HIV-1广谱中和活性样本膜蛋白基因序列特征分析

目的分析广谱中和活性感染者不同时间点HIV-1膜蛋白基因的序列特征。方法应用单拷贝基因组扩增技术(Single genome amplification,SGA)扩增获得不同时间点样本的全长膜蛋白(Env)基因,分析Env基因可变区序列长度、糖基化位点数目、细胞嗜性及中和表位关键氨基酸的变异。结果系统进化分析显示在5个不同时间点获得的98条全长Env基因为HIV-1 B’亚型毒株;毒株序列随时间推移基因距离增加,V1V2区序列长度变化大于V4区,V3区与V5区序列长度保持恒定;Env基因共享序列有27个潜在糖基化位点(PNGS),V1V2区的糖基化位点数目变化较大,MPER区次之,V3区数目恒定;部分毒株嗜性随时间推移发生了从CCR5到CXCR4的转变;Env基因与广谱中和活性相关的特征氨基酸位点的突变率在4.76%~100.00%间。结论广谱中和活性感染者不同时间点的Env基因序列差异随时间推移而增加,中和单抗识别的关键位点氨基酸存在不同类型和不同程度的突变,表明广谱中和活性感染者体内毒株在免疫压力下持续进化。     

基于HIV-1 pNL4-3构建含CRF07_BC V3的嵌合分子克隆

目的在感染性克隆pNL4-3骨架上构建含CRF07_BC V3的嵌合分子克隆。方法通过融合PCR将CRF07_BC pXJDC13的V3环与pNL4-3的env骨架进行融合并克隆至pNL4-3上。经过鉴定后将阳性V3嵌合克隆pNL4-3/XJDC13V3转染到293T细胞进行病毒包装并检测病毒的感染性。V3嵌合病毒的细胞嗜性分别用Ghost细胞系和MT-2细胞进行测定。结果利用融合PCR克隆方法在pNL4-3骨架上成功构建了含CRF07_BC pXJDC13 V3的嵌合分子克隆pNL4-3/XJDC13V3。该嵌合病毒利用的辅助受体为CCR5,不能利用CXCR4,也不能在MT-2细胞上诱发合胞体。结论在pNL4-3骨架上成功构建了含CRF07_BC pXJDC13 V3嵌合分子克隆pNL4-3/XJDC13V3。该嵌合分子克隆为进一步研究CRF07_BC嗜性转变中V3关键位点提供了有利工具。     

HIV-1广谱中和抗体的研究进展和启示

1983年,Barré-Sinoussi和Montagnier等[1]首次分离到引起获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)的病毒,随后国际病毒分类委员会将其命名为人类免疫缺陷病毒[2](human i mmunodeficiency virus,HIV)。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)及联合国艾滋病规划署(The Joint United Nations Programme on HIV/AIDS,UNAIDS)的最新统计[3],全球范围内HIV的感染人数约为3 330万,仅2009     

HIV-1广谱中和活性感染者假病毒的中和表型分析

目的分析HIV-1广谱中和活性感染者基于膜蛋白基因(env)的假病毒对自体血浆和代表性广谱单克隆中和抗体(bm NAbs)的中和表型。方法单基因组扩增(SGA)广谱中和活性感染者第0月血浆的env基因并克隆至pc D-NA~(TM)3.1 Directional TOPO表达载体,将env表达质粒与HIV-1骨架质粒p SG3△env共转染293T/17细胞制备假病毒,用假病毒分别与自体连续时间点血浆和代表性bm NAbs进行中和实验分析中和表型。结果共获得11株功能性假病毒,假病毒对8个连续时间点自体血浆的中和敏感性呈现先升高(第0~15月),后下降(第16~32月),之后再上升(第33~45月)的波动。所有假病毒对10E8、PGT121和VRC01中和敏感(IC_(50)6μg/m L);各有18.2%(2株)的假病毒对12A21和2G12高度敏感(IC_(50)1μg/m L);所有病毒均对PGT135呈中和抗性。结论假病毒对当前时间点血浆的中和敏感性低,对之后时间点血浆中和敏感性增强,提示感染者体内病毒与中和抗体的动态进化过程。同一时间点假病毒对特定bm-NAbs的敏感性差异明显,提示感染者准种毒株间中和表型的复杂性。     

