mtLSU-巢式PCR检测实验大鼠卡氏肺孢子虫的实验研究

目的 对mt1SU-巢式PCR方法 检测大鼠卡氏肺孢子虫的应用价值以及基因序列进行评价.方法 采用地塞米松免疫抑制法诱导大鼠感染肺孢子虫;实验组10只,对照组1只;诱导至第7周时收集实验组及对照组大鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)标本,采用 mtLSU-巢式PCR方法 对人源与鼠源肺抱子虫共有的基因进行扩增和序列...     

改良卡氏肺孢子虫肺炎动物模型的建立

目的 为了缩短诱发大鼠卡氏肺孢子虫肺炎（ＰＣＰ）的时间,减少二重感染,我们对建立大鼠ＰＣＰ模型的方法进行了改良。方法 用地塞米松皮下注射Ｗｉｓｔａｒ大鼠２次／周。第２周时实验组气管内注入冻存的卡氏肺孢子虫,阴性对照注射正常大鼠肺匀浆,４周后剖杀大鼠。同时作常规卡氏肺孢子虫大鼠模型对照。８周后剖杀大鼠,结果 实验组大鼠ＰＣ感染９０％（９／１０）,阴性对照仅２０％（２／１０）,常规大鼠模型组虽ＰＣ感染     

地塞米松诱发大鼠卡氏肺孢子虫肺炎实验研究

目的 在地塞米松磷酸钠诱导下建立大鼠卡氏肺孢子虫肺炎的动物模型。方法 将40只雌性SD大鼠随机分为实验组和对照组,前者皮下注射地塞米松磷酸钠,1mg/次,2次/w;后者不做任何处理。观察两组大鼠的发病情况,并每隔3周两组各取5只动物进行病原学检查。结果 实验组大鼠第6周开始发病,肺印片、支气管肺泡灌洗液沉渣中查到卡氏肺孢子虫包囊及滋养体;对照组大鼠无异常表现,病原学检查阴性。结论 在地塞米松磷酸钠诱导下可成功建立大鼠卡氏肺孢子虫肺炎动物模型。     

卡氏肺孢子虫肺炎动物模型建立及其检测方法

用皮下注射醋酸可的松法诱导大鼠卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)模型,成功率20％。对PCP模型大鼠(n=6)进行诊断采样,结果:肺病理学检查卡氏肺孢子虫(PC)检出率为100％(6/6)。用经支气管肺活检(TBLB)法临床诊断1例早期PCP。支气管肺泡灌洗液(BALF)涂片和肺组织印片的姬姆萨染色,可见PC囊内小体及滋养体。改进的哥氏银染适用于肺组织切片,包囊壁浓染呈黑色,易于识别。对于免疫功能低下怀疑为PCP患者,应尽早作TBLB和(或)BAL检查,可以达到早期诊断。     

卡氏肺孢子虫在小鼠肺内的发育及引起的病理变化

目的　观察小鼠卡氏肺孢子虫肺炎病原和病理学改变。方法 :昆明小鼠皮下注射醋酸可的松诱发小鼠卡氏肺孢子虫肺炎。肺印片 Giem sa染色检查卡氏肺孢子虫包囊 ;常规石蜡切片 ,HE染色、PAS染色及 GMS染色观察病理学改变。结果 :自用药第 5周肺印片即可检出卡氏肺孢子虫包囊 ,第 8周包囊检出率达 81.82 % ;HE染色切片早期以淋巴细胞、单核细胞渗出为主的间质性肺炎 ;晚期间质性肺炎加重 ,肺泡腔内出现泡沫样渗出物 ;PAS染色切片泡沫样渗出物呈桃红色阳性反应 ;GMS染色切片可见染成黑色的包囊。结论 :本研究为建立卡氏肺孢子虫肺炎动物模型提供了病原形态学和病理学依据。     

