CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的 建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法 针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008~2012年期间采集的1344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1344份标本进行检测,结果TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40分钟。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

目的建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008～2012年期间采集的1 344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1 344份标本进行检测,结果 TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40 min。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

MRFQ SYBR Green I-PCR结合融解曲线快速检测产ESBLs菌耐药基因

目的 探讨SYBRGreenⅠ实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析方法快速检测常见超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）耐药基因的可行性。方法选取经测序验证携带有tern、shy、ctx—m-1组、ctx-m-9组耐药基因的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌作为阳性菌株,建立细菌耐药基因SYBRGreen1实时荧光定量多重PCR检测体系,这四种耐药基因的扩增产物片段长度和融解温度（Tm值）都不同,可通过结合融解曲线分析加以区别。用此体系检测110株大肠埃希菌和94株肺炎克雷伯菌,根据特异性Tm值的有无和差别判断是否携带有耐药基因及携带耐药基因型别。结果与耐药表型、琼脂糖电泳、测序结果对照。结果经SYBRGreenⅠ实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析,分别有47株（42．7％）大肠埃希菌和34株（36．2％）肺炎克雷伯菌携带有这四种常见的ESBLs耐药基因,与表型确证实验和电泳结果比较达到100％的一致性;根据Tm值的不同,对耐药基因进行鉴别,携带单个耐药基因菌株的检测与电泳结果和测序结果比较达到100％的一致性;对携带多个耐药基因菌株的检测不能达到较好的分辨性。结论SYBRGreenI实时荧光定量多重PCR结合融解曲线分析方法可以快速筛查常见超广谱β-内酰胺酶（EsBI曲耐药基因,对携带单个耐药基因的细菌的基因型能进行准确鉴定。这对指导临床医生合理使用抗生素进行临床治疗和对耐药细菌的流行病学监测具有重要价值。     

双重实时荧光PCR在手足口病快速检测中的应用

目的 探讨双重实时荧光PCR 技术检测手足口病肠道病毒的应用效果.方法 用单一实时荧光PCR先检测标本中的肠道病毒通用病毒核酸,肠道病毒通用病毒核酸阳性再分别用双重实时荧光PCR及单一实时荧光PCR检测CoxA16型和EV71型特异性核酸,比较两种方法检测结果.结果 240份标本中肠道病毒通用型核酸阳性157份,双重实时荧光PCR法CoxA16阳性111份,EV71阳性1份,其他肠道病毒45份,单一实时荧光PCR法CoxA16阳性109份,EV71阳性1份,CoxA16+EV71阳性2份,其他肠道病毒45份.EV71和其他肠道病毒符合率为100%.结论 双重实时荧光PCR 检测技术可以准确检测手足口病肠道病毒,且特异性强、灵敏度高,又可以快速得到检测结果,是一种快速检测手足口病病毒的方法.     

实时定量聚合酶链反应检测腹泻粪便中小肠结肠炎耶尔森菌的研究与评价

目的 建立一种快速准确的分子生物学方法检测腹泻粪便中小肠结肠炎耶尔森菌,以替代繁琐费时的培养鉴定方法.方法 应用针对致病性小肠结肠炎耶尔森菌染色体上yst基因而设计的特异引物和探针进行实时定量聚合酶链反应（PCR,探针法）,检测致病性（7种血清型）和非致病性（5种）小肠结肠炎耶尔森菌、耶尔森菌属内的其他菌种（8种）及其他肠道细菌（8种）.此外,实时定量PCR检测经过培养方法鉴定的腹泻粪便200例,并比较两种方法的吻合度.结果 引物和探针对致病性小肠结肠炎耶尔森菌100%特异,与其他细菌无交叉反应.在纯培养物和粪便中,最低检测浓度分别为102菌落形成单位（CFU）/ml和103 CFU/g.在200例样本中,培养鉴定方法和实时定量PCR检出同样18例阳性样本,吻合度为100%.结论 实时定量PCR反应对致病性小肠结肠炎耶尔森菌高度特异且与培养鉴定方法有很好的吻合性又方便快捷,可应用于临床检测.     

