汉防己甲素对离体兔角膜基质细胞抑制机制的实验研究

目的探讨汉防己甲素（Tet）对离体兔角膜基质细胞的抑制作用及其作用机制。方法 选用原代及传代兔角膜基质细胞，实验组加入含不同质量浓度Tet的培养液，对照组加入含等量PBS的培养液，同时用不同质量浓度氟美童作比较。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测对细胞增生的抑制；流式细胞仪（FCM）测定细胞周期和凋亡率的变化；透射电子显微镜观察其超微结构变化；免疫细胞化学检测其凋亡指标的改变。结果 Tet质量浓度为1～10μg／ml时，作用24、48、72h均明显抑制角膜基质细胞的增生（P〈0．01），并具有剂量-反应关系，其各时间点IC50均低于氟美童；FCM结果显示，实验组G0／G1期细胞增加，并可见细胞凋亡峰和凋亡率的升高；免疫细胞化学显示，实验组bax、bcl-2表达均增加，但bax增加更为明显。结论 Tet对角膜基质细胞的增生具有明显抑制作用，并呈现剂量-反应关系，其抑制作用强于氟美童。Tet可能通过诱导细胞凋亡和使细胞周期停滞在G0／G1期而发挥其抗增生作用。     

汉防己甲素对PRK术后纤维连接蛋白的影响

目的探讨汉防己甲素(tetrandrine,Tet)对兔准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive keratectomy,PRK)术后纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的抑制作用,并初步探讨其机制。方法健康新西兰大耳白兔60只,雌雄不限。随机分为实验组Tet0.5g·L-1组、1g·L-1组、2g·L-1组,艾氟龙(FML,1g·L-1)阳性对照组及生理盐水阴性对照组。于PRK术后1周、2周、1个月、2个月用裂隙灯显微镜进行Haze的分级并记录,用免疫组织化学法检测角膜基质FN的表达,并应用计算机图像分析系统进行定量分析。结果不同浓度Tet、FML滴眼,术后各时间点Haze形成明显减轻,与生理盐水相比差异有显著统计学意义(P<0.01)。正常兔角膜基质FN为阴性表达;PRK术后1个月生理盐水组角膜基质细胞FN呈强阳性表达;Tet各浓度组FN呈弱阳性表达;FML组FN呈阳性表达。Tet各浓度组与FML组、生理盐水组相比差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论Tet可能是通过减少细胞外基质——FN的生成而发挥其对Haze的抑制作用。     

汉防己甲素对兔结膜成纤维细胞超微结构和兔眼内组织毒性作用

目的　观察汉防己甲素 (Tet)对兔结膜成纤维细胞超微结构的影响及对兔眼内组织的毒性作用。方法　用含 2、4mg·L-1的Tet作用于体外培养的兔结膜成纤维细胞(RCF) 4 8h ,观察Tet对其超微结构的影响 ;用含 30 0、6 0 0mg·L-1的Tet 0 1mL向兔眼玻璃体腔内注射 ,对照组玻璃体腔内仅注入 0 .1mL生理盐水。观察用药前、用药后 3、14d各组视网膜电流图 (ERG)、视觉诱发电位 (VEP)变化。结果　 2mg·L-1Tet作用RCF 4 8h后 ,电镜观察细胞超微结构无改变 ,而 4mg·L-1Tet作用RCF 4 8h后 ,细胞次级溶酶体数量增多 ,呈髓鞘样结构。向兔眼玻璃体腔内注射 30 0、6 0 0mg·L-1Tet 0 .1mL后 ,用药前及用药后 3dERG、VEP与对照组相比均无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;而 6 0 0mg·L-1Tet行玻璃体腔内注射达 14d后 ,ERG、VEP与对照组相比有高度显著性差异 (P <0 .0 0 0 1)。结论　汉防己甲素对兔结膜成纤维细胞生长有一定的毒性作用 ,但适宜浓度的汉防己甲素应用于兔眼内组织防止成纤维细胞增殖是安全的。     

