环孢霉素A联合脾内肝细胞移植治疗急性肝衰竭的实验研究

目的探讨应用环孢霉素A（CsA）与同种异体肝细胞脾内移植联合治疗大鼠急性肝衰竭的疗效.方法采用硫代乙酰胺（TAA）诱导大鼠急性肝衰竭模型,24 h后随机分为三组：Ⅰ组：脾内注射浓度约为2×107个/mL肝细胞悬液1 mL,肌肉注射CsA 10 mg/（kg.d）;Ⅱ组：仅脾内注射约2×107个/mL肝细胞悬液1 mL,不用CsA;Ⅲ组：仅脾内注射生理盐水1 mL,作为空白对照.观察各组存活率、肝功能、肝脏病理变化及脾内移植肝细胞的存活情况.结果Ⅰ组、Ⅱ组1周存活率显著高于Ⅲ组（64.7%vs 12.5%,P〈0.01;56.3%vs 12.5%,P〈0.01）,但Ⅰ组和Ⅱ组之间比较无显著性差异（64.7%vs 56.3%,P〉0.05）.肝功能及病理情况在Ⅰ组、Ⅱ组有明显改善,尤以Ⅰ组最为显著.结论 CsA联合同种异体肝细胞移植能有效治疗大鼠急性肝衰竭,改善TAA诱导的肝衰竭大鼠的存活率,促进肝功能恢复及改善肝脏病理状况.     

肝细胞脾内移植治疗大鼠肝衰竭

目的:优化急性肝衰竭模型的构建方法及探讨经脾内同种异体肝细胞移植治疗大鼠急性药物性肝衰竭的疗效,并观察脾内移植肝细胞的生物学活性。方法:采用D-氨基半乳糖(D-gal)建立大鼠急性药物性肝衰竭模型。腹腔注射不同剂量的(1.0,1.2,1.4,1.6g/kg)D-gal后,以肝功能指标、病理形态学、死亡率等综合评估肝脏细胞损伤的状态,确定模型构建的最佳方案。造模后24h,随机分为2组进行治疗,Ⅰ组:经脾内移植肝细胞悬液1ml(4.4×107个);Ⅱ组:经脾内移植不含肝细胞的培养液1ml。观察大鼠1周的存活率、肝脏功能和病理变化及移植肝细胞的生物学活性。结果:①不同剂量的D-gal可导致不同程度的肝损伤,而以1.2g/kgD-gal造模组的大鼠死亡率适中,肝功能损害及其肝脏病理组织学改变均符合临界急性肝衰竭的程度,较好地模拟了急性肝衰竭的病理生理改变且稳定性较好。②移植后3d,Ⅰ组与Ⅱ组大鼠存活率相比具有显著性差异(P<0.01);肝功能指标:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(TBiL)均有明显改善(P<0.01);肝组织病理切片显示:Ⅰ组的肝组织损伤程度明显比Ⅱ组轻。经HE和PAS染色证实,移植的肝细胞在受体脾内结构和功能保持较好。结论:①D-gal1.2g/kg腹腔注射可较好构建SD大鼠急性肝衰竭模型。②经脾内肝细胞移植能明显提高药物性肝衰竭大鼠的存活率、改善肝功能及肝组织病理变化。     

异种肝细胞移植治疗肝衰大鼠的初步研究

将豚鼠肝细胞植入D -氨基半乳糖诱导的肝衰大鼠脾内 ,观察逆转肝衰的疗效并初步探讨其作用机理。结果表明 ,移植组的两周生存率明显大于对照组 (P <0 .0 5 ) ;脾内移植的异种肝细胞生存短暂 ( 2 4小时左右 )。提示 :异种肝细胞移植可以治疗肝衰 ;其机理需考虑与刺激受损肝细胞再生和 或增强受体对肝功能衰竭的耐受力有关 ,单纯的代谢支持作用的能力可能较弱     

甲状腺激素对急性肝衰竭大鼠肝细胞的保护作用

目的:探讨补充外源性甲状腺激素对急性肝衰竭大鼠肝细胞的保护作用?方法:将SD大鼠36只随机分为3组:对照组?急性肝衰竭组和治疗组?利用D-半乳糖胺腹腔注射制作大鼠急性肝衰竭模型,观测是否存在正常甲状腺病态综合征;通过腹腔注入10 mg/L三碘甲状腺原氨酸(T3)1.5 ml/kg,以纠正肝衰竭大鼠的低T3状态,检测血清生化指标并用光镜观察肝细胞的变化和凋亡?结果:急性肝衰竭大鼠模型存在低T3状态,治疗组大鼠肝衰竭表现轻,48 h存活率显著高于急性肝衰竭组(P < 0.05)?急性肝衰竭组大鼠肝细胞明显变性坏死,而治疗组肝细胞受损程度较轻?结论:急性肝衰竭大鼠存在正常甲状腺病态综合征,补充外源性甲状腺激素可以改善急性肝衰竭预后,并且对急性肝衰竭时肝细胞有明显的保护作用?     

Antitumor effects of interleukin-18 gene-modified hepatocyte cell line on implanted liver carcinoma

Objective To investigate the antitumor effects of intrasplenically transplanted interleukin-18 (IL-18) gene-modified hepatocytes on murine implanted liver carcinoma. Methods Embryonic murine hepatocyte cell line (BNL-CL2) was transfected with a recombinant adenovirus encoding IL-18 and used as delivery cells for IL-18 gene transfer. Two cell lines, BNL-LacZ and BNL-CL2, were used as controls. One week after intrasplenic injection of C26 cells (colon carcinoma line), tumor-bearing syngeneic mice underwent the intrasplenic transplantation of IL-18 gene-modified hepatocyte cell line and were divided into treatment group (BNL IL-18) and control groups (BNL-LacZ and BNL-CL2 ). Two weeks later, the serum levels of IL-18, interferon-γ (IFN-γ), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and nitric oxide (NO) in the implanted liver carcinoma-bearing mice were assayed, the cytotoxicity of murine splenic cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) was measured, and the morphology of the hepatic tumors was studied to evaluate the antitumor effects of the approach. Results In the treatment group, the serum levels of IL-18, IFN-γ, TNF-α and NO increased significantly. The splenic CTL activity increased markedly (P&lt;0.01) , accompanied by a substantial decrease in tumor volume and the percentage of tumor area and prolonged survival of liver carcinomo-being mice. Conclusions In vivo IL-18 expression by ex vivo manipulated cells with IL