HIV-1 CRF07_BC毒株gp41 NHR结构域N51的表达及结构分析

目的对来源于HIV-1中国流行株CRF07_BC的包膜糖蛋白gp41NHR结构域的N51进行表达和结构及抗原性分析。方
法运用重叠延伸PCR方法扩增出N51Fd基因,将其插入真核表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2,并进行核苷酸序列测定。利用生物
信息学软件、圆二色谱法、免疫印迹法对表达的N51FdFc-BC重组蛋白进行结构和抗原性分析。结果成功构建pFUSE/
N51Fd-BC表达载体,并在真核表达体系实现了目的蛋白的高效表达。免疫印迹结果显示该重组蛋白大小约为35000,可与抗
HIV-1gp41N/C多肽的抗体反应。生物信息学分析显示N51FdFc-BC重组蛋白相对分子质量为34315.1,等电点PI为7.59,且
形成了无规则卷曲结构,易于与抗体反应,可作为抗原。圆二色谱的分析与生物信息学软件预测的结果一致。结论
N51FdFc-BC重组蛋白具有无规则卷曲结构,可适合作为HIV-1亚单位疫苗的免疫原。
     

HIV-1假病毒的研究进展

假病毒是一种病毒的核酸由另一种病毒编码的包膜蛋白所包被,从而形成的具有外源性病毒囊膜,而基因组保持着逆转录病毒本身基因组特征的病毒.假病毒因其丧失了病毒的自我复制能力及其安全系数高等优点,已经被广泛应用于包括人类免疫缺陷病毒(HIV)在内的多项研究中.HIV假病毒通过识别膜蛋白基因的功能有助于研究病毒侵入过程、病毒调节基因功能以及评估中和抗体效价.     

具有广谱中和活性的HIV感染者血浆病毒膜蛋白基因及中和特征分析

目的 分析一例具有广谱中和活性的慢性HIV感染者病毒膜蛋白（Env）基因序列特征及中和特征。方法 使用单拷贝基因组扩增（SGA）方法从患者两个随访时间点血浆样本扩增env基因,测序后进行序列比对和进化树构建,分析env基因特征;将env基因克隆至pcDNA^TM3.1载体上,env质粒和骨架质粒pSG3△env共转染293T细胞制备假病毒,使用假病毒分别和两个时间点的自体血浆及6种不同的广谱中和抗体进行中和试验,分析Env蛋白的中和特征。结果 从两个时间点血浆样本中共获得50个全长env基因,进化分析显示两个时间点序列各自聚集成簇,第1个时间点膜蛋白序列有较短的V1区和较少的V1区糖基化位点数目,第2个时间点膜蛋白序列有更高的基因多样性。自体血浆不能中和同时期的假病毒,但能中和前期的假病毒;两个时间点的假病毒对PGT121、PGT135、2G12和10E8抗体均高度敏感,但对VRC01及12A21抗体呈现中和抗性。结论 该具有广谱中和活性的慢性HIV感染者病毒膜蛋白基因持续进化;感染者体内存在CD4bs类中和抗体的免疫压力。     