吡非尼酮对大鼠角膜基质细胞增殖的影响

目的：：探讨吡非尼酮( Pirfenidone,PFD)对体外培养大鼠角膜基质细胞增殖的抑制效果及其对转化生长因子-β1( transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达的影响。方法：分离培养大鼠角膜基质细胞,根据PFD用药的不同浓度分为对照组(0mg/mL)、实验组Ⅰ(0.15mg/mL)、实验组Ⅱ(0.3mg/mL)、实验组Ⅲ(1mg/mL),加药48h后应用CCK-8法检测其对角膜基质细胞增殖能力的影响,免疫细胞化学和Western-blot分别检测ki-67和TGF-β1表达的变化。结果：CCK-8结果显示,相比对照组,各实验组对角膜基质细胞的增殖均有明显的抑制作用,且随浓度的增大其抑制作用明显增强(均P<0.05);免疫细胞化学显示PFD能明显降低ki-67阳性指数( P<0.05);Western-blot结果显示,PFD能降低TGF-β1的表达,且呈剂量依赖关系(P<0.05)。结论：PFD对大鼠角膜基质细胞的增殖具有明显抑制作用,抑制机制与下调TGF-β1表达密切相关,在减轻角膜创伤愈合方面具有潜在的运用前景。     

丹参单体、三氟拉嗪对视网膜色素上皮细胞增殖抑制的研究

目的研究丹参单体(IH764-3)和三氟拉嗪对体外培养的兔视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞增殖的抑制作用。方法将传代培养的RPE细胞分别加药培养24h、48h、72h、96h、120h,应用二甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同剂量丹参单体和三氟拉嗪对RPE细胞的抑制作用,进一步检测两药半数抑制剂量(IC50)联合应用对RPE细胞的抑制作用。结果丹参单体和三氟拉嗪对RPE细胞的增殖均有抑制作用,呈时间及剂量依赖性,各剂量及各时间点相比差异均有显著统计学意义(均为P<0.01),丹参单体的IC50为15.22μmol·L-1(2.4mg·L-1),三氟拉嗪的IC50为18.09μmol·L-1。联合用药120h对RPE的抑制率达87.23%,联合用药后各时间点与单独应用丹参单体及三氟拉嗪的抑制率比较,差异也均有显著统计学意义(均为P<0.01)。结论丹参单体和三氟拉嗪对RPE细胞的增殖均有抑制作用,两药联合后可产生协同作用,为以后两种药物的联合体内试验提供了一定的实验基础。     

汉防己甲素对PRK术后Ⅲ型胶原的影响

目的 探讨汉防己甲素(Tet)对兔PRK术后细胞外基质(ECM)的抑制作用并探讨其机制.方法 健康新西兰大耳白兔60只,雌雄不限.随机分为Tet实验组(0.05%、0.1%、0.2%),艾氟龙(FML)阳性对照组,生理盐水阴性对照组.于PRK术后l周、2周、1个月、2个月用免疫组织化学法检测角膜基质Ⅲ型胶原的表达,并应用计算机图像分析系统进行定量分析.结果 Tet各质量浓度组角膜基质Ⅲ型胶原表达减弱,均低于FML和生理盐水组,差异有统计学意义(P<0.01).结论 Tet可能是通过减少ECM-Ⅲ型胶原的生成而发挥其对haze的抑制作用.     

转化生长因子β1对牛角膜内皮细胞外基质合成的影响

目的观察转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)对体外培养的牛角膜内皮细胞细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)合成的影响。方法将体外培养的牛角膜内皮细胞分为实验组和对照组,经0μg·L-1(对照)、0.1μg·L-1、1.0μg·L-1、10.0μg·L-1、100.0μg·L-1浓度的TGF-β1处理48h后,用SABC免疫组化法分别检测角膜内皮细胞纤维连接蛋白和层粘连蛋白的合成情况。结果与对照组相比,一定浓度(1.0μg·L-1及10.0μg·L-1)的TGF-β1能明显促进体外培养的角膜内皮细胞纤维连接蛋白及层粘连蛋白的合成,且呈剂量依赖性。但浓度为0.1μg·L-1及100.0μg·L-1的TGF-β1组OD值与对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论一定浓度(1·0μg·L-1及10.0μg·L-1)TGF-β1能促进牛角膜内皮细胞ECM的合成,提示TGF-β1可能在角膜内皮细胞损伤修复中扮演重要角色。     