卡氏肺孢子虫DNA的PCR检测

①目的探讨卡氏肺孢子虫的检测方法及感染状况。②方法收取病人痰液、肺组织及支气管灌洗液，常规方法提取ＤＮＡ，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测卡氏肺孢子虫ＤＮＡ，并与吉氏染色结果进行比较。③结果８６例住院病人，卡氏肺孢子虫ＤＮＡ的ＰＣＲ检出率为４１．９％，卡氏肺孢子虫包囊吉氏染色法的检出率为１４．９％，两种方法的检出率比较，差异有显著性（ｕ＝６．６３８，Ｐ＜０．０５）。尿毒症、肺癌、血液病和肺部炎症病人卡氏肺孢子虫ＤＮＡ的ＰＣＲ检出率分别为３７．５％，６１．５％，５０．０％和２０．８％，差异有显著性（χ２＝９．０１，Ｐ＜０．０５）。痰液、肺组织和支气管灌洗液标本，卡氏肺孢子虫ＤＮＡＰＣＲ的检出率分别为２８．６％，６１．９％和７７．８％，差异有极显著意义（χ２＝１２．３０，Ｐ＜０．０１）。吉氏染色法检测出的１０份卡氏肺孢子虫包囊阳性标本，ＰＣＲ检测皆为阳性；５７份阴性标本，ＰＣＲ检测出１５份为阳性。４份结核标本ＰＣＲ检测皆为阴性。④结论ＰＣＲ技术检测肺组织和支气管灌洗液标本中的卡氏肺孢子虫ＤＮＡ，具有较高的敏感性和特异性     

卡氏肺孢子虫感染大鼠模型的建立及表面糖蛋白基因的克隆

目的：建立卡氏肺孢子虫感染大鼠模型并对卡氏肺孢子虫表面糖蛋白基因进行克隆，为进一步对该基因进行表面作前期准备，方法：以地塞米松对大鼠进行免疫抑制，2周后喂予感染卡氏肺孢子虫的大鼠肺组织匀浆，再免疫抑制4周，诱导鼠模产生，经光镜及PCR检测证实阳性后，用PCR法扩增出卡氏肺孢子虫的表面糖蛋白基因并亚克隆入T载体，转化JM109大肠杆菌，结果：经光镜和PCR检测证实实验组大鼠均感染了卡氏肺孢子虫；PCR产物经琼脂糖电泳后，扩增片段的长度为319bp，结论：通过地塞米松免疫抑制和一次性喂予病原体可以建立卡氏肺孢子虫感染大鼠模型。     

卡氏肺孢子虫感染大鼠模型的建立及表面糖蛋白基因的克隆

目的建立卡氏肺孢子虫感染大鼠模型并对卡氏肺抱子虫表面糖蛋白基因进行克隆,为进一步对该基因进行表达作前期准备。方法 以地塞米松对大鼠进行免疫抑制,2周后喂于感染卡氏肺孢子虫的大鼠肺组织匀浆,再免疫抑制4周,诱导鼠模产生。经光镜及PCR检测证实阳性后,用PCR法扩增出卡氏肺孢子虫的表面糖齿白基因并亚克隆入T载体,转化JM109大肠杆菌。结果 经光镜和PCR检测证实实验组大鼠均感染了卡氏肺孢子虫;PCR产物经琼脂糖电泳后,扩增片段的长度为319bp。结论通过地塞米松免疫抑制和一次性喂予病原体可以建立卡氏肺孢子虫感染大鼠模型。     

卡氏肺孢子虫肺炎病原学检查的实验研究

目的：比较卡氏肺孢子虫的染色效果。方法：给SD大鼠皮下注射地塞米松。制作肺泡灌洗液的涂片和肺组织印片，采用姬氏染液、甲苯胺蓝和六亚甲基四胺银进行染色，油镜观察。结果：姬氏染液染色后，肺孢子虫包囊结构清晰可辨。结论：姬氏染色法可作为卡氏肺孢子虫的常规诊断方法。     