HIV-1 B’亚型病毒感染者辅助蛋白Vpr特异性细胞免疫应答

目的探讨HIV-1 B’亚型病毒感染者针对辅助蛋白Vpr的细胞免疫(CTL)反应特征及其与病毒复制控制的关系。方法利用检测IFN-γ分泌的ELISPOT方法,以覆盖HIV-1 B亚型Vpr蛋白全长的重叠肽段作为刺激抗原检测143例未接受抗病毒治疗的HIV-1 B’亚型病毒感染者针对Vpr蛋白的特异性细胞免疫反应,并分析其与病毒载量的关系。结果有16.8%的感染者可以产生针对Vpr蛋白的特异性CTL反应;能识别至少一条Vpr多肽的感染者的病毒载量低于不能识别Vpr多肽的感染者的病毒载量,差别有统计学意义(P=0.0191);对VPR-B-3多肽的识别与低病毒载量紧密相关,该多肽可能包含与Vpr蛋白的生物学功能相关的关键氨基酸位点;Vpr蛋白区多肽在人群中的识别水平的差异与其序列变异程度有关。结论Vpr蛋白特异性的CTL反应与宿主对病毒复制的控制具有一定的相关性,对Vpr蛋白区所包含的CTL表位进行鉴定并探讨其在感染过程中的作用,可为HIV疫苗设计提供参考依据。     

科学家摸清HIV-1中和抗体产生途径

可中和人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的抗体通常以HIC-1包膜可变区1和2（V1V2）为靶点,但它们的启动机制并不清楚。多国学者联合进行的一项研究,从南非艾滋病项目研究中心提供的感染者体内分离出12个体细胞相关中和抗体（CAP256-VRC26.01-12）,每个抗体均包括一个特征性的突出的酪氨酸硫酸化阴离子抗原结合环[互补决定区（CDR）H3],并明确了HIV-1中和抗体产生及发挥中和作用所需分子特征的途径。     

2012—2022年广西HIV-1独特重组型毒株近似全长基因序列特征分析

目的：研究广西HIV-1独特重组型毒株（URFs）的基因重组特点，为广西HIV-1疫情防控提供科学依据。方法：对1例pol区基因序列初步判断为URF的HIV-1感染者的血液样本进行RNA提取、巢式PCR扩增全长基因并测序，从PubMed等数据库检索2012—2022年发表的有关广西URFs近似全长基因组的文章及对应的序列，构建系统进化树，并进行重组模式、断点分析和耐药突变位点分析。结果：测序获得1例长度约8.9 kb的URF，该URF是以CRF08＿BC为骨架插入CRF01＿AE片段构成的二代重组毒株。将该URF与数据库中检索到的12例广西URFs共同分析，发现广西URFs主要来源于性传播途径感染者和静脉吸毒感染者。所有URFs均包含CRF01＿AE片段，以01＿AE/07＿BC重组比例最高（69.2%,9/13）,1例URF含有主要耐药位点。结论：广西已鉴定的URFs数量较少，以01＿AE/07＿BC重组为主，应加强对URFs的监测和鉴定，以全面了解广西HIV-1重组毒株的特点。     

H221Y突变在HIV-1B '亚型毒株中的流行状况及突变模式

目的 探讨人类免疫缺陷病毒( HIV)逆转录酶区H221Y突变在抗病毒治疗失败人群HIV-1B’亚型毒株中的流行状况及突变模式.方法 提取我国中部地区多个省份1205例抗病毒治疗失败及158例未抗病毒治疗的艾滋病患者血浆样本RNA,扩增HIV B’亚型毒株聚合酶区(pol区)基因序列提交斯坦福大学HIV-1耐药数据库,根据数据库比对结果,分析H221Y突变在2组人群中发生频率及发生模式.结果 H221Y突变在抗病毒治疗失败人群中流行率(6.59％)显著高于未治疗人群(0.60％)(x2=6.59,P=0.027).该突变的发生常伴随逆转录酶区位点T215、M184、K103、Y181突变的出现,突变模式以TAMs/H221 Y/Y181C/I为主.5种抗病毒治疗方案中,齐多夫定(AZT)/去羟肌苷(ddI)/奈韦拉平(NVP)治疗方案的H221Y突变发生率显著高于其他4种治疗方案(14.6％比3.5％、4.9％、2.3％、2.6％,均P ＜0.01).结论 使用一线方案治疗失败的艾滋病患者中H221Y突变有一定流行,该突变的发生以特有的突变模式出现.     

