主动外排系统与念珠菌的多重耐药

近年真菌感染大幅度增加，随着三唑类抗真菌药大剂量、长疗程使用，多重耐药株感染导致的治疗失败也呈增加趋势，对耐药念珠菌的研究发现，多重耐药与真菌细菌膜上主动外排泵的活化密切相关；与多重耐药相关的主动外排系统有ATP结合盒超家族（cdr 1和cdr 2)和主要易化因子超家族（CaMDR和flul),临床分离的敏感株和耐药株应用Southern blot及限制性核酸内切酶片段长度多态性分析表明，两者在基因型上无明显的差异，而Northern blot发现，两者在主动外排泵基因的mRNA上差异明显，表明耐药的发生是源于基因表达的异常而不是基因扩增所致，而启动子区上游500bp的碱基序列分析，未发现能增加基因表达的突变，进一步的研究发现，基因表达的增加源于反式调节因子对启动子的激活。     

白念珠菌氟康唑耐药的分子生物学进展

随着白念珠菌临床感染的不断增加，以及以氟康畦为主的畦类抗真菌药物的广泛应用，畦类耐药现象亦随之增多，并成为困扰临床念珠菌感染治疗的难题之一。出现耐药可能的原因包括：①编码药物靶酶羊毛甾醇14α去甲基酶的ERG11基因的过度表达和点突变导致真菌细胞膜上的麦角固醇的生物合成发生异常；②药物外流泵相关的基因有ATP结合盒转运子基因—CDR1、CDR2和主要易化子超家族基因的过度表达导致药物在真菌细胞内有效浓度的减少，氟康畦耐药的发生可能同时出现不同的机制。     

国产某真菌药敏试剂盒误鉴定热带念珠菌药敏结果原因探究

目的探讨国产某真菌药敏试剂盒测定热带念珠菌药物敏感性试验结果错误的原因。方法收集30株国产真菌药敏试剂检测结果为对唑类药物耐药的热带念珠菌。另外再收集30株唑类药物敏感的热带念珠菌为对照菌株,用法国生物梅里埃ATB真菌药敏试剂盒复核国产试剂盒的鉴定结果,并自行配制系列药敏稀释液替代国产试剂中原有药敏稀释液,对上述热带念珠菌进行药物敏感性测试。结果国产试剂盒和自行配制试剂的检测结果分别与法国生物梅里埃ATB真菌药敏试剂盒检测结果比较,国产试剂(100%)与ATB(0%)检测的唑类药物敏感的热带念珠菌耐药率有统计学意义,x2=28.03,P<0.01;自配试剂(10%)与ATB(0%)检测的唑类药物敏感的热带念珠菌耐药率无统计学意义,x2=1.33,P>0.05。结论该国产真菌药敏测定试剂盒对部分热带念珠菌对氟康唑药物敏感性检测结果不准确,通过改进药敏稀释液配方,其准确性得到保证。     

没食子酸联合氟康唑抗耐药非白念珠菌作用的体外试验

目的：研究没食子酸与氟康唑联用对耐药光滑念珠菌和克柔念珠菌的体外抗真菌活性。方法：采用棋盘微量稀释法测定没食子酸与氟康唑单用及联用对耐药光滑念珠菌和克柔念珠菌的抗真菌作用,以部分抑菌浓度指数（FICI）评价其联用效果;并以CG2、CK8为目标菌株,采用时间-杀菌曲线进行验证;通过测定没食子酸对耐药株生物膜形成早期黏附性的影响,初步探讨药物联合抗真菌耐药的作用。结果：联用时8~16 μg·mL^-1没食子酸能将氟康唑的MIC值降为单用时的1/4~1/8,FICI值为0.375,呈现较好的协同作用,且量效关系呈正相关。时间-杀菌曲线表明,与氟康唑单用相比,没食子酸与氟康唑联用24 h时,CG2、CK8菌株CFU的lg值分别下降了2.1个单位和2.25个单位,均表现为协同作用。另外,研究发现没食子酸对生物膜形成的早期黏附有明显的抑制作用。结论：没食子酸与氟康唑联用对耐药光滑念珠菌和克柔念珠菌的浮游菌表现出体外协同抗真菌作用,且没食子酸能够明显抑制非白色念珠菌生物膜形成的早期黏附。     

