局部注射骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤:运动功能有改善吗?

背景:目前研究多为骨髓间充质干细胞的体外培养及细胞移植对颅内疾病的治疗,对植入细胞在损伤脊髓中的成活、分化、迁移、结构重建等了解有限。目的:探讨局部骨髓间充质干细胞移植在脊髓损伤修复中的作用和骨髓间充质干细胞替代治疗的可行性。方法:成年健康雌性SD大鼠随机分为细胞移植组和对照组,建立SD大鼠脊髓横断损伤模型,伤后即刻分别向损伤区局部移植大鼠骨髓间充质干细胞悬液或无钙镁磷酸缓冲液。在术前和术后1d,1周,2周,3周,4周和8周进行BBB评分,观测大鼠的运动功能,并于移植后1周免疫组织化学染色法观察BrdU标记的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处的存活情况,移植后4周进行损伤脊髓的大体观察和组织学检测。结果与结论:移植后第1～8周细胞移植组BBB评分均髙于对照组;术后1周免疫组织化学染色结果显示在细胞移植组大鼠脊髓远端检测到BrdU阳性细胞,术后4周脊髓损伤处发现有神经纤维。证实通过损伤后立即局部注射的方式将骨髓间充质干细胞移植进大鼠脊髓损伤区,细胞可在损伤区存活;存活的骨髓间充质干细胞可分化为神经元,在损伤局部形成神经元通路,从而促进脊髓神经纤维传导功能的恢复,并促进高位脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复。     

OECs移植联合IN-1抗体修复急性脊髓损伤的实验研究

目的研究嗅鞘细胞移植联合轴突生长抑制蛋白抗体IN-1局部持续注射对大鼠横断性脊髓损伤的修复作用.方法成年雄性SD大鼠40只,建立胸脊髓全横断损伤模型,随机分成单纯对照组(10只)、嗅鞘细胞移植组(10只)、IN-1抗体微泵注射组(10只)和嗅鞘细胞移植联合IN-1抗体组(10只).应用NF200免疫组化染色和免疫荧光染色对脊髓损伤区神经纤维再生进行形态学观察.采用BBB评分评估大鼠后肢功能恢复情况.结果横断损伤共有9只大鼠死亡.术后8周可观察到Hoeehet标记的嗅鞘细胞在体内存活并在脊髓内迁移;联合治疗(OECs IN-1)组和OECs组可见脊髓损伤区杂乱无序的再生轴突,但无连续性神经纤维通过损伤区;IN-1组和对照组脊髓残端萎缩,未见轴突再生.后肢功能运动平均BBB评分对照组、IN-1抗体组、细胞移植组和联合治疗组分别为7.70±0.24、7.89±0.15、10.50±0.25、11.33±0.24.结论OECs移植联合IN-1抗体可促进损伤的脊髓神经轴突的存活和再生,较单纯应用OECs或IN-1能更好的促进脊髓损伤修复和大鼠后肢功能恢复.     

移植胚鼠神经干细胞对大鼠脊髓损伤后红核神经元损伤的影响

目的研究神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后红核神经元的作用。方法5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)法标记处于对数生长期的NSCs,采用电控脊髓损伤打击装置制作大鼠脊髓损伤模型。实验分为3组:NSCs组、SCI组和假手术组(Sham组)。SCI后3 d进行NSCs移植,用免疫组化法观察移植细胞的存活及迁移情况,用辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪技术标记红核神经元,并用四甲基联苯胺(TMB)呈色反应显示红核脊髓束神经元的存活情况,用行为学(BBB)评分法观察大鼠瘫痪肢体的恢复情况。结果在损伤脊髓区域可检测到BrdU标记的阳性NSCs,中脑HRP标记红核神经元数目明显多于SCI组(P<0.01),BBB评分亦明显高于SCI组(P<0.01)。结论体外培养的胚胎大鼠NSCs在移植到脊髓损伤区域后可存活和迁移,对SCI后中脑红核神经元具有保护作用,从而促进了大鼠肢体功能的恢复。     