RTFQ—PCR法和胶体金免疫层析法快速检测霍乱弧菌

目的寻求简便、可靠的快速检测霍乱孤菌的方法,以提高霍乱实验室确诊的时效性。方法采用实时荧光定量PCR法和胶体金免疫层析法对珠海市外环境水体、水产品264份标本进行霍乱孤菌快速检测,并与国标方法进行比较。结果264份标本中按国标方法培养和标准诊断血清检测霍乱孤菌12株,阳性率为4．55％;实时荧光定量PCR法检测阳性8份,一致性为0．9924、灵敏度为100％、特异度为99．22％;胶体金免疫层析法检测阳性10份,一致性为0．9848、灵敏度为80．00％、特异度为99．21％。结论两法操作快速,结果准确,一致性好,特异性强、敏感性高,适用于筛查。胶体金免疫层析法稍逊于实时荧光定量PCR法。但两法均不能鉴定菌型,也出现漏检,所以作为疾病的诊断,应以培养法为标准。     

荧光定量PCR在结核菌快速检测中的应用分析

目的探讨荧光定量PCR在结核菌快速检测中的应用效果。方法选取安阳市结核病防治所2014年6月至2014年12月就诊的100例呼吸系统疾病患者(临床阳性痰分离株100份),应用荧光定量PCR技术检测。结果荧光定量PCR检测准确率为97%,菌种鉴定特异性实验符合率为100%。结论结核菌快速培养法如荧光定量PCR技术经济、简单,结果可靠,特异度和敏感性均居较高水平,鉴别诊断能力较强,实验室可据自体条件对不同的检测方法进行选择。     

辣椒中常见产毒性真菌的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR检测方法

目的将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用,建立辣椒样品中常见3类（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）产毒
性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA（rDNA）基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针,联用裸磁珠富
集技术,建立多重实时荧光定量PCR体系,并评价所建方法的灵敏度、特异性、重复性和一致性。结果裸磁珠-多重实时荧光定
量PCR方法灵敏度高,与本研究优化后的普通实时荧光定量PCR相比提高了10倍,是原报道的100倍,直接检测辣椒样品中3
类产毒性真菌的检出限均可达103 CFU/ml,即104 CFU/g,且特异性良好（与非目标菌无交叉反应）、重复性良好（CV<1.5%）,该
方法模拟检测辣椒样品中3 类产毒性真菌的计数结果与标准培养法的计数结果相比均无统计学差异（P>0.05）,实验过程仅
需7 h（标准培养鉴定法耗时7~14 d）。结论构建的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法能大大缩短产毒性真菌的检测时间,并
成功应用于模拟辣椒样品中常见3类产毒性真菌的定量检测,值得进一步研究和推广。
     

荧光PCR对从业人员肠道致病菌筛查的评价

目的评价荧光PCR法用于食品及公共场所从业人员肠道致病菌的筛查。方法随机采集12780份从业人员肛拭子标本用荧光PCR检测,以传统分离培养方法作为“金标法”进行对照,分析灵敏性和特异性。结果在12780份标本中,荧光PCR检测出沙门菌阳性14份,阳性率为1.10‰,培养法检测出10份,阳性率为0.78‰,沙门菌荧光PCR检测法的灵敏度为100％,特异性为99.97％。荧光PCR检测出志贺菌18份,阳性率为1.41‰,培养法检测出3份,阳性率为0.23‰,志贺菌荧光PCR法的灵敏度为100％,特异性为99.88％。结论荧光PCR法灵敏度性高,特异性强,简便快速,为从业人员健康检查提供了一套快速的筛查方法,值得广泛推广应用。     

实时荧光定量聚合酶链反应在检测大肠埃希菌引起血流感染中的应用

目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在检测大肠埃希菌引起血流感染中的应用.方法 从血培养阳性瓶中提取细菌基因组DNA,以大肠埃希菌特异性引物应用实时荧光定量,扩增16S rRNA靶片段,同期进行细菌培养鉴定,对比实验结果.结果 通过对实时FQ-PCR体系特异性、敏感度、稳定性验证,结果表明具有较好的特异性...     