川芎嗪对环丙沙星在角膜穿孔伤兔眼眼内渗透性的影响

目的 研究兔角膜穿孔伤后血-眼屏障的改变及川芎嗪对环丙沙星在兔眼角膜穿孔伤眼内渗透性的影响.方法 18只新西兰兔,随机分为A、B、C 3组.A、B组各眼行角膜穿孔伤,1 h后A组静脉注射环丙沙星,B组静脉注射川芎嗪和环丙沙星;C组为对照组单纯静脉注射环丙沙星.用药后0.5 h,取房水及玻璃体,双缩脲法测定房水蛋白含量,反向高效液相色谱法测定房水及玻璃体环丙沙星浓度.结果 A、B和C组房水蛋白含量分别为(11.977±5.774)g·L-1、(14.767±5.814)g·L-1和(2.741±1.193)g·L-1,A、B组显著高于C组(P＜0.01);A、B和C组房水环丙沙星浓度分别是(1.390±0.284)mg·L-1、(1.390±0.284)mg·L-1和(0.655±0.291)mg·L-1,A、B组显著高于C组(P＜0.01);A、B 2组房水蛋白的含量与环丙沙星的浓度呈正相关(P＜0.01),但A、B 2组房水蛋白浓度及环丙沙星浓度比较差异无统计学意义(P＞0.05);3组玻璃体中环丙沙星浓度均很低,分别是(0.073±0.059)mg·L-1、(0.085±0.041)mg·L-1和(0.064±0.051)mg·L-1,3组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 角膜穿孔伤增加血-房水屏障通透性,使房水中环丙沙星水平明显提高,浓度显著高于大部分眼内致病菌90%菌株最小抑菌浓度.川芎嗪不影响外伤眼血-房水屏障,不能增加环丙沙星在角膜穿孔伤兔眼眼内渗透性,可作为角膜穿孔伤后改善血循环用药.     

胰岛素样生长因子结合蛋白-6对RPE细胞增殖和迁移的影响

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-6(insulin-like growth factor binding protein-6,IGFBP-6)对视网膜色素上皮(retinal pigmented epithelium,RPE)细胞增殖和迁移的影响。方法用IGF-Ⅱ(50mg·L-1)、PDGF(20mg·L-1)、VEGF(40mg·L-1)和TGF-β(4mg·L-1)干预ARPE-19细胞6h,以诱导细胞增殖,再加入不同浓度IGFBP-6(1mg·L-1、10mg·L-1、100mg·L-1、500mg·L-1、1000mg·L-1)作用24h、48h后,通过MTS实验观察OD值的变化,研究IGFBP-6对细胞增殖的影响。细胞划痕实验分为IGF-Ⅱ组(50mg·L-1)、IGF-Ⅱ+IGFBP-6组(含IGF-Ⅱ50mg·L-1和IGFBP-6500mg·L-1)、无血清培养液组的实验,细胞划痕24h、48h后,计算各组细胞移行愈合率的变化,从而研究IGFBP-6对细胞迁移的影响。结果 MTS比色法显示一定浓度的IGFBP-6(100mg·L-1、500mg·L-1、1000mg·L-1)可以抑制IGF-Ⅱ诱导的ARPE-19细胞增殖(P<0.05),各浓度IGFBP-6对PDGF、VEGF、TGF-β诱导的细胞增殖均无明显影响(均为P>0.05);细胞划痕实验显示,IGF-Ⅱ组、IGF-Ⅱ+IGFBP-6组、无血清培养液组的细胞移行愈合率[分别为(24h:43.91%±3.85%、29.76%±2.49%、26.12%±2.33%;48h:66.09%±1.67%、59.88%±3.43%、57.05%±2.49%)]差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 IGFBP-6能够抑制IGF-Ⅱ诱导的RPE细胞增殖和迁移。     

层粘连蛋白促进兔角膜内皮细胞bcl-2表达的最适浓度测定

目的　探索层粘连蛋白促进兔角膜内皮细胞bcl 2表达的最适浓度。方法　给于体外培养的兔角膜内皮细胞以不同浓度的层粘连蛋白 ,采用酶联免疫技术找到最适作用浓度。结果　在一定的浓度范围内 (2 0～ 6 0mg·L-1)层粘连蛋白能够促进家兔角膜内皮细胞bcl 2的表达 ,并且成量效依赖关系 ,在 6 0mg·L-1时有最佳的促进作用。结论　层粘连蛋白可以促进兔角膜内皮细胞bcl 2基因表达的作用 ,最适作用浓度为 6 0mg·L-1。