DADS对Chk1/2基因高表达人胃癌MGC803细胞G_2/M期的影响

目的在建立Chk1/2基因高表达人胃癌MGC803细胞基础上,探讨DADS对Chk1/2高表达MGC803细胞G_2/M期的作用。方法分别采用集落形成实验、流式细胞术、RTPCR、Western blot等方法,检测DADS对Chk1/2高表达MGC803细胞增殖、细胞周期分布、Chk1与Chk2 mRNA与蛋白、p-Chk1与p-Chk2及CDC25C与cyclinB1的表达。结果软琼脂集落形成实验显示,30 mg·L~(-1)DADS作用Chk1与Chk2高表达MGC803细胞组集落形成率均明显低于对照组与空载体组(P<0.05)。流式细胞术显示,30 mg·L~(-1)DADS作用12、24、36、48 h后,Chk1/MGC803细胞G_2/M期分别为41.3%、57.4%、68.9%、42.9%,较MGC803细胞与Chk2/MGC803细胞明显增加(P<0.05)。而Chk2/MGC803细胞与MGC803细胞差异没有显著性(P>0.05)。RT-PCR显示,Chk1/MGC803与Chk2/MGC803细胞Chk1与Chk2mRNA水平较对照组无明显变化;并且,Western blot显示,Chk1与Chk2总蛋白及p-Chk2的表达无明显改变,但pChk1呈时间依赖性上调,CDC25C与cyclinB1呈时间依赖性下调(P<0.05)。结论 DADS可阻滞Chk1/MGC803细胞于G_2/M期,与上调磷酸化Chk1和下调CDC25C与cyclinB1有关。     

DADS诱导人胃癌细胞周期阻滞相关基因的差异表达

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人胃癌MGC803细胞G2/M周期阻滞相关基因表达的变化。方法MTT法、流式细胞术分别分析DADS对MGC803细胞的抑制作用与细胞周期分布的影响;功能基因芯片检测周期相关差异表达基因;Western blot、RT-PCR验证周期相关基因的表达。结果MTT法、流式细胞术证明DADS可明显抑制MGC803细胞增殖并诱导G2/M期阻滞。基因芯片结果显示,30 mg.L-1DADS作用MGC803细胞4 h后,表达上调的基因有CDC45L、CDK5R1、p21、CUL4A、GADD45α、RAD17、TP53,下调的基因是ANAPC5、ATR、BRCA1、CCNA2、CCNB2、CCNE1、CCNE2、CDC16、CDC6、CDK5RAP1、GTF2H1、MCM5、RAD9A、RGC32。RT-PCR显示30 mg.L-1DADS处理MGC803细胞4、8、12 h后,p21、GADD45α时间依赖性的表达增强(P<0.05),CyclinB1呈时间依赖性的表达降低(P<0.05)。TP53在4、8、12 h后与对照组比较表达明显增强(P<0.05)。Western blot结果表明,30 mg.L-1DADS作用MGC803细胞6、12、24 h后,p53、GADD45α、p21蛋白表达上调,CyclinB1蛋白表达下调(P<0.01)。结论DADS诱导人胃癌MGC803细胞G2/M周期阻滞是由多基因协同作用的结果,可能通过两种途径共同调节完成的。     

DADS通过Chk1/Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路诱导白血病HL-60细胞G_2/M期阻滞

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病HL-60细胞周期阻滞及其分子机制。方法采用细胞计数、软琼脂克隆形成实验及流式细胞术观察DADS对HL-60细胞生长抑制与周期阻滞效应。Western blot检测DADS对HL-60细胞Chk1/2以及下游分子的影响。结果细胞计数显示,60、120μmol·L-1DADS处理后,其群体倍增时间从19.14 h增加到35.03、71.82 h(P<0.05)。软琼脂克隆形成实验表明,30、60、90、120μmol·L-1DADS对HL-60细胞克隆形成率的抑制率分别为35.06%、62.10%、93.79%、99.35%(P<0.05)。流式细胞术检测显示,60和120μmol·L-1DADS分别作用HL-60细胞24 h后,DADS可呈时间与浓度依赖性诱导HL-60细胞G2/M期阻滞(P<0.05)。60μmol·L-1DADS处理HL-60细胞后,p-Chk1可呈时间依赖性上调(P<0.05),而Chk1与Chk2总蛋白和pChk2无改变(P>0.05)。并且,Cdc25C、CyclinB 1和CDK1分别呈时间依赖性下调(P<0.05),但14-3-3蛋白表达没有改变(P>0.05)。结论 DADS能够抑制HL-60细胞增殖,并通过Chk1/Cdc25C/CyclinB 1/CDK1通路阻滞HL-60细胞于G2/M期。     

