体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的最佳条件.方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20 μmol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d.相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过Western印迹法对细胞cTnT进行定量分析.结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5 μmol/L的5-aza孵育48 h、10 μmoL/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10 μmol/L的5-aza孵育48 h、20 μmol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响.结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5 μmol/L的5-aza孵育48 h和10 μmol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

【目的】探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的潜能。【方法】取大鼠下肢骨骨髓，分离培养MSCs，用5-氮胞苷(5-aza)定向诱导24h，相差显微镜下观察其形态变化，免疫组化法检测肌钙蛋白(cTnT)和心肌细胞结蛋白(desmin)表达，并通过RT-PCR对肌球蛋白重链(MHC)在细胞中的表达进行鉴定。【结果】MSCs经5-aza诱导后，部分细胞呈梭形，并可见肌管样结构。免疫组化检测示诱导后MSCs的cTnT阳性细胞数为15％，Desmin表达强阳性，RT—PCR示诱导后MSCs有MHC表达。【结论】MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞，是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源。     

体外培养鼠骨髓间充质干细胞及其向心肌样细胞诱导分化的实验研究

目的 通过体外培养骨髓间充质干细胞(MSCs),并用5-氮胞苷诱导其向心肌样细胞分化,研究MSCs生物学特性和5-氮胞苷效能.方法 将SD大鼠的骨髓采用贴壁法进行分离培养及传代增殖,相差显微镜下观察细胞形态变化,绘制生长曲线,并用流式细胞仪技术检测CD29、CD45的表达,进行细胞成分鉴定.用5-氮胞苷体外诱导MSCs,观察其形态结构.用免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)、结蛋白(Desmin),用RT-PCR检测心肌特异因子基因β-肌球蛋白重链(β-MHC)的表达.结果 贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖较快.经5-氮胞苷诱导后,MSCs形态发生变化,可见肌管样结构.免疫组化和RT-PCR证实MSCs经体外诱导发生了向心肌样细胞的分化.结论 采用贴壁筛选法,简便易行,短期内可获得大量的纯度较高的骨髓间充质干细胞;在5-氮胞苷的诱导下,骨髓间充质干细胞呈现向心肌样细胞分化的趋势.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

[目的] 探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞 ( MSCs )向心肌样细胞分化的潜能.[方法] 取大鼠下肢骨骨髓,分离培养 MSCs,用 5-氮胞苷 ( 5-aza )定向诱导 24 h,相差显微镜下观察其形态变化,免疫组化法检测肌钙蛋白 ( cTnT )和心肌细胞结蛋白 ( desmin )表达,并通过 RT-PCR对肌球蛋白重链 ( MHC )在细胞中的表达进行鉴定.[结果] MSCs经 5-aza诱导后,部分细胞呈梭形,并可见肌管样结构.免疫组化检测示诱导后 MSCs的 cTnT阳性细胞数为 15%, Desmin表达强阳性, RT-PCR示诱导后 MSCs有 MHC表达.[结论] MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞,是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源.     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为心肌样细胞的条件。方法抽取大鼠骨髓,采用贴壁培养法分离MSCs进行培养、传代,在第4代MSCs中添加诱导剂5-氮胞苷(5-aza)对其进行诱导分化,观察细胞形态学的变化,应用荧光免疫组织化学方法进行鉴定。结果大鼠MSCs贴壁呈集落生长,有成纤维细胞样外观。诱导后细胞呈梭形,排列方向渐趋一致,有肌管样结构形成,肌钙蛋白及Connexin43表达强阳性。结论大鼠MSCs体外在5-氮胞苷作用下可定向分化为心肌样细胞。     