HIV-1 CRF07_BC gp41重组抗原在不同体系表达效率的比较

目的获得HIV-1 CRF07_BC株gp41重组抗原表达效率最佳的体系。方法采用基因工程技术将gp41重组蛋白基因分别构建到pThioHis A,pThioHis A-1(不含标签),PBV220,PGEX-6p-1原核表达载体。转化大肠杆菌BL21和Rosetta两种宿主菌,通过IPTG诱导表达并经WB鉴定。结果 4种原核表达质粒构建完成,蛋白成功表达。PGEX-6p-1表达量明显高于pThioHis A载体;而无标签载体组中,PBV220表达量优于pThioHis A-1。BL21和Rosetta宿主菌对表达体系无影响。结论 HIV-1 CRF07_BC株gp41重组抗原在大肠杆菌中以包涵体形式存在,构建在PGEX-6p-1和PBV220载体上gp41重组蛋白表达效率较高,为gp41疫苗的研究和血清学检测提供充足的抗原。     

一株HIV-1 01_AE/07_BC独特重组病毒近全长基因组分析

目的对在深圳发现的一例gag和env基因片段亚型不一致的HIV感染者样本进行近全长基因组扩增和序列分析,以了解其重组特征并分析可能的来源。方法利用近末端稀释法分两段扩增病毒近全长基因组并测定序列,使用Sim Plot 3.5软件分析全长基因组序列中的重组断点,并采用分片段构建进化树的方法确认重组断点。对长度超过300 bp的片段与相应亚型的全部近全长基因组序列构建进化树,分析亲本毒株可能的来源。结果经扩增测序获得1条长度为8 975 bp的HIV-1近全长基因组序列。断点分析结果表明该序列由CRF01_AE和CRF07_BC重组而成,重组断点相应于HXB2的位置分别为1 185、1 817、8 782、9 043和9 216,其中片段Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ来源于CRF01_AE毒株,片段Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ来源于CRF07_BC毒株。亲本毒株来源分析表明,与片段Ⅱ成簇的CRF07_BC序列主要来自北方男男同性传播人群,Bootstrap值为74%,片段Ⅲ与CRF01_AE的簇5病毒成簇,其中多数序列来自北方男男同性传播人群,Bootstrap值为100%。结论本文获得了一株CRF01_AE和CRF07_BC重组形成的独特型重组病毒,其亲本病毒与我国北方男男同性恋人群流行的毒株同源,有可能来源于深圳本地性传播人群中流行的病毒。     

新型HIV-1表型耐药系统临床检测应用研究

目的应用新型HIV-1表型耐药系统对经过HAART治疗的40例临床患者样本进行表型耐药检测,通过比较表型和基因型耐药的结果,实现这一新型HIV-1表型耐药体系在临床检测中的应用。方法通过分子克隆方法、Gateway重组技术、体外细胞功能试验,得到表型耐药结果。结果成功构建含有患者基因的用于假病毒表型耐药的假病毒株40株,在总数达54个表型耐药性检测中,与基因型耐药性检测一致性达75.9%（41/54）。其中蛋白酶抑制剂（克力芝）试验组、核苷类逆转录酶抑制剂（3TC）试验组和非核苷类逆转录酶抑制剂（EFV）试验组的表型耐药性检测,与基因型耐药性检测一致性高达100.0%;而核苷类逆转录酶抑制剂（AZT）试验组共6个表型耐药性检测,与基因型耐药性检测一致性为66.7%（4/6）;2组多药试验共24个表型耐药性检测,与基因型耐药性检测一致性为54.2%（13/24）。其中显示出一个较为明显的特征,AZT药物敏感性试验的表型检测结果大多低于其基因型耐药检测的耐药水平（68.75%,11/16）。结论本研究建立了一个新型表型耐药系统对HIV耐药性进行检测,通过40例临床样本的检测,充分证明新型HIV-1表型耐药检测体系可以准确地反应样本耐药水平并对其进行定量。这一方法弥补了以往假病毒表型耐药检测方法中载体不能重组所有药物靶点的缺陷,证明该新型HIV-1表型耐药体系具有广阔的临床检测应用前景。     