二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞Rac1-Pak1/Rock1通路的影响

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞Rac1-Pak1/Rock1通路分子的影响。方法 30 mg·L-1DADS分别处理MGC803细胞不同时间后,采用RT-PCR、Western blot分别检测Rac1、Pak1、Rock1、cofilin1和destrin的mRNA和蛋白水平。结果 DADS可下调MGC803细胞Rac1、Pak1和Rock1 mRNA和蛋白水平(P<0.05),对cofilin1和destrin的表达无影响,但可抑制cofilin1磷酸化(P<0.01)。结论 DADS可下调Rac1、Pak1和Rock1表达和磷酸化cofilin1;DADS抑制Rac1-Pak1/Rock1通路可能与DADS抗人胃癌MGC803细胞迁移侵袭作用机制有关。     

二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞G_2/M期的阻滞作用

目的　探讨二烯丙基二硫 (DADS)对人胃癌MGC80 3细胞G2 /M期的阻滞作用及分子机制。方法　体外培养MGC80 3细胞 ,采用MTT比色实验、细胞计数法 ,流式细胞光度术和Westernblot分析DADS对MGC80 3细胞的抑制增殖作用 ,细胞周期分布的影响及细胞周期相关蛋白的表达。结果　MTT法显示 ,2 0mg·L-1DADS、30mg·L-1DADS作用MGC80 3细胞 72h后 ,生长抑制率分别达2 5 7%、5 8 6 %。细胞计数法表明常规培养MGC80 3细胞群体倍增时间为 2 9 92h ,30mg·L-1DADS作用MGC80 3细胞后 ,其细胞群体倍增时间延长到 5 5 5 8h。流式细胞仪分析结果显示DADS呈浓度依赖性将MGC80 3细胞阻滞在G2 /M期。 30mg·L-1DADS作用MGC80 3细胞 36h ,与对照组相比 ,可使G2 /M期细胞增加到 4倍多。Westernblot分析表明在G2 /M期阻滞同时有Cdc2 5C蛋白表达下降 ,但CDK1蛋白表达不受DADS作用的影响。结论　DADS对MGC80 3细胞的抑制增殖作用与G2 /M期阻滞有关 ,DADS对MGC80 3细胞G2 /M期阻滞的分子机制可能与降低Cdc2 5C蛋白水平有关     

二烯丙基二硫下调LIMK1抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞迁移侵袭及LIMK1表达的影响。方法MTT、划痕愈合和侵袭实验分别检测DADS对MGC803细胞增殖、迁移与侵袭能力的作用;RT-PCR、Western blot与免疫细胞化学检测LIMK1表达。结果 MTT显示,30 mg.L-1DADS作用MGC803细胞24、48、72、96 h后,增殖抑制率分别为31.8%、66.1%、83.6%、89.2%,呈明显的时间依赖关系(P<0.05)。划痕实验显示,10、20、30、40、50 mg.L-1DADS分别作用MGC803细胞,划痕愈合明显慢于对照组,呈剂量依赖关系(P<0.05)。侵袭实验显示,10、20、30、40、50 mg.L-1DADS作用MGC803细胞24 h后,穿过基质胶的细胞数分别为(35.8±3.74)、(34.1±2.02)、(31.7±4.81)、(17.2±3.08)、(13.2±3.36)个,较对照组(39.5±2.99)个数明显减少,呈剂量依赖性(P<0.05)。RT-PCR显示,30 mg.L-1DADS与MGC803细胞作用48 h后,LIMIK1mRNA明显下调(P<0.05)。Western blot与免疫细胞化学检测显示,30 mg.L-1DADS作用MGC803细胞6、12、24、48h后,LIMK1蛋白的表达水平呈时间依赖性下降(P<0.05)。结论 DADS可抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭能力,其机制可能与下调LIMK1有关。     