神经干细胞移植治疗脊髓损伤

背景：研究已证实神经干细胞能促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,但对移植细胞在体内的增殖、分化、迁移的研究有限。 目的：观察神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠后肢运动功能修复的影响。 方法：SD大鼠制成T10脊髓全横断损伤模型,于造模成功后1周采用局部微量注射法。随机数字表法分为3组：损伤对照组仅打开椎管暴露脊髓;移植对照组：注射10 μL DMEM/F12培养液;细胞移植组：造模后移植浓度为1.0×109 L-1的神经干细胞悬液10 μL。移植后通过不同时间点BBB行为评分、病理组织学、免疫荧光技术评价大鼠脊髓功能修复情况及移植细胞在体内的存活、迁移、分化。 结果与结论：在体外成功建立SD大鼠海马源性神经干细胞培养体系;移植对照组、细胞移植组大鼠随着时间延长BBB评分均不同程度提高,从移植后2周起细胞移植组大鼠评分明显高于移植对照组(P < 0.05);神经干细胞移植后能够在体内继续存活、迁移并且分化为NF-200、GFAP表达阳性的神经元及星形胶质细胞。提示神经干细胞移植治疗脊髓损伤是一种有效的方法。     

神经干细胞移植修复大鼠脊髓半切伤的研究

目的：观察神经干细胞移植修复脊髓半切伤的疗效并探讨移植最佳时机。方法：制备大鼠T13-L1脊髓半切伤模型，取胎龄13、5d胎鼠大脑组织，体外分离、培养、诱导神经干细胞，并采用免疫细胞化学技术分别检测NSC（neural stemcell）特征性标志Nestin（巢蛋白）表达和用血清诱导分化为大量神经元NSE（neuron specific enolas）和神经胶质细胞GFAP（glial fibrillary acidic protein）表达。用明胶海绵吸附BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶）标记好的神经干细胞悬液移植到脊髓半横断处，移植时间选择损伤后立即移植、损伤后第9、14d。观察移植后的大鼠行为的变化，通过CBS（combine behavioral score）评分和爬网格实验评价大鼠的运动功能恢复情况，并进行免疫组化鉴定，光学显微镜观察移植神经干细胞的存活和迁移。结果：在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈Nestin阳性的神经球；用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞。与对照组相比，神经干细胞移植组明显修复了损伤结构，改善了下肢的功能，尤其是第9d移植组。结论：神经干细胞移植促进了脊髓损伤后神经结构和功能的恢复，是治疗脊髓半切伤一种有效方案，考虑综合因素移植干细胞的最佳时机应选损伤后9d左右。     

嗅鞘细胞移植和左旋硝基精氨酸对大鼠脊髓损伤后背核神经元存活及其轴突再生的影响

目的 探讨嗅鞘细胞(OECs)移植和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂左旋硝基精氨酸(LNNA)对大鼠脊髓损伤后,背核神经元存活及其轴突再生的影响.方法 将20只大鼠行脊髓半横断术后分为对照组、OECs组、L-NNA组和OECs L-NNA组.OECs L-NNA组在脊髓损伤处移植嗅鞘细胞,并注射L-NNA.术后30d时,应用NADPH酶组织化学、免疫组织化学、中性红染色、HE染色和荧光金逆行标记等方法,观察4组大鼠L1背核神经元存活及其轴突再生情况.结果 1.0ECs组、L-NNA组L1背核神经元存活数量均高于对照组,且分类计数显示,这两组对脊髓背核大、中、小神经元的存活均有促进作用,而OECs L-NNA组的促存活作用最显著.2.0ECs组和OECs L-NNA组脊髓损伤处可见再生的轴突,且L1背核可观察到被荧光金逆行标记的神经元胞体.3.与对照组比较,OECs组L1背核NOS阳性神经元增加,L-NNA组NOS阳性神经元减少,OECs L-NNA组NOS阳性神经元数量差异不明显.结论 嗅鞘细胞移植和L-NNA均可促进脊髓受损伤背核神经元的存活,两者联合应用可更好地促进受损伤的背核神经元存活及其轴突再生.     