加味丹参饮体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的探讨加味丹参饮体外诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs)向心肌样细胞分化的实验研究。方法采用贴壁法获取大鼠BMSCs,流式细胞术检测细胞表面抗原。MTT法检测加味丹参饮对BMSCs最大无毒浓度,用第3代细胞分组诱导:正常对照组,加味丹参饮组,5-氮胞苷组,加味丹参饮+5-氮胞苷组,应用western blot检测各组细胞结合蛋白(Desmin),α-肌球蛋白重链(α-MHC),心肌肌钙蛋白T(c Tn T)蛋白表达,RT-PCR法检测各组细胞GATA-4,缝隙连接蛋白43(CX43)及Nkx2-5 mRNA表达。结果大鼠BMSCs表面CD90阳性率高于95%,CD34及CD45阳性率低于5%。加味丹参饮对BMSCs最大无毒浓度为0.625 g/L。与正常对照组比较,加味丹参饮组,5-氮胞苷组,加味丹参饮+5-氮胞苷组中Desmin,α-MHC及c Tn T蛋白表达量上调,GATA-4,CX43及Nkx2-5 mRNA表达量上调,差异有统计学意义(P0.01)。与加味丹参饮组或5-氮胞苷组比较,加味丹参饮+5-氮胞苷组中Desmin,α-MHC及c Tn T蛋白表达量上调,GATA-4,CX43及Nkx2-5 mRNA表达量上调,差异有统计学意义(P0.01)。结论加味丹参饮能够诱导BMSCs向心肌样细胞转化,与5-氮胞苷联合给药具有协同作用。     

兔骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌细胞的实验研究

目的体外诱导兔骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向心肌细胞分化,进一步证实其多向分化特性.方法分离、培养兔的MSCs,将第5代的MSCs在体外经5-氮胞苷诱导4周后,进行免疫组化鉴定和电镜观察.结果5-氮胞苷诱导MSCs4周,部分细胞表达肌钙蛋白T（troponin T）,电镜观察到肌丝形成.结论MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,在体外经5-氮胞苷诱导可转化为心肌细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的研究

目的观察体外不同诱导条件下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在不同时间段分化为心肌样细胞的能力及表达心肌细胞特异性标志物的差别。方法分离培养SD大鼠BMSCs和SD乳鼠心肌细胞并鉴定,取第3代BMSCs分别进行5-氮胞苷(5-Aza)诱导、与心肌细胞共培养及单独培养,分别于第2、4、6、8、10周使用倒置显微镜观察细胞生长情况和形态变化,反转录-聚合酶链反应检测每组细胞心肌特异性基因肌钙蛋白I(cTnI)、缝隙连接蛋白43(Cx43)和心肌特异性转录因子4(GATA-4)的表达。结果对照组未见有搏动细胞,cTnI、Cx43和GATA-4基因表达阴性;5-氮胞苷诱导组于第2周时细胞呈梭形且排列方向趋于一致,未见有搏动细胞,cTnI、Cx43基因表达第8周达到高峰,GATA-4基因表达第4周达高峰;共培养组细胞多为梭形,呈肌性排列,可见搏动频率不一致的搏动细胞,cTnI、Cx43基因表达于第2⁸周表达逐渐增加,GATA-4基因表达第6周达高峰;相同时段内,共培养组的cTnI、Cx43和GATA-4基因表达高于5-氮胞苷诱导组(P<0.05)。结论 BMSCs经5-氮胞苷诱导或与心肌细胞共培养可转化为心肌样细胞并表达基因cTnI、Cx43和GATA-4,且共培养组BMSCs分化为心肌样细胞的能力比5-氮胞苷诱导组强,推测心肌微环境可促进BMSCs定向分化为心肌样细胞。     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:研究体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cells,MSCs) 经5-氮胞苷(5-aza) 诱导定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征?方法:SD大鼠股骨骨髓经密度梯度离心及贴壁分离培养传代MSCs,体外用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化?相差显微镜观察心肌样细胞形态学变化?免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达?结果:密度梯度离心及贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖快?5-aza诱导后,部分细胞形态发生变化,有肌管样结构形成?随诱导后培养时间延长MSCs中cTnT?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达逐渐增强?结论:密度梯度离心及贴壁分离培养可获得大量纯度较高的骨髓间充质干细胞?经5-aza诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞?     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导心肌样细胞的实验研究