二烯丙基二硫上调miR-22通过Wnt-1通路抑制人胃癌细胞增殖与迁移侵袭

目的探讨二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)上调miR-22是否通过Wnt-1通路抑制人胃癌MGC803细胞增殖与迁移侵袭。方法 MTT、细胞划痕实验、侵袭实验分别检测DADS与miR-22对MGC803细胞增殖与迁移侵袭的影响。在线预测软件寻找miR-22调控的靶基因,荧光素酶报告基因检测miR-22对Wnt-1 3'UTR荧光酶活性的影响。qRT-PCR检测Wnt-1mRNA表达变化。Western blot检测Wnt-1、β-catenin与TCF-4蛋白表达。结果MTT显示,DADS与miR-22可明显抑制MGC803细胞增殖(P<0.05)。划痕实验显示,DADS与miR-22可明显抑制MGC803细胞迁移,而miR-22+DADS更为明显(P<0.05)。侵袭实验显示,miR-22可抑制人胃癌MGC803细胞侵袭,而miR-22+DADS更为明显(P<0.05)。在线预测软件寻找miR-22调控的靶基因显示,Wnt-1可能是miR-22的靶基因,荧光素报告基因检测证实Wnt-1是miR-22直接调控的靶基因;qRT-PCR显示,DADS与miR-22能下调Wnt-1 mRNA表达,而miR-22+DADS更为明显(P<0.05)。Western blot显示,DADS与miR-22能下调Wnt-1、β-catenin与TCF-4蛋白表达,而miR-22+DADS尤为明显(P<0.05)。结论 DADS可上调miR-22通过Wnt-1通路明显抑制MGC803细胞增殖与迁移侵袭。     

二烯丙基二硫对小鼠肾包膜下移植人胃癌细胞的生长抑制作用

二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)是大蒜的主要有效成分,对多种肿瘤均有明显的抑制作用[1].本室体外研究表明:DADS可明显抑制人胃癌MGC803细胞生长[2],其机制与G2/M期阻滞和信号传导通路ERK/AP-1途径有关[3,4].本研究采用人肿瘤细胞肾包膜下移植模型,探讨DADS对体内生长的MGC803细胞的抑制作用.     

二烯丙基二硫诱导人胃癌MGC803细胞凋亡及细胞周期阻滞的研究

目的　研究二烯丙基二硫 (diallyldisulfide ,DADS)诱导人胃癌MGC80 3细胞凋亡和对细胞周期的影响。方法　采用MTT法、丫啶橙染色、流式细胞仪等方法检测DADS对MGC80 3的增殖抑制 ,诱导凋亡以及细胞周期分布的影响。结果　MTT法显示 ,DADS对MGC80 3细胞有明显的抑制增殖作用 ,2 0、3 0、40mg·L- 1DADS作用MGC80 3细胞72h后 ,生长抑制率分别达 2 5 7%、58 6%、69% ;经 3 0mg·L- 1DADS作用MGC80 3细胞 48h后 ,用丫啶橙染色法观察到不同阶段的凋亡细胞形态学改变 ;流式细胞仪分析结果显示 ,DADS对MGC80 3细胞有明显的G2 /M期阻滞作用 ,3 0mg·L- 1DADS作用MGC80 3细胞 2 4h ,与对照组相比 ,可使G2 /M期细胞增加到 4倍多 ,且DADS呈时间依赖性诱导MGC80 3细胞凋亡 ,3 0mg·L- 1DADS作用MGC80 3细胞48h ,凋亡率从对照组的 3 5%升高到 3 9 5%。结论　DADS引起MGC80 3细胞G2 /M期阻滞并诱导凋亡可能是其抗肿瘤的机制之一     

二烯丙基二硫诱导人胃癌MGC803细胞的差异microRNA表达

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人胃癌MGC803细胞的差异miRNAs表达。方法采用miRNAs芯片与qRT-PCR检测DADS诱导人胃癌MGC803细胞的差异miRNAs表达。结果 microRNA芯片检测显示,30 mg·L~(-1)DADS处理24 h后,MGC803细胞的差异miRNAs表达中,miR-200b、miR-22、miR-7、miR-143、miR-138、miR-34a、miR-150等7个miRNA表达明显上调,miR-222、miR-21、miR-15b、miR-182、miR-18a等5个miRNA下调。q PCR证实,30 mg·L~(-1)DADS处理MGC803细胞后,miR-200b、miR-22、miR-7、miR-143、miR-138、miR-34a、miR-150等表达较未处理组明显上调(P <0. 05)。且q PCR检测显示,miR-200b与miR-22在MGC-803、BGC-823、MKN-28、SGC-7901、HGC-27等各种人胃癌细胞表达较正常人胃癌GES-1细胞明显下调(P <0. 05)。miR-200b与miR-22在胃癌组织中表达较正常胃组织明显下调(P <0. 05)。结论DADS诱导人胃癌MGC803细胞的差异miRNAs表达有7个miRNA明显上调,5个miRNA下调。miR-200b与miR-22在胃癌组织与细胞中表达下调。DADS可上调MGC803细胞miR-200b与miR-22表达。     