移植神经干细胞促进脊髓全横断大鼠结构与功能修复的研究

目的 探讨移植神经干细胞对脊髓全横断性大鼠部分结构与功能修复的影响。方法 在脊髓全横断处移植神经干细胞60d后，在横断处下方3mm注射荧光金逆行标记轴突再生的上运动神经元，用免疫组织化学检测神经干细胞在宿主内的分化，同时用体视学方法观测脑干红核和大脑皮质感觉运动区内锥体细胞层的神经元密度变化。用BBB评分法和爬网格法观测大鼠后肢运动功能的恢复等。结果 移植的神经干细胞能在宿主内存活并向前后方向迁移到脊髓内，部分神经干细胞分化为GFAP、NF-200和GAP-43阳性细胞。移植神经干细胞后在红核和感觉运动区内锥体细胞层可见有被荧光金标记的神经元胞体，脊髓横断处附近脊髓组织的溃变程度减轻，红核及躯体感觉运动区内神经元密度高于未移植组，大鼠后肢的自主运动功能明显好于未移植组。结论 神经干细胞移植入损伤脊髓后能分化为神经元及神经胶质细胞，能减轻脊髓的继发性损伤，保护受损伤的神经元，促进运动功能的恢复。     

体外转染绿色荧光蛋白基因的肌源性干细胞移植修复大鼠脊髓损伤

背景:肌源性干细胞易于提取、分离及扩增,在特定条件下可分化为骨、软骨、肌肉等中胚层组织细胞,还可以跨胚层分化为神经细胞等,是组织工程临床用于脊髓损伤修复的理想种子细胞。目的:观察肌源性干细胞移植对脊髓半切损伤大鼠运动功能的修复作用。方法:40只成年SD大鼠随机数字表法分为移植组和对照组,每组20只。均进行脊髓半切损伤,伤后9d,移植组于伤处移植体外转染绿色荧光蛋白基因的大鼠肌源性干细胞,而对照组仅注射等量PBS,于移植后1,2,3,4周用斜板实验和BBB评分测大鼠的运动功能,同时进行损伤脊髓取材、快速冰冻切片进行荧光显微镜观察。结果与结论:所有大鼠脊髓半切损伤手术均成功,术后无动物死亡。肌源性干细胞移植后1周,移植组与对照组均有所恢复,斜板实验和BBB评分差异无显著性意义(P0.05);2~4周移植组恢复明显较好,斜板实验和BBB评分显著高于对照组(P0.05),移植组后肢活动与前后肢活动的协调性明显优于对照组。荧光显微镜观察经诱导分化和基因标记的肌源性干细胞在损伤脊髓组织局部生长良好,并且有沿着脊髓神经束向头尾两侧迁移的趋势。提示脊髓半切损伤大鼠经肌源性干细胞移植后能在损伤脊髓组织局部长期存活并明显改善其运动功能,肌源性干细胞移植对脊髓半切损伤大鼠有修复作用。     

大鼠自体嗅成鞘细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究

目的探讨自体外周嗅成鞘细胞对脊髓损伤修复的可能作用和促进受损轴突再生的能力,为临床应用自体OECs修复脊髓损伤进行可行性研究.方法以改良的Allen法建立脊髓（T9～10节段）损伤模型后,将动物分为自体OECs悬液组和Hanks液对照组,分别移植含自体OECs的细胞悬液和Hanks液,以神经丝蛋白（NF）和神经生长因子受体蛋白（NGFR p75）免疫荧光双标染色,激光共聚焦显微镜检测移植效果;通过BBB行为学评分记录两组动物后肢恢复功能.结果镜下观察可见自体OECs悬液组动物脊髓损伤处的空洞较对照组明显缩小.而自体OECs悬液组免疫荧光标记纤维中夹有NGFRp75标记的OECs,且随标记的NF纤维走行方向排列.行为学观察可见自体OECs悬液组的大鼠后肢运动功能较对照组有显著恢复.结论自体OECs悬液多点注射有助于脊髓损伤部位神经纤维的再生.     

骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脊髓损伤

背景：干细胞移植可以重建中枢神经系统的结构和功能,近年来引起了广泛的关注。 目的：尾静脉移植骨髓间充质干细胞观察其对大鼠脊髓损伤修复的影响并探讨其机制。 方法：密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离骨髓间充质干细胞。将成年雌性Wistar大鼠以动脉瘤夹钳夹法制备大鼠脊髓损伤模型后随机分为细胞移植组和对照组,分别干预。 结果与结论：细胞移植组大鼠BBB后肢功能评分恢复优于对照组(P < 0.05)。自损伤后第30天开始,细胞移植组大鼠运动诱发电位潜伏期及体感诱发电位P1波潜伏期的恢复均优于对照组(P < 0.05),并持续至实验结束。细胞移植组大鼠脊髓内在损伤中心及头、尾端距离脊髓损伤中心1 cm处均可见阳性细胞。说明尾静脉注射移植骨髓间充质干细胞可以促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复,其机制可能与移植细胞迁移到损伤部位,分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞,并分泌或促进宿主分泌神经营养因子有关。     

骨髓间充质干细胞移植脊髓全横断模型大鼠运动和体感诱发电位的评价

背景：临床常用皮质运动诱发电位和皮质体感诱发电位来分别评价脊髓损伤后运动传导路和感觉传导路的损伤或修复情况。 目的：以脊髓诱导电位监测骨髓间充质干细胞移植后急性脊髓完全性损伤大鼠下肢神经功能的变化。 方法：选取健康Wistar大鼠50只,分成5组,即生理盐水组、骨髓间充质干细胞移植组、脑源性神经营养因子修饰组、神经营养素3+骨髓间充质干细胞移植组和假手术组。除假手术组外,其余各组均制作Allen’s脊髓完全性损伤动物模型,造模后各组均行相应治疗。治疗后4,8和12周行大鼠后肢运动功能评分,并于造模后24 h,3,7,14 d行运动和体感诱发电位检测。 结果与结论：运动诱发电位检测结果提示,各治疗组的运动功能均有不同程度的恢复,与生理盐水组间差异均有显著性意义(P < 0.05),大鼠后肢BBB评分也证实了各治疗组后肢运动功能明显优于生理盐水组(P < 0.05)。提示经脑源性神经营养因子修饰的骨髓间充质干细胞可移植到脊髓损伤处,可改善大鼠的后肢运动,神经营养素3蛋白有可能提高骨髓间充质干细胞在体内的生存率,促进受损脊髓的轴突再生。     

嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤模型大鼠修复损伤区组织的超微结构特征

文题释义： 嗅鞘细胞：是一种嗅神经的支持细胞,它起源于嗅基底膜,分布在嗅球,嗅神经和嗅中枢。位于中枢和外周神经系统过渡区,具有降解抑制再生分子、分泌不同神经营养因子、促进神经轴突和髓鞘的再生、改善脊髓损伤后的微环境等重要作用。 超微结构：通过透射电子显微镜观察脊髓损伤后损伤部位神经元的细胞膜、细胞器(高尔基复合体,尼氏体,内质网、核糖体、神经微丝、微管)、细胞核(核仁、核周体);髓鞘,轴突,突触,胶质瘢痕等亚细胞水平的变化。 背景：嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤是目前的研究热点,其研究主要探讨脊髓损伤后微环境的影响,嗅鞘细胞移植对脊髓损伤后脊髓超微结构的影响未见报道。 目的：观察脊髓损伤后损伤部位神经细胞、轴突、髓鞘、突触和胶质瘢痕的超微结构以及嗅鞘细胞移植对大鼠损伤脊髓的保护和神经修复再生的影响。 方法：实验方案经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准(批准号2018-2048)。将成年健康雌性SD大鼠20只随机分成3组：空白组(4只)仅仅切除T₁₀全部椎板及T₉, T₁₁部分椎板,未对脊髓作其他处理;DF12组(8只)切断脊髓,注射DF12培养液;嗅鞘细胞移植组(8只)切断脊髓,进行嗅鞘细胞移植。于脊髓损伤后1,7,28,56 d,对各组大鼠麻醉后取出脊髓,透射电镜观察脊髓损伤区神经细胞超微结构的变化。 结果与结论：①与空白组比较,DF12组大鼠脊髓损伤区神经元胞体内细胞器明显减少,轴突、髓鞘和突触的超微结构发生明显的变化;嗅鞘细胞移植组损伤区的神经元胞体内细胞器明显增加,核仁明显,促进轴突、髓鞘和突触的再生,且胶质瘢痕明显较少;②嗅鞘细胞移植组大鼠星形胶质细胞和毛细血管周细胞的反应比较轻微;③结果说明,脊髓损伤后嗅鞘细胞移植可有效地保护脊髓损伤区的神经组织,促进轴突、髓鞘和突触的再生,抑制神经胶质和周围细胞的增生反应,从而使损伤后微环境有利于神经元、轴突和突触再生。ORCID: 0000-0001-6049-2551(王国毓) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

NT-3mRNA分子杂交在胚胎脊髓修复成鼠受损脊髓过程中的变化

为了从神经营养因子角度探讨移植修复机理，将大鼠１４ｄ胚胎脊髓（ＥＳＣ）植入急性损伤成鼠脊髓后１、３、５、７、１０、１５和３０ｄ，用原位杂交和斑点杂交技术对ＥＳＣ和宿主脊髓（ＨＳＣ）内ＮＴ－３ｍＲＮＡ的变化进行定性和定量观察。定性观察显示，在正常脊髓内，ＮＴ－３ｍＲＮＡ以前角运动神经元和少量胶质细胞分布为主；脊髓损伤以后，杂交产物扩大到中小型神经元，同时更多的胶质细胞参与了反应；ＥＳＣ植入后，除移植物本身继续表达外，宿主脊髓阳性反应神经元和胶质细胞数量进一步增加。定量结果表明，损伤组原位杂交和斑点杂交的反应强度明显高于正常组；而移植组的分子杂交反应又在很多时相点上显著高于损伤组。除此而外，分子杂交反应在损伤组和移植组内持续的时间也不相同，前者的最强反应期为术后７ｄ，后者为术后１０～１５ｄ．我们认为，移植的ＥＳＣ除为自身和ＨＳＣ提供神经营养外，也诱发了ＨＳＣ在发生过程中曾经拥有的合成机制，以增强ＮＦ表达的方式为自身再生提供营养，同时也为移植物的发育分化提供合适的营养环境。     

嗅球成鞘细胞移植对脊髓半横断后脊髓灰质内Ca2+荧光强度的影响

目的：研究嗅球成鞘细胞(OECs)的移植对脊髓半横断后脊髓灰质细胞内游离钙离子浓度([Ca^2 ]i)的影响,探索OECs促进脊髓再生的机制。方法：将体外培养的OECs制成细胞悬浮液移植到上颈段脊髓半横断的动物模型中,用激光扫描共聚焦显微镜观察颈段脊髓厚片[Ca^2 ]i荧光强度的变化。结果：移植组与损伤组比较,损伤组损伤侧与非损伤侧[Ca^2 ]i荧光强度差异非常显著;而移植组损伤侧与非损伤侧[Ca^2 ]i荧光强度无显著差异。结论：(1)OECs对脊髓的再生有良好的促进作用;(2)OECs能够抑制[Ca^2 ]i的升高,改善损伤部位的微环境。     