来氟米特对氟康唑体外抗耐药白色念珠菌增效作用研究

目的：研究来氟米特与氟康唑在体外合用对耐药白色念珠菌的抗真菌效果。方法：采用棋盘式微量稀释法测定来氟米特联合氟康唑对15株临床耐药白色念珠菌的最小抑菌浓度MIC₈₀。时间-杀菌曲线验证两药联用对耐药白色念珠菌生长的抑制作用。结果：来氟米特单药对实验所用白色念珠菌均无抗菌活性（MIC₈₀>320μg·mL^-1）。来氟米特联合氟康唑可产生协同抗菌作用,协同指数（FICI）<0.25。用药24h后,时间-杀菌曲线上联合用药组比单用氟康唑组平均降低了3.9log₁₀CFU/mL,证实两药具有协同抑菌作用。结论：来氟米特与氟康唑在体外对耐药白色念珠菌具有良好的协同抗真菌活性。     

E-test和纸片扩散法检测氟康唑和两性霉素B体外抗念珠菌活性

目的 比较E—test和纸片扩散法检测氟康唑和两性霉素B对念珠菌的体外抗菌活性。方法 用E—test和纸片扩散法检测123株念珠菌对氟康唑和两性霉素B的敏感性。结果 E—test法和纸片扩散法检测71株白色念珠菌和30株热带念珠菌对氟康唑／两性霉素B敏感性，2种方法的一致性分别为94．4％（67／71）／100％（71／71）和100％（30／30）／86．7％（26／30）。结论 2种方法均可检测氟康唑和两性霉素B对白色念珠菌和热带念珠菌的体外抗菌活性。     

白色念珠菌对氟康唑耐药性的诱导和回复研究

目的　研究体外能否以氟康唑诱导白色念珠菌产生耐药性 ,以及诱导耐药株的稳定性。方法　将临床分离的白色念珠菌敏感菌株增菌后分别加入含氟康唑 4、8、16 μg/ ml的 YPD液体培养基中传代 ,测定诱导后各代菌株的 MIC,以观察达到耐药水平所需的天数。以 16 μg/ ml氟康唑诱导形成的耐药株 ,在不含氟康唑的 YPD液体培养基中连续传代 ,测定各代的 MIC,观察其回复敏感性所需的天数。结果　三种不同浓度的氟康唑体外诱导敏感菌株后 ,分别经 30、36、5 2 d呈现耐药 ,耐药株在不含氟康唑的培养基上连续传代后MIC逐渐下降 ,至第 9代恢复对氟康唑的敏感性。结论　敏感白色念珠菌体外经氟康唑诱导后可呈现耐药 ,且同时对三唑类其他品种也耐药 ;但该耐药性不稳定 ,在无氟康唑的环境中会逐渐回复敏感性。     

KB细胞耐药株的建立及其耐药机制的探讨

用对长春新碱(VCR)敏感的KB细胞为亲本,通过诱变剂甲基磺酸乙酯刺激,然后在培养液中加入浓度递增的CVR,得到耐药细胞株KB_V200。此细胞株对VCR的耐受程度约为KB细胞的175倍。对其它抗肿瘤药物如紫杉醇、秋水仙碱和阿霉素等也有不同程度的交叉耐药性。进一步研究表明,KB_V200对³H-VCR的蓄积明显减少,且耐药基因(mdr1)表达增加。钙通道阻滞剂维拉帕米(Ver)可增加KB_V200对³H-VCR的蓄积和对VCR的敏感性。这些结果提示,KB_V200耐药的机制可能是由于mdr1基因表达增加,产生过量的p-糖蛋白,使药物外排增多所致。     