目的研究兔骨髓间充质干细胞（mensenchymal stem cell,MSC）经5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-aza）诱导在体外定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征,为心肌样细胞鉴定提供依据。方法取兔髂骨骨髓,分离并培养骨髓间充质干细胞,用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化。相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征,RT—PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结果5-氮杂胞苷诱导后,部分细胞体积增大,呈“棒状”或“珠状”结构,有肌管样结构形成,透射电镜下有肌丝、心房颗粒及线粒体等心肌样细胞超微结构形成,RT—PCR检测显示有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结论经5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的初步实验观察

目的体外培养并诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞。方法采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学的方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果诱导后细胞体积较诱导前增大,而且更加细长,呈长梭形。14d细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致。免疫细胞化学染色显示Desmin,α-SarcomericActin和心肌特异性cTnI呈阳性反应。结论MSCs可能具有表达心肌细胞的特异性启动或分化调控基因,5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化。     

骨髓间充质干细胞体内诱导分化为心肌细胞的初步实验观察

目的：初步观察MSCs墨体内诱导分化为心肌细胞的能力。方法：从大鼠双侧股骨骨髓获得MSCs，在体外纯化、扩增后，DAPI进行细胞标记，然后注射到急性心肌梗塞模型鼠和正常大鼠的心肌组织内，饲养2～4周后，处死动物在注射点获取心肌标本，初步采用肛染色和电镜观察形态学的方法对分化的心肌细胞进行鉴定，并用免疫组化法从组织学上对转化心肌细胞进行心肌特异性抗原的检测。结果：MSC进行DAPI的标记效率高，电镜观察与宿主心肌细胞问形成了闰盘，组化检测有心肌特异性抗原的出现。结论：在宿主心肌组织内，MSCs具有分化为心肌细胞的能力。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为心肌细胞实验方法的建立

目的:探讨体外培养并诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs) 分化为心肌细胞（CMs）的实验方法。方法:采用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离、纯化hMSCs,采用5-氮杂胞苷( 5-Aza)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对hMSCs进行联合诱导,诱导3～4周,观察细胞形态学的变化,免疫组织化学方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果:hMSCs体外经5-Aza 和bFGF联合诱导1～2周后,细胞体积较诱导前增大,呈长梭形。诱导2～3周后细胞伸出伪足呈多爪形;诱导3～4周后细胞伪足间相互连接形成肌管样结构。联合诱导3～4周后免疫组织化学鉴定结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnⅠ)和横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）表达均呈阳性。结论:hMSCs在体外经5-Aza和bFGF联合诱导可以分化为CMs。     

心肌细胞培养环境对骨髓间充质干细胞定向分化成心肌样细胞有促进作用

目的:研究心肌细胞培养微环境对骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化成心肌样细胞的影响.方法:取SD大鼠骨髓,通过贴壁法进行骨髓间充质干细胞培养,经多次传代后获得较纯的MSCs.用5-氮胞苷(5-aza)进行诱导分化,实验组为在玻片上的5-aza干预的MSCs移入到心肌细胞培养环境中;对照组为5-aza干预的MSCs.显微镜下观察两组形态变化,并通过免疫组化鉴别心肌心肌特异蛋白Desmin和肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)表达及其出现时间的早晚.结果:对照组MSCs诱导后10天可见细胞由原来扁平多角形变成长梭形,15天后部分细胞体明显增粗,可见到有些细胞间有融合样情况发生,20天左右类似肌管样细胞出现.而实验组在17天左右可以看到类似心肌管样细胞.免疫组化表明实验组的阳性结果出现的时间比对照组要早.结论:心肌细胞培养环境对骨髓间充质干细胞定向分化成心肌样细胞有促进作用.     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:比较5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)于不同浓度、不同孵育时间对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)向心肌样细胞分化的影响;观察诱导后不同时间点心肌标志物的表达情况.方法:体外分离培养Wistar大鼠MSC,传代纯化后进行诱导实验.浓度分组(C1-C4):分别以3、5、10、20μmol/L5-aza处理24h,之后更换新鲜培养基继续培养.时间分组(T1-T5):以10μmol/L分别孵育6h、12h、24h、48h、72h,之后更换新鲜培养基继续培养.各组均于首次加药4周后行免疫细胞化学染色检测.RT-PCR检测10μmol/L5-aza处理后2、4、8周细胞GATA4mRNA、cTnTmRNA的表达情况.结果:经5-aza诱导处理后4周,C1-C4组Desmin及α-Sarcomeric Actin染色阳性率各组比较均无统计学差异(P＞0.05);而T1-T5各组其阳性率比较存在统计学差异(P＜0.01).RT-PCR显示,诱导后2周,GATA4mRNA开始表达,持续至8周;cTnTmRNA在诱导后2周无表达、4周时弱表达,8周时更为显著.结论:成年人鼠MSC在适当浓度5-aza处理后可以向心肌样细胞分化,在3μmol/L～20μmol/L范围内,5-aza浓度的变化对MSC的分化率影响较小;在48h内,适当延长5-aza的孵育时间可能增加MSC向心肌样细胞的转化率.     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化观察

