反应（PCR）快速诊断方法。方法针对疟原虫SSU rRNA基因序列设计3条分别具有属、种特异性的引物,通过多重PCR反应扩增间日疟原虫和恶性疟原虫不同大小的DNA片段。结果 19份恶性疟原虫血样均扩增出长度为400 bp的特定基因片段,16份间日疟原虫扩增出长度为300 bp的特定基因片段,20份健康人群对照血样经PCR扩增均为阴性。结论该多重PCR检测系统具有高效、敏感、特异、稳定、简便等特点,适宜于大批量样品同时检测,对疟疾的快速诊断、鉴别混合感染有较高的应用价值。     

登革病毒实时荧光PCR快速检测技术研究

目的建立Taqman MGB实时荧光PCR技术快速检测登革病毒。方法利用Taqman MGB技术,根据登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列,设计登革1~4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针,以登革热毒株作为标准,以乙脑毒株作对照,建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对8份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果RT-PCR检测8份临床血清标本,2份阳性,阳性率为25%。实时荧光PCR检测登革病毒cDNA灵敏度为0.17pg/μl,病毒液灵敏度为10-5TCID50,与乙脑病毒无交叉反应,检测8份临床血清标本,5份阳性,阳性率为62.5%。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强,可作为登革病毒的快速检测方法,应用于登革热的临床早期诊断。     

6种虫媒病毒微孔膜芯片检测方法的研制与应用

目的研制能同时检测6种口岸重要虫媒病毒的微孔膜芯片。方法针对包括1—4型登革病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒和裂谷热病毒等6种虫媒病毒,选择合适的保守基因,设计特异性的PCR引物（5’端标记生物素）和检测探针,通过参数优化建立单管多重RT—PCR扩增体系;然后按每个阵列5X5的格式,并确保点样区域为96孔板的微孔大小,将探针喷点到处理后的尼龙膜上,通过条件优化建立稳定的PCR产物与固化探针的杂交体系;采用碱性磷酸酯酶标记链亲和素和化学显色底物NBT／BCIP来检测特异性的PCR杂交产物。选取2012年1—6月份从口岸输入的疑似登革热发热病例的临床血清标本,提取RNA后,直接采用本研究建立的微孔膜芯片进行未知虫媒病毒的快速检测。结果用1～4型登革病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒和基孔肯雅病毒等7种毒株、1种黄热病毒疫苗株和1种裂谷热病毒核酸体外转录的RNA模板验证已建立的微孔膜芯片,获得比较特异和稳定的实验结果。应用该研究建立的方法,从3份疑似登革热发热病例的临床血清标本中检出了1例登革1型病毒和2例登革2型病毒,与实时荧光PCR检测结果相符。结论该研究建立的6种虫媒病毒微孔膜芯片检测方法,具有快速、准确、自动化和高通量等特点,为快速应对口岸输入性发热病例提供了非常有价值的检测手段,也为进一步开发更多指标的病原体检测方法提供良好的示范作用。     

TaqMan荧光定量PCR检测1型登革热病毒及临床应用

目的建立登革热1型病毒（DV1）TaqMan荧光定量PCR快速检测方法及应用于临床诊断。方法根据DV15′端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan探针。用4个血清型DV标准毒株为对照,收集40份DV1临床血清为检测标本。通过对DV1标准毒株RT-PCR后,采用体外转录方式获得RNA模板作为阳性对照,检测所建立TaqMan荧光定量PCR方法的特异性。取DV-IgM/IgG用ELISA检测患者血清,将TaqMan荧光定量PCR和DV-IgM/Ig GELISA进行敏感性比较。结果所建立方法的最低检测限约为每反应10个基因拷贝。发病后不同时间采集的登革热患者血清标本检测结果为：发病1～3d的患者RT-PCR阳性检出率最高（81.25%）;4～6dELISA-IgM检出率最高（85.00%）;7d后ELISA-IgG检出率最高（75.00%）。结论在登革热的早期诊断中建立的RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为DV1的快速诊断方法。     

多重荧光定量PCR测定登革热Ⅰ～Ⅳ型方法的建立

目的建立能同时检测登革热4种血清型的一步法多重荧光定量PCR检测方法,用于登革热病毒分型的早期实验室诊断。方法针对病毒Ⅰ~Ⅳ型使用优化的引物探针,调整反应温度和条件,稀释阳性样本,进行特异性、灵敏度、重复性检测,评估该反应体系的性能。结果 16份样本中,6份经抗体确证的登革热阳性样本使用自建方法检测全为阳性,且1型3份,2、3、4型各1份,均与预期结果一致。流感、乙脑、诺如阳性样本以及健康人血清检测未见特异性扩增曲线,特异性高。登革热病毒2、3、4型最低检测限为10~2 copies/ml。1型最低检测限为10~3 copies/ml。不同型别各浓度梯度检测变异系数小于10%。结论本实验设计的登革热单管多重荧光定量PCR检测体系特异性、灵敏度、重复性都较好。     