产KPC肺炎克雷伯菌检测方法构建与耐药机制

目的 探讨产肺炎克雷伯型碳青霉烯酶(KPC)肺炎克雷伯菌检测方法以及肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制、可能的治疗药物.方法 选取K-B法证实的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌36株纳入本研究,使用改良Hodge试验、Carba NP试验对菌株进行验证,随后采用PCR扩增、产物琼脂糖凝胶电泳实验,并对电泳阳性条带进行基因测序鉴定.结果 K-B法药敏试验显示36株耐碳氢烯类肺炎克雷伯菌,随后行Hodge验证,33株(91.7%)是产KPC肺炎克雷伯菌,对碳氢烯类耐药而对替加环素及米诺环素仍然敏感.对Hodge试验阳性33株再行Carba NP试验确证,其中27株(87.9%)阳性,6株(12.1%)阴性;对Hodge试验阳性33株行PCR扩增及电泳实验,共有27株出现目标条带(340 bp)提示阳性,与Carba NP试验结果相一致.对出现目标条带的27株肺炎克雷伯菌再进行KPC-2耐药基因PCR扩增产物测序,均为KPC-2型耐药基因.结论 K-B法药敏试验加随后改良Hodge试验验证对于筛查、发现KPC肺炎克雷伯菌具有较高的符合度,为发现KPC肺炎克雷伯菌有效筛查方法.K-B法药敏试验证实对KPC肺炎克雷伯菌,替加环素等可能是有效治疗的药物之一.Hodge试验检测的KPC肺炎克雷伯菌,存在12.1%(6/33)的假阳性率.Carba NP 试验及PCR扩增检测一致性好,具有确证产KPC肺炎克雷伯菌作用.随后的测序研究结果表明检测出的KPC肺炎克雷伯菌均为KPC-2,该型是引起肺炎克雷伯菌对碳青酶烯酶耐药的主要机制.     

PCR法与培养法检测儿童肺炎易感细菌结果比较

目的探讨PCR法和培养法对儿童肺炎易感细菌检测的应用价值。方法采用PCR法及细菌培养法对113例呼吸道感染患儿的临床标本进行检测,对两种检测方法的结果进行比较。结果 113例临床标本中,培养法检测阳性率46.9%(53/113),其中流感嗜血杆菌2例,大肠埃希菌8例,肺炎克雷伯菌15例,肺炎链球菌3例,金黄色葡萄球菌12例,表皮葡萄球菌6例,铜绿假单胞菌7例。PCR法检测阳性率69.9%(79/113),在79例阳性标本中检出病原菌85株,其中73例标本检测出单一病原,6例标本为混合感染。流感嗜血杆菌18例,大肠埃希菌8例,肺炎克雷伯菌17例,肺炎链球菌16例,金黄色葡萄球菌10例,表皮葡萄球菌10例,铜绿假单胞菌6例。结论与培养法相比,PCR法可以提高肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等较难培养细菌的检出率,应将PCR法与培养法结合作为肺炎易感细菌的检测方法,为临床医师合理选择抗生素奠定基础。     

呼吸机相关性肺炎患者细菌病原的对比研究

目的 探讨呼吸机相关性肺炎患者细菌病原特点.方法 选取确诊呼吸机相关性肺炎的患者85例为研究对象,将所获下呼吸道分泌物为标本,留标本一分为二,一份于30分钟内行分离培养加药敏检测;另一份置-80℃冰箱保存,集中进行多重PCR检测.采用多重PCR方法检测5种呼吸机相关性肺炎常见细菌病原菌的阳性率及分布情况.结果 常规分离培养呼吸机相关性肺炎患者检出21株致病菌,阳性率为24.7％（21/85）,G-菌占85.7％（18/21）;多重PCR检测呼吸机相关性肺炎患者检出69株致病菌,阳性率为81.2％ （69/85）,G-菌占89.9％（62/69）.标本采集前有71.7％（61/85）的患者采用了抗生素治疗,分离培养阳性率为11.5％（7/61）,多重PCR阳性率为80.3％（49/61）.结论 呼吸机相关性肺炎患者下气道感染病原以革兰氏阴性菌为主;多重PCR检测的阳性率高于分离培养,这在已使用抗生素治疗的患者中尤为有效,可以作为分离培养的有利补充.     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应（PCR）合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16S rRNA的通用探针，并用生物素标记DNA探针，分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交，细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA，100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌，其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异，具有较高的应用价值．可应用于临床检测。     

两种不同基因引物检测痰液标本中肺炎链球菌的比较

目的建立cpsA和spn9802两种引物基因定量检测肺炎链球菌检测方法。方法根据基因库中两种基因的序列设计特异性引物,对127例肺炎患者痰液标本进行荧光定量PCR检测,比较两种方法检测的敏感性和特异性,并用传统痰培养方法同时检测标本。结果所有传统微生物检测肺炎链球菌阳性的12例标本在cpsA和spn9802检测中均为阳性;在传统微生物检测肺炎链球菌阴性的114例标本中cpsA法9例阳性,spn9802法29例阳性。统计分析表明,3种方法的阳性率比较存在显著性差异(P<0.05)。结论 cpsA和spn9802两种引物基因定量检测肺炎链球菌能提高肺炎患者痰液标本肺炎链球菌的阳性率。两种引物共同检测结果与培养结果相符,有一定的临床应用价值。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应(PCR)合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16SrRNA的通用探针,并用生物素标记DNA探针,分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交,细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA,100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌,其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异,具有较高的应用价值,可应用于临床检测。     