蒿甲醚治疗卡氏肺孢子虫肺炎大鼠及其对IL-2的影响

目的探讨蒿甲醚对卡氏肺孢子虫肺炎大鼠IL-2的影响。方法给SD大鼠皮下注射地塞米松磷酸钠建立卡氏肺孢子虫肺炎动物模型,治疗组给予蒿甲醚治疗。放免法和酶免法分别检测血清和支气管肺泡灌洗液中IL-2水平。结果和感染对照组比较,蒿甲醚治疗组大鼠症状显著改善,肺印片中卡氏肺孢子虫包囊数目显著减少,肺组织炎症明显减轻,血清和肺泡灌洗液中IL-2水平分别为3.13+0.29 ng/ml和294.44+65.64 pg/ml,与感染组5.63+0.67 ng/ml和594.80+102.20pg/ml相比明显降低,有显著性差异(p<0.01)。结论蒿甲醚具有一定抗大鼠卡氏肺孢子虫肺炎作用,能够降低PCP大鼠IL-2。     

Iron chelator daphnetin against Pneumocystis carinii in vitro

Background Although there are several drugs and drug combinations for the treatment of Pneumocystis carinii ( P. carinii) pneumonia, all drugs have the toxicity as well as low efficacy. Iron chelators have been proposed as a source of new drugs for combating these infections. Wehypothesized that iron chelators would suppress the growth of P. carinii by deprivation of the nutritional iron required for growth. In this study, a short-term axenic culture system of P. carinfi was established. Daphnetin (7,8-dihydroxycoumarin), a known iron chelator, was demonstrated to exhibit in vitro activity against P. carinii in this system.Methods P. carinfi organisms were obtained from the lungs of immunosuppressed rats. The culture system consisted of Iscove Dulbecco Eagle‘s Minimum Essential Medium (IMDM), supplemented with S-adenosyI-L-methionine, N-acetylglucosamine, putrescine, L-cysteine, L-glutamine, 2-mercaptoethanol, and fetal bovine serum, and was maintained at 37℃, in 5% CO2, 95% O2, at the optimal pH of 8.0. The culture system was used to assess the effect of daphnetin on the proliferation of P. carinii organisms. The ultrastructures of the treated organisms were observed by transmission electron microscopy.Results The number of cysts and trophozoites increased 8- to 9-fold and 11 - to 12-fold, respectively,after 10 days of culture. Daphnetin was found to suppress the growth of P. carinfi in a dose-dependent manner at concentrations between 1 μmol/L and 20 μmol/L. The inhibitory activity was suppressed by the chelation of daphnetin with ferrous sulfate in a 2:1 molar ratio, but it was not suppressed by mixing the culture medium with magnesium sulfate. Reduction of P. carinii numbers after treatment with daphnetin correlated with morphological changes in the organisms, as determined by transmission electron microscopy.Conclusions Daphnetin can suppress the growth of P. carinii in vitro. The efficacy of daphnetin in suppressing the the growth of P. carinii in vitro is related to its ability to chelate iron.     

机会致病原虫动物模型在实验教学中的应用

目的探讨机会性致病原虫在实验教学中的应用效果。方法选择卡氏肺孢子虫为机会致病原虫的代表虫种,Wistar大鼠为实验动物。实验课中给实验动物口服免疫抑制剂,学生按时观察实验动物的生理状态变化,并称体重后记录。至第3周取卡氏肺孢子虫肺组织匀浆,经右胸注入部分对照组和实验组大鼠体内。第6周解剖大鼠观察肺部病理变化,并取肺组织制片检查病原体。结果实验组大鼠口服免疫抑制剂醋酸地塞米松,5周后一般状态较差,有明显的脱毛,咳喘等现象;体重由原来的160～180g下降至120～140g;肺组织印片查到卡氏肺孢子虫。对照组大鼠在实验过程中体重逐渐增加,由原来的160～180g增至190～210g;一般情况良好,肺印片镜检未发现卡氏肺孢子虫。学生在实验报告中记录了观察和检查结果,对机会性致病原虫的致病特点有深刻认识。结论有效的实验操作是保证教学质量和培养创造性思维的关键。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