二烯丙基二硫抑制SW480细胞系生长增殖的相关蛋白质分子鉴定

目的应用前期比较蛋白质组学筛出的部分差异表达蛋白质分子,进行进一步分析与鉴定。方法采用MTT法,观察不同浓度和作用时间DADS对SW480细胞的生长抑制作用;使用流式细胞仪,分析50 mg.L-1DADS对SW480细胞的周期分布的影响;运用Western blot方法,分析50 mg.L-1DADS处理SW480细胞系后泛肽和FKBP的表达水平。结果MTT法显示,DADS能明显抑制SW480细胞系生长增殖,呈浓度和时间依赖性,SW480细胞系经不同浓度DADS处理后,生长增殖速度明显减慢。流式细胞仪分析结果显示,50 mg.L-1DADS将SW480细胞阻滞在G2/M期。应用Western blot分析结果显示,50 mg.L-1DADS处理SW480细胞48 h,泛肽表达较对照组增强,而FKBP的表达明显降低,差异均为2倍以上。结论DADS抑制SW480细胞系生长增殖,可能与泛肽表达上调,FKBP表达下调,将细胞阻滞在G2/M期有关。     

DADS体内诱导人胃癌细胞分化作用中组蛋白乙酰化的变化

目的观察二烯丙基二硫(DADS)在体内诱导胃癌细胞分化的作用及对人胃癌细胞移植瘤组蛋白乙酰化的影响。方法裸鼠皮下注入人胃癌细胞MGC803建立人胃癌异种移植模型,采用光学显微镜观察移植瘤细胞形态变化,流式细胞光度术和W estern b lot分析DADS对MGC803细胞移植瘤细胞周期分布的影响及瘤组织中p21WAF1蛋白、组蛋白H3、H4乙酰化的表达情况。结果腹腔注射DADS剂量为100、200 mg.kg-1时对移植瘤有明显生长抑制作用;光学显微镜显示经DADS处理后瘤细胞密度及异型性明显减小。流式细胞仪分析结果显示DADS呈浓度依赖性将移植瘤细胞阻滞在G2/M期。DADS浓度为100 mg.kg-1和200 mg.kg-1作用瘤细胞后,与对照组相比分别可使G2/M期细胞增加2.22和3.37倍。W estern b lot分析表明在G2/M期阻滞同时有组蛋白H3乙酰化表达增加,但组蛋白H4乙酰化表达水平不受DADS作用的影响;瘤组织中的p21WAF1蛋白表达量也随DADS浓度升高而上升。结论DADS对胃癌细胞裸鼠移植瘤的生长有明显抑制和诱导分化作用,这种抑制可能与其阻滞移植瘤细胞周期、上调瘤细胞组蛋白乙酰化及p21WAF1蛋白水平有关。     

二烯丙基三硫诱导人胃癌细胞凋亡相关基因的差异表达

目的探讨二烯丙基三硫(diallyl trisulfide,DATS)诱导人胃癌MGC803细胞凋亡的分子机制。方法MTT法检测DATS对MGC803细胞的生长抑制作用,荧光显微镜和流式细胞仪观察DATS作用后的细胞凋亡。人细胞凋亡基因芯片检测DATS作用MGC803细胞的凋亡相关基因表达谱,RT-PCR验证凋亡相关基因。结果MTT结果显示,4、8、12、16、24mg.L-1DATS对MGC803细胞生长的抑制率从11%增至78%,呈明显量效关系(P<0.05)。荧光显微镜下,DATS处理后的MGC803细胞核染色质着橘红色并呈固缩状或片段状。流式细胞仪检测显示,8、12、16、24mg.L-1DATS作用24h后,出现典型亚二倍体峰,平均凋亡率分别为11.4%、23.7%、27.4%、31.1%(P<0.05)。人细胞凋亡基因芯片检测结果表明,16mg.L-1的DATS作用4h后出现16个凋亡相关基因表达差异,RT-PCR证实,SODD基因mRNA表达上调、Apaf-1基因mRNA表达下调(P<0.05)。结论DATS诱导人胃癌MGC803细胞凋亡可能与多个基因和信号转导通路作用有关。     