目的：探讨5-氮胞苷（5-aza）对纯化培养的骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的影响.方法：取雄性Wistar大鼠下肢长骨骨髓进行体外培养和连续传代,取第3代MSCs以10 μmol/L 5-aza诱导作用24 h后,用含体积分数为5%胎牛血清的完全培养基继续培养,观察细胞形态学变化,并在4周后行免疫细胞化学染色鉴定α-Actin,Desmin及心肌特异性肌钙蛋白T（cTnT）的表达.结果：5-aza作用MSCs 7d后细胞形态及排列发生变化,14～21 d左右细胞数量较诱导前明显减少,28 d后细胞稀落,周围伸出多个长的突起,细胞体积大小不等.经抗α-Actin抗体、抗Desmin抗体、抗cTnT抗体鉴定部分细胞出现阳性染色,阳性细胞率分别为20%,19%和10%.结论：骨髓间充质干细胞在体外特定的诱导条件下可以向心肌样细胞分化,有望成为缺血性心脏病细胞移植治疗的细胞材料.     

当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的：研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的作用。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养。MSC用20μl当归注射液／ml含10％胎牛血清的L—DMEM为预诱导条件，预诱导24h后用当归注射液100μl/ml不含胎牛血清的L—DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP性。结论:大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

骨髓间充质干细胞体外培养分化为肌原性细胞的实验研究

目的　研究骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为心肌细胞的可行性。方法　由新西兰大白兔胸骨获取骨髓间充质干细胞 ,培养传代后用 5 -氮杂胞苷诱导 2 4h ,免疫组化检测诱导后细胞的变化。结果　 5 -氮杂胞苷诱导后的细胞经免疫组化检测可见细胞被抗肌红蛋白抗体着染显色。结论　骨髓间充质干细胞可在体外经 5 -氮杂胞苷诱导后转化为肌原性细胞。     

5-氮胞苷诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化的毒理遗传学研究

目的：观察5-氮胞苷（5-aza）对成人脂肪间充质干细胞（ADMSCs）向心肌细胞方向诱导分化的毒理遗传学影响.方法：自成人脂肪组织中分离培养ADMSCs,用5-aza对ADMSCs进行诱导,设立不同诱导浓度的I,II,III,（5,10,20μmol/L）组及对照组IV,光镜下观察细胞的生长情况及形态学变化,免疫细胞化学方法检测心肌特异性肌钙蛋白I（cT-nI）,RT-PCR方法检测cTnI基因的表达,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,并对各诱导组常规核型分析.结果：诱导后4wk I,II,III组ADMSCs呈现类似心肌细胞的形态学特征.I,II,III组免疫组化结果见cTnI阳性表达,RT-PCR条带见cTnI基因表达.各组染色体结构及数目均未见异常.结论：5-aza作为诱导剂对ADMSCs遗传性无不良影响.