北京市HIV-1 B'/C重组型分子流行特征分析

目的 分析北京市HIV-1 B’/C重组型毒株的分子流行特征.方法 采集北京市2006-2010年新发现B'/C重组型HIV-1感染者的抗凝全血标本,分离血浆和提取病毒RNA,用反转录/巢式聚合酶链式反应扩增病毒gag基因,并进行系统进化分析.结果 成功扩增了159例标本,CRF07_BC 147例,CRF08_BC 12例,CRF07_BC系统进化树中存在3个主要的亚簇,IDU-Max亚簇包含89例样本,静脉吸毒传播占71.9％,同参考株97CN001组间离散率为2.8％;IDU-Min亚簇包含22例样本,静脉吸毒传播占77.3％,组间离散率为2.8％;MSM亚簇包含34例样本,男男同性传播占67.6％,组间离散率为3.1％;3个亚簇内均无其他国家的序列,只有IDU-Max亚簇包含1条来自中国台湾的序列;核苷酸多态性分析结果显示,以IDU-Max亚簇为参照,IDU-Min和MSM亚簇分别有32和41个位点的核苷酸组成存在著性差异.结论 首次观察到北京市流行的CRF07_BC病毒株中存在3个独立的亚簇,异性传播和静脉吸毒传播序列混杂分布,而男同传播病例则聚集成1个亚簇,应当继续对B’/C重组型分子流行特征进行监测.     

CTL responses to regulatory proteins Tat and Rev in HIV-1 B'/C virus-infected individuals

Objective To characterize HIV-1 specific CTL responses to regulatory proteins Tat and Rev in HIV-B＇/C virus-infected ART-naive individuals. Methods HIV-1-specific CTL responses were analyzed by IFN-7 ELISPOT assay using overlapping peptides spanning the consensus sequences of HIV-1 clade C Tat and Rev proteins. Statistical analysis and graphical presentation were performed using SIGMAPLOT 10.0 and SIGMASTAT 3.5. For samples with a positive response, the magnitude of CTL responses was compared between HIV-1 C proteins by Wilcoxon rank sum test, and the significance threshold was P〈0.05. Results Tat and Rev were frequently recognized, with 23% and 52% of the tested individuals having detectable responses to these proteins, respectively. Several immunodominant regions were detected in Rev. No significant correlation was observed between the magnitude and breadth of CTL responses to regulatory proteins and the control of virus replication in this study. Conclusion Tat and Rev can serve as targets for HIV-l-specific CTL, and several immunodominant regions are detectable in Rev. Further characterization of epitopes and their role in virus control may shed light on pathogenesis of HIV- 1 natural infection and also be useful for the design and testing of candidate vaccines.     

基于HIV-1基因序列分析深圳口岸出入境人员与当地人群中CRF01_AE流行株的相关性

目的 分析深圳口岸出入境人员与当地人群中流行的HIV-1 CRF01_AE毒株的基因相关性,为制定相应的防控政策提供指导依据.方法 以深圳口岸出入境人员与当地人群中H1V-1CRF01_AE毒株感染者为研究对象,获得两个人群中的HIV-1基因序列并判定基因型,分别应用传播网络和系统进化分析方法,研究两个人群中HIV-1...     

R5 to X4 coreceptor switch of human immunodeficiency virus type 1 B’ and B’/C recombinant subtype isolates in China

The chemokine receptors CCR5 and CXCR4 play an important role as coreceptors for human immunodeficiency virus type 1 （HIV-1） entring into cells. HIV-1 isolates can be distinguished by the chemokine coreceptors. Nonsyncytium inducing （NSI）, macrophage tropic viruses utilizing CCR5, are called R5 viruses; syncytium inducing （SI） isolates use CXCR4 and known as X4 viruses. R5 viruses generally are associated with latent stage of infection and X4 viruses with later,