卡氏肺孢子虫透射电镜观察

目的 研究卡氏肺孢子虫的超微结构、发育增殖过程及其在肺组织内的寄生情况，探讨其致病机制。方法用地塞米松诱导大鼠卡氏肺孢子虫肺炎，取肺组织制成透射电镜标本，观察虫体的超微结构及其在肺组织内的寄生与发育状况。结果 可见滋养体的生殖方式有二分裂、外出芽、内出芽及接合生殖以及囊前期和包囊内的囊内小体的分裂增殖过程。虫体内有丰富的线粒体，且随虫体的发育和分裂，线粒体的数量、大小和形状也发生明显的变化。虫体主要分布在肺泡腔内，并可见有多个滋养体紧密吸附于Ⅰ型肺泡上皮细胞表面。偶见滋养体吸附于Ⅱ型肺泡上皮细胞表面。另外还发现滋养体寄生于Ⅰ型肺泡上皮细胞内、间质内，还可以在血管内皮细胞内、血管腔内、及巨噬细胞内见到。结论 卡氏肺孢子虫的生活史由滋养体、囊前期和包囊3个发育阶段构成，生殖方式包括有性生殖和无性生殖两种类型。虫体主要寄生于肺泡腔内，也见于Ⅰ型肺上皮细胞内、巨噬细胞和间质内。并表明虫体的吸附可能会对肺泡气体交换起到机械阻隔作用而影响肺换气。     

老年卡氏肺孢子菌肺炎的诊断和治疗

目的提高对老年人群患卡氏肺孢子菌肺炎(PCP)的诊治和认识。方法对二例老年PCP患者的诊断和治疗经过进行总结和讨论。结果二例老年PCP患者经临床体格检查、影像学检查和痰标本涂片姬姆萨(或甲紫色蓝)染色查到卡氏肺孢子菌(PC)或PCR( )而获诊。一例PCP患者选用复方磺胺甲口恶唑(SMZco)治愈,另一例初用SMZco后因为发生不良反应而改用卡泊芬净治愈。结论PCP是在老年肺癌或长期住院机械通气患者易患的机会性感染,通过痰标本PCR检测阳性或痰涂片染色查到PC而确诊,应与其他肺炎做鉴别诊断。PCP治疗首选SMZco,当SMZco发生不良反应或者失败时可改用卡泊芬净治疗。     

扫描电镜观察双氢青蒿素对大鼠体内卡氏肺孢子虫表面形态的影响

目的研究双氢青蒿素对卡氏肺孢子虫表面结构的影响.方法 Wistar大鼠皮下注射地塞米松磷酸钠7周诱导建立卡氏肺孢子虫肺炎动物模型,用双氢青蒿素治疗大鼠,并用扫描电镜观察大鼠肺组织卡氏肺孢子虫表面结构的变化.结果扫描电镜下,卡氏肺孢子虫表面有密集的类似微绒毛的结构,呈念珠状或小簇状,通过其丝状伪足可与Ⅰ型肺泡上皮细胞或虫体间相粘连.经双氢青蒿素治疗后,卡氏肺孢子虫表面微绒毛脱落,残存微绒毛变形,虫体表面出现凹陷,表膜出现较大较深的缺损.结论双氢青蒿素可破坏卡氏肺孢子虫表膜.     

Nested polymerase chain reaction in detection of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes

目的　检测蚊体内间日疟原虫DNA。方法　以疟原虫SSurRNA为模板 ,采用套式PCR扩增间日疟原虫特异性 12 1bp片段。结果　在实验感染蚊中 ,套式PCR可检测到低至 3个间日疟原虫子孢子的DNA或 10 0只蚊中的一只阳性蚊 ,而其它 3种人疟原虫或正常蚊DNA未扩增出条带。结论　套式PCR的敏感性及特异性表明 ,该方法在检测蚊体内少量疟原虫感染时 ,比DNA探针或直接PCR具有更大优越性。