念珠菌对唑类药物耐药机制研究进展

深部念珠菌感染发病率逐年上升及念珠菌耐药现象日益增多引起人们对念珠菌耐药机制的关注。在基因分子水平上，至今已发现念珠菌对唑类药物耐药存在二种机制：药物外排泵基因的过度表达、药物靶酶基因的突变或过度表达。念珠菌对唑类药物高度耐药通常是多种耐药机制共同作用的结果。     

白念珠菌ERG11基因突变与氟康唑耐药性的关系

探讨白念珠菌氟康唑作用的靶酶编码基因 (ERG11)突变与耐药性的关系。分离抽提分别对氟康唑敏感和耐药的白念珠菌基因组 DNA,根据 ERG11编码序列设计一对上下游引物 ,对靶酶活性中心血色素结合区和疏水端螺旋区的基因表达序列进行 PCR扩增 ,经 DNA测序比较敏感和耐药菌株的碱基差异。结果 :6株氟康唑耐药白念珠菌此段序列有 5个位点发生突变 ,其中 5株第 1344 bp位点 G→A的突变致所编码的第 44 8个氨基酸由甘氨酸 (G)变为谷氨酸 (E)。结论 :ERG11基因突变致所编码的氨基酸改变与氟康唑耐药有关。     

耐两性霉素B的近平滑与热带假丝酵母菌的体外诱导及耐药分子机制研究

目的：体外诱导近平滑假丝酵母菌（ CP）、热带假丝酵母菌（ CT）对两性霉素B（ AMB）的耐药株,检测其中的耐药基因表达情况。方法 AMB体外构建耐药株,用实时荧光定量PCR法检测耐药基因的表达水平。结果 CP、CT 野生株经体外 AMB 浓度递增法诱导后,形成耐药株最低抑菌浓度（ MIC,≥8μg? mL－1）;CYP51A、CYP51B、CDR1、CDR2、MDR1及MDR2基因在野生株中低水平表达,在耐药株中表达水平明显升高,差别有统计学意义（ P ＜0．05）;CYP51A、CYP51B、CDR1、CDR2、MDR1及MDR2的表达量在CPAMB耐药株中分别是其野生株的136．92,16．33,2．07,14．84,4．07,2．38倍;在CT AMB耐药株中分别是其野生株的8．83,2．98,3．00,2．40,2．30,3．57倍。结论 CP、CT对AMB耐药与CYP51A、CYP51B、CDR1、CDR2、MDR1及MDR2基因过度表达有关。     

High incidence of antifungal drug resistance in Candida tropicalis

Drug resistance among yeasts is an increasing problem. Isolates of Candida krusei and Candida glabrata are recognized as having reduced susceptibility to fluconazole and resistance to this drug has also arisen in Candida albicans isolated from AIDS patients on long term azole therapy. Candida tropicalis (CT) is being increasingly isolated from human disease and is associated with invasive infection, however, data regarding this organism's drug susceptibility is limited. We report our findings on 60 isolates of CT isolated from patients with serious infection in the North West of England. Over 60% of isolates were from adult Intensive Care Unit (ICU) patients, and almost half were from the respiratory tract. Susceptibility to fluconazole, flucytosine, itraconazole and ketoconazole were tested by standardised methods - 48% of the isolates were resistant to fluconazole (MIC > 12.5 mg/l), and 10% had intermediate susceptibility (MIC 6.25–12.5 mg/l). For flucytosine 17% of isolates were resistant (MIC > 8 mg/l) and 22% had intermediate susceptibility (MIC 2–8 mg/l). Three isolates were resistant to both drugs. For itraconazole 17% of isolates were resistant (MIC > 1 mg/l), and 12% showed intermediate susceptibility (MIC 0.5–1 mg/l). Resistance to ketoconazole was seen in 33% of isolates (MIC > 1 mg/l) and 10% showed intermediate susceptibility (MIC 0.5–1 mg/l). Differences in the degree of cross resistance between the azole drugs was observed. Candida tropicalis should be added to the list of yeasts in which drug resistance is commonly found. Given the high invasiveness of Candida tropicalis, its affinity for patients on ICU and the high incidence of drug resistance in this species, identification and susceptibility tests should be performed on all yeast isolates from patients on ICU.     