二烯丙基二硫下调cyclin D1和CDK4的表达诱导人鼻咽癌CNE2细胞G_1期阻滞

目的研究二烯丙基二硫(DADS)对人鼻咽癌CNE2细胞的影响及其分子机制。方法采用MTT法检测DADS对CNE2细胞增殖抑制作用;流式细胞术分析DADS对CNE2细胞周期分布的影响;运用RT-PCR和Western blot方法分析DADS作用CNE2细胞后,cyclin D1和CDK4的表达变化。结果 MTT结果显示,不同浓度DADS(90、140、240、400μmol·L-1)处理CNE2细胞48h后,生长抑制率分别为4.0%、13.8%、25.8%、51.2%;流式细胞术分析显示,DADS阻滞CNE2细胞于G1期,并呈浓度依赖性;RT-PCR和Western blot结果表明,细胞周期调控基因cyclinD1、CDK4表达下调。结论 DADS对CNE2细胞的增殖抑制作用与其阻滞细胞G1期有关,并且可能是通过抑制cyclin D1、CDK4的表达使CNE2细胞阻滞于G1期。     

二烯丙基三硫诱导人胃癌细胞凋亡与钙稳态失衡相关

目的探讨二烯丙基三硫(DATS)对人胃癌MGC803细胞的促凋亡作用及钙稳态失衡与该作用的相关性。方法体外培养MGC803细胞,采用MTT法,Tunnel法及流式细胞光度术分析经DATS处理后,对细胞增殖和凋亡的影响以及细胞内游离钙水平的改变。结果DATS处理后,培养的MGC803细胞增殖抑制。4、8、12、16、24mg·L-1的DATS对细胞生长的抑制率分别为0.231±0.037,0.305±0.036,0.455±0.029,0.607±0.058,0.751±0.019。Tunnel检测结果显示,对照组表达阴性,DATS处理组细胞呈阳性表达。流式细胞分析结果显示DATS呈浓度依赖性诱导胃癌MGC803细胞凋亡,16mg·L-1组凋亡率达0.242。细胞内游离钙水平呈浓度依赖性上升,16mg·L-1组荧光强度为对照组的4倍多。用细胞内游离钙特异性阻断剂BAPTAAM预处理细胞后,细胞内游离钙水平不再上升,且能抑制DATS诱导的凋亡。结论DATS能诱导胃癌MGC803细胞凋亡,DATS诱导胃癌MGC803细胞凋亡的作用与钙稳态失衡相关。     

二烯丙基二硫启动人白血病HL-60细胞凋亡模型的建立

目的寻找二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病HL-60细胞凋亡的启动点,建立DADS启动HL-60细胞凋亡模型。方法实验设未处理组、处理组和撤药组,分别采用细胞计数、流式细胞术、DNA凝胶电泳、Western blot等方法,绘制生长曲线,检测凋亡率、活化的caspase-3表达率以及DNALadder、凋亡相关蛋白的检测。结果3.6mg.L-1DADS作用HL-60细胞1d,与对照组相比,细胞数没有明显变化,而作用2～6d,细胞数分别减少24.1%、36.5%、44.2%、52%、53.6%。DADS作用1、2d,凋亡率分别为3.1%、4.3%,与未处理组(3.0%)差异无显著性,而作用3～5d的凋亡率分别达到8.5%,15.2%,27.4%,均高于未处理组(P<0.05)。DADS作用2～5d撤药后再培养至d6,凋亡率分别为7.9%,12.4%,16.5%,18.8%,高于未处理组的3.3%(P<0.05)。处理2～5d后,活化的caspase-3的表达率分别为10.0%、10.4%、14.9%、17.3%,均高于未处理组5.4%(P<0.05)。处理组中DADS处理4d后DNA凝胶电泳出现梯状条带,而DADS作用2～5d撤药后再培养至d6均出现明显梯状条带。Westernblot结果表明,从作用2d起,caspase-3表达开始上调,而Bcl-2表达开始下调。结论3.6mg.L-1DADS诱导人白血病HL-60细胞凋亡的启动点为处理2d。