肺炎患儿肺炎支原体感染的实验室检测

目的：探讨肺炎患儿肺炎支原体（ＭＰ）感染的实验室检测方法。方法：使用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测６７６例肺炎患儿ＭＰ的感染,其中１３９例同时采用支原体培养进行检测;１１２例做间接血凝试验（ＩＨＡ）。结果：ＰＣＲ法对ＭＰ感染的检出率明显高于培养法（Ｐ〈０．０１）,双份血清ＩＨＡ的检测率和ＰＣＲ法比较无显著性差异（Ｐ〉０．０５）,单份血清ＩＨＡ的检出率明显低于ＰＣＲ法（Ｐ〈０．０１）。结论：ＰＣＲ法     

实验动物四种病原体多重PCR方法的建立与应用

目的建立快速检测多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的多重PCR方法。方法根据Gen Bank基因设计出特异性引物;经过多重PCR的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染样本和实验动物的气管分泌物,并与传统方法做对比。结果多重PCR扩增出多杀巴氏杆菌(356 bp)、支气管鲍特杆菌(237 bp)、支原体(266 bp)和肺炎克雷伯杆菌(142 bp)的目的条带。肺炎克雷伯杆菌敏感性为10 pg,多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体敏感性为1 pg,特异性检测未从其他病原菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测人工感染样本的不同组合,45只实验动物气管检测出15只多杀巴氏杆菌阳性,9只肺支原体阳性,但传统培养方法和血清学方法未检测出阳性标本。结论本文建立的多重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的快速检测。     

鼻咽癌患者放疗期间口咽细菌动态变化及耐药性分析

目的了解鼻咽癌患者在放疗过程中并发口咽感染细菌动态变化及其耐药性,为临床预防和治疗提供可靠依据。方法对150例首次住院治疗的鼻咽癌患者,在放疗前、每放疗一周后等不同时间进行咽拭子细菌培养,并对培养出的菌株及其耐药性进行分析。结果 150例患者共送检标本1 116份,培养出408株细菌,阳性率为36.56%;细菌的分布以G-杆菌为主(占77.45%),其次为真菌(占13.73%);排前五位的细菌依次为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、假丝酵母菌、铜绿假单胞菌、洛非氏不动杆菌。在放疗期间,总的细菌培养阳性检出率均呈上升趋势(P<0.05),铜绿假单胞菌及假丝酵母菌培养的阳性检出率也呈上升趋势(P<0.05)。其他克雷伯菌、阴沟肠杆菌、葡萄菌属、假丝酵母菌放疗前未检出,但放疗后可以检出。所检出细菌对大多数对β-内酰胺抗菌药物耐药,白色假丝酵母菌对伊曲康唑、氟康唑的耐药率分别为98.08%、73.08%。结论鼻咽癌放疗随放疗时间的增长,口咽部细菌的检出率呈上升趋势,可影响咽部的微生态平衡,应制定有针对性的口咽部细菌感染的防控措施。     

Real time PCR与常规血培养在血流感染未知病原体鉴定中的比较研究

目的：观察real time PCR在血流感染病原体检测中的敏感性和特异性,并与常规血培养对比,探讨其临床应用价值。方法以该院各临床科室收集的108份脓毒血症患者血液标本进行real time PCR检测,同时进行常规血培养,比较两种方法的特异性和敏感性。结果108份标本当中,两种方法检测出12种病原微生物。 Real time PCR共检测出阳性标本25份,阴性标本83份。其中与血培养共同阳性标本9份,共同阴性标本78份。两方法的一致性为80.6%。Real time PCR的阴性预测值是0.94,敏感性64%,特异性83%。16例标本real time PCR阳性而血培养阴性,5例标本血培养阳性而real time PCR阴性。同时,有2病标超出real time PCR的检测范围,而血培养阳性。此外,real time PCR无法检测光滑念珠菌。结论real time PCR虽然能快速检测血液感染中病原微生物,但依然不能完全替代血培养。