体外诱导白念珠菌对氟康唑耐药性的研究

目的:建立白念珠菌耐氟康唑模型,研究白念珠菌耐药前后相关生物学特性变化。方法:体外用氟康唑诱导敏感白念珠菌SC5314和y01.09成为耐药子代SC5314R和y01.09R,利用微量液基稀释法和小鼠体内实验确定耐药表型,通过生长动力学、菌丝和生物膜形成实验观察生物学特性变化。结果:氟康唑对耐药子代SC5314R和y01.09R的MIC80分别为>128μg/mL,64μg/mL。无药培养35代后,MIC80分别为>128μg/mL,16μg/mL。有/无氟康唑环境下,敏感母本和耐药子代倍增时间无显著差异。氟康唑作用下,SC5314和y01.09菌丝形成受到抑制,SC5314R和y01.09R仍有菌丝形成;SC5314R和y01.09R可以形成牢固生物膜,SC5314和y01.09形成松散生物膜。结论:本实验成功诱导对氟康唑产生高度耐药的白念珠菌菌株,其耐药性通过体内外实验获得证实。     

药物耐药性外排泵抑制剂的研究进展

外排泵抑制剂可以抑制耐药细菌和肿瘤细胞对进入胞体内药物的外排作用,提高对药物的敏感性.它在改善药物的药动学特性等方面也有广泛的作用.研制开发外排泵抑制剂,逆转现有药物的耐药性将是改善药物疗效的一种有效的治疗方法.简要阐述近年来外排泵抑制剂的研究进展.     

白色念珠菌耐药性产生的分子机制

耐氟康唑的白色念珠菌已成为临床长期用药治疗的一个突出性问题,目前认为白色念珠菌耐药性产生的分子机制,主要包括麦角甾醇生物合成通路中关键靶酶的变异和高表达、多药耐药蛋白对真菌胞内药物浓度的影响以及生物被膜的形成等.     

Reduction of Candida tropicalis biofilm by photoactivation of a Heterophyllaea pustulata extract

Context: Biofilm formation is an important problem, since this growth mode confers resistance to drugs usually used in therapeutics.

Objective: In vitro antifungal activity of extracts obtained from Heterophyllaea pustulata Hook f. (Rubiaceae) were studied against Candida tropicalis biofilms, evaluating the effect of irradiation and the oxidative and nitrosative stresses as possible mechanisms of action.

Materials and methods: Hexane, benzene, ethyl acetate and ethanol extracts were evaluated at three concentrations (0.2, 0.1 and 0.05?mg/mL) over mature biofilm, under darkness and irradiation. After 48?h of incubation, biofilm quantitation was performed by the O'Toole and Kolter method. Reactive oxygen species (ROS) was measured by nitro-blue tetrazolium (NBT) reaction and reactive nitrogen intermediates (RNI) by the Griess reagent. Superoxide dismutase activation (SOD, NBT assay) and total antioxidant system (FRAP test) were studied.

Results: Only the benzene extract at 0.2?mg/mL reduced the biofilms formation. The slight decrease achieved in darkness (17.06?±?2.80% reduction) was increased by light action (39.31?±?3.50% reduction), clearly observing a photostimulation. This great reduction was confirmed by confocal microscopy. In darkness, biofilm reduction was mediated by an increase in RNI, whereas under irradiation, the ROS action was most important. Although no SOD activation was observed, a strong stimulation of the total antioxidant system was detected. HPLC analysis established a high content of several anthraquinones in this extract.

Discussion and conclusion: Biofilm reduction by benzene extract was mainly mediated by oxidative stress triggered under light action, confirming a photodynamic sensitization, which could be attributed to its high content of photosensitizing anthraquinones.     