登革1型病毒荧光定量PCR快速检测

目的建立登革1型病毒的快速特异的荧光定量PCR检测方法。方法设计登革1型病毒特异的引物和TaqMan探针,制作标准曲线,并检测其特异性、重复性、再现性和敏感性,采用荧光定量PCR和常规PCR对临床标本进行检测比较。结果成功构建了标准曲线,回归方程为Y=-3.410logX+45.10,相关系数R²=0.999,扩增效率Eff=96.5%,灵敏度可达10³ copies/mL,此荧光定量PCR方法对登革1型病毒检测高度特异,与其他3型登革病毒和乙型脑炎病毒之间并无交叉反应;采用登革病毒种特异引物探针和本研究建立的登革1型病毒型特异引物探针对166份cDNA样本进行荧光定量PCR检测,均发现126份为阳性,阳性率均为75.9%,Ct值为20.84～36.36,浓度范围为1～1.3×104copy/μL;常规PCR方法检测到其中36份为阳性,阳性率为21.7%。结论荧光定量PCR方法能够快速灵敏地检测登革1型病毒,并能实现对病毒滴度的绝对定量。     

广东省东莞市2010年首例输入性登革热病毒核酸检测及分析

目的:对广东省东莞市2010年首例输入性登革热疑似病例的标本进行快速诊断分型并对其部分核酸序列进行测序分析。方法:采用RT-PCR、PCR、基因测序技术对血清标本中的核酸进行检测分析,同时用ELISA法检测IgM抗体。结果:RT-PCR结果表明标本为Ⅰ型登革热病毒,对PCR扩增产物测序得到了包含衣壳蛋白基因和部分膜蛋白基因的455 bp长度的序列,经Blast比对发现与马来西亚的一株登革热病毒序列(GenBank号FN429890.1)相比,仅有一个C→T核酸差异,氨基酸水平无差异。IgM抗体检测为阳性。结论:PCR技术可方便快捷的用于登革热病毒的检测及分型,同时对扩增产物测序还可了解其相应的基因变异情况。流行病学结合实验室数据表明此病例为一输入性病例。     

多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应快速检出含漱液中的乙型流感病毒

目的 建立特异敏感的快速检测含漱液中的流感病毒的分子生物学方法。方法 用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒HA基因的HA1片段,得到各病毒与特异性大小的扩增产物的对应关系。用同样的方法扩增含漱液中流感病毒的HA基因的HA1片段。根据这对应关系检测含漱液中的流感病毒。结果 以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物,用多重逆转聚合酶链反应能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段,它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增含漱液中流感病毒HA基因的HA1片段,根据扩增产物的大小检出含漱液中的乙型流感疾病。结论 多重逆转聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应能特异敏感地检出含漱液中的乙型流感病毒。     

TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测登革Ⅰ型病毒

目的检测发热患者血清中的登革病毒含量,并判定其型别。方法在登革病毒的E基因区设计一对引物和一条MGB探针,建立TaqMan MGB实时荧光定量PCR体系;从10份疑似登革热患者血清中提取病毒RNA,逆转录成cDNA,采用TaqMan MGB实时荧光定量PCR技术检测登革病毒及其型别。结果10份血清样本中,有9例出现阳性扩增曲线,病毒含量在103-105拷贝/ml,且扩增产物均出现大约100 bp的扩增带。结论2006年在广州市流行的登革热是由登革Ⅰ型病毒引起,TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测登革病毒感染具有快速、敏感的特点,为登革热的早期诊断提供了可能。     

A real-time multiplex SYBR Green I polymerase chain reaction assay for rapid screening of salmonella serotypes prevalent in the European Union

A two-step real-time SYBR Green I multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay with melting curve analysis was developed for rapid detection of 19 Salmonella serotypes frequently encountered in humans, animals, and animal-associated meat products within the European Union. The first-step single-tube reaction (Multiplex PCR I), consisting of five primer pairs, classified an initial test panel of eight Salmonella serotypes into five groups on the basis of characteristic amplicon melting temperatures produced by each strain. Following designation into groups, two subsequent triplex reactions (Multiplex PCR II-G1 and II-G3) allowed for further identification of five Salmonella serotypes by their melting peak temperatures. Primers for serotype differentiation were designed to target the genes encoding either phase 1 and 2 flagellar antigens fliC and fljB or unique serotype-specific loci. In addition, the assay simultaneously screened for the presence of the ampicilin-amoxicillin, chloramphenicol-florfenicol, streptomycin-spectinomycin, sulfanomides, and tetracycline (ACSSuT)-type multidrug resistance pattern, indicated by the floR gene, and for the Salmonella virulence plasmid encoded by the svp operon in Salmonella serotype Typhimurium. The established multiplex assays were successfully tested on 97 isolates, comprising 37 distinct Salmonella serotypes and 12 non-Salmonella strains. The two-step assay correctly detected 19 of 37 Salmonella serotypes and all non-Salmonella strains produced negative results. Of the 19 serotypes detected in the assays, 7 serotypes, including Salmonella serotypes Ohio, Goldcoast, Livingstone, Kedougou, Enteritidis, Kentucky, ACSSuT-type Salmonella serotype Typhimurium DT104 and DT104b, as well as non-ACSSuT-type Salmonella serotype Typhimurium strains, were definitively identified. The developed multiplex real-time SYBR Green I PCR assay represents a more rapid and reliable method for identification of large numbers of Salmonella serotypes prevalent throughout the European Union than assays using phenotypic serotyping methods.