龟板对植入大鼠损伤脊髓内骨髓间充质干细胞分化为神经元的影响

应用密度梯度法分离大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)进行培养,经5溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记和CD44(celldifferentiation protein44)染色及BrdU/CD44双标染色鉴定,将标记有BrdU的MSCs分别植入脊髓损伤体内和龟板治疗脊髓损伤体内。于移植后1周、2周、3周、4周和6周取损伤脊髓组织,对BrdU、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)进行免疫组化染色及BrdU/NF和BrdU/GFAP双标染色检测移植后MSCs的存活和分化。结果发现:移植后1周,两组在移植区内都可见BrdU单位、BrdU/NF双标细胞,移植后2周达到高峰。龟板组可使BrdU单位和BrdU/NF双标细胞持续高表达至移植后6周,而脊髓损伤组BrdU单位和BrdU/NF双标细胞表达减少至移植后4周,组间比较差别有显著性。结果提示益肾龟板能促进脊髓损伤移植MSCs存活和分化为神经元。     

不同时间点静脉移植嗅鞘细胞修复脊髓损伤

背景:嗅鞘细胞具有促进轴突再生、为受伤的宿主细胞提供营养支持以及调节炎症反应的能力,是修复脊髓损伤具有潜力的细胞。目的:探讨通过静脉移植嗅鞘细胞治疗脊髓损伤的最佳移植时间窗。方法:SPF雄性SD大鼠30只,采用脊髓半横断建立大鼠脊髓损伤模型,并随机分为5组:脊髓损伤后注射嗅鞘细胞1 d移植组、3 d移植组、7 d移植组、10 d移植组及PBS对照组。应用荧光量子点标记嗅鞘细胞;分别于1,3,7,10 d时间点通过尾静脉移植应用量子点标记的嗅鞘细胞;PBS对照组脊髓损伤后注射PBS。注射后1 d取损伤处的脊髓;应用小动物成像仪测定不同时间点转移到损伤处荧光的数值,通过荧光的强度衡量转移到损伤处细胞的量;应用嗅鞘细胞Anti-p75 NGF Receptor抗体做损伤处脊髓的免疫组织化学。实验方案经宁夏医科大学动物实验伦理委员会批准(编号:2017-073)。结果与结论:①荧光量子点可以标记嗅鞘细胞;②荧光测定结果与免疫组织化学染色结果:1,3,7,10 d时间点通过尾静脉移植的嗅鞘细胞均有细胞转移到损伤处,7 d移植的嗅鞘细胞转移到损伤处的最多;③结果说明,脊髓损伤不同时间点注射的嗅鞘细胞均可以转移到脊髓损伤处,损伤后7 d移植的嗅鞘细胞转移到损伤处的细胞数量最多,可以作为移植的最佳时间窗。     

督脉电针与神经干细胞移植对脊髓全横断大鼠后肢功能恢复的影响

目的探讨督脉电针与神经干细胞移植联合应用对脊髓全横断大鼠后肢运动功能恢复的影响。方法将对照组、神经干细胞移植组(神经干细胞组)、督脉电针组(电针组)和督脉电针 神经干细胞移植组(电针神经干细胞组)大鼠胸10脊髓段做全横断损伤；其中神经干细胞组和电针神经干细胞组在损伤处移植神经干细胞。电针组和电针神经干细胞组在术后开始接受电针治疗。结果1．对照组大鼠后肢完全瘫痪。其余各组均能观察到大鼠后肢的运动。电针神经干细胞组BBB分数高于其他组。2．对照组大鼠后肢不能爬行网格。神经干细胞组2只、电针组3只和电针神经干细胞组5只大鼠能通过爬行网格攀上平台。3．脊髓损伤后，对照组的皮质体感诱发电位或皮质运动诱发电位的潜伏期增长和峰峰值变小。经电针治疗后，电针神经干细胞组的潜伏期和峰峰值均较电针组和神经干细胞组有明显的改善。4．对照组的后肢肌肉发生明显的萎缩，而电针组和电针神经干细胞组的后肢肌肉萎缩较轻。结论督脉电针与神经干细胞移植联合应用能促进脊髓全横断大鼠后肢运动功能的恢复。