细菌外排泵与抗生素耐药的相关性

抗生素耐药与临床用药紧密相关,一直以来都受到广泛关注。除了药物失活、靶点改变这些已经熟知的耐药机制以外,细菌外排泵的作用也是抗生素耐药的重要原因。外排泵在细菌中普遍存在并且底物十分广泛,其表达对多种细菌的先天耐药和后天耐药都有贡献。对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等细菌,外排泵导致的耐药是其耐药的主要原因,因此在临床用药过程中,外排泵产生的耐药成了不可忽略的因素。这也给新药研发提供了新的思路,已经有研究以外排泵为靶点开发新药,而开发能够规避外排泵作用的新型抗生素也是克服外排泵耐药的一个途径。本文从分类,结构,调控以及抑制剂等方面对近年来细菌外排转运体方面的研究进行综述,为进一步的探索提供参考。     

假丝酵母菌属的耐药性分析

目的 了解我院深部真菌感染的种类和耐药特点,为合理使用抗真菌药物提供病原学依据.方法 对2009-2010年分离的假丝酵母菌属进行菌种分布和耐药性分析.结果 495株假丝酵母菌属占总分离病原菌(3027株)的比例为16.4％,其中白色假丝酵母菌397株,占80.2％;从呼吸道标本中分离出443株,占89.5％;白色假丝酵母菌对两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑的耐药率分别为0.3％ (1/397)、1.5％(6/397)、2.8％ (11/397)、4.8％( 19/397)、10.6％(42/397).结论 白色假丝酵母菌是真菌感染的主要病原菌,早期诊断和合理使用抗真菌药物是防治真菌感染的关键.     

呼吸系统念珠菌感染的菌种分布及耐药性分析

目的了解中山大学附属第三医院呼吸系统念珠菌感染的菌种分布及药敏情况,为控制呼吸系统念珠菌感染提供依据。方法对2006～2008年间,从我院呼吸系统感染性疾病患者中分离到的念珠菌,采用API-20Aux和ATBFUNGUS进行鉴定和药敏实验,所得结果进行统计分析。结果 131株念珠菌中,检出率最高的前三种是白色念珠菌（55.0%）、光滑念珠菌（20.6%）和热带念珠菌（8.4%）等,各种念珠菌对两性霉菌素B和伊曲康唑敏感率最高,达97.7%和95.1%,咪康唑敏感率最低,只有65.8%。结论呼吸系统念珠菌感染是以白色念珠菌感染为主,各种念珠菌对两性霉菌B和伊曲康唑敏感率高但中介株或耐药株有逐年上升趋势,对其他抗真菌药有不同程度的下降,应引起临床和实验室高度重视。     

临床表葡菌耐药性和氟喹诺酮类药物外排检测研究

分离鉴定临床表葡菌126株,通过Kirby-Bauer法和平皿二倍稀释法测定了126株临床分离表皮葡萄球菌对13种抗菌药物(甲氧西林、卡那霉素、庆大霉素、氨苄西林、四环素、红霉素、克林霉素、磺胺甲口恶唑/甲氧苄啶、利福平、头孢曲松、头孢噻肟、头孢唑林、万古霉素)的耐药水平及78株表葡菌对13种抗菌药物的耐药谱。126株表葡菌中甲氧西林耐药菌(MRSE)为79株,占62.7%。万古霉素对MRSE和MSSE的作用最好,抑菌率均为100%,利福平对MRSE的抑菌作用也较强,抑菌率为83.5%,其次是卡那霉素、四环素和磺胺甲口恶唑/甲氧苄啶。采用平皿二倍稀释法测定78株表葡菌(从126株菌随意挑选)对4种氟喹诺酮类药物(诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星和司帕沙星)的耐药水平及交叉耐药性。78株表葡菌中,对环丙沙星耐药25株(32.05%);对诺氟沙星耐药34株(43.59%);对氧氟沙星耐药22株(28.21%);对司帕沙星耐药16株(20.51%)。且菌株对此4种药物存在高度交叉耐药性;16株表葡菌在加入利舍平后MIC变小,说明外排泵介导的氟喹诺酮耐药机制普遍存在于临床分离的表葡菌中。但菌株SE7、SE9、SE68的MIC在加入利舍平后增大。说明这些菌株中除主动外排耐药机制外,还存在着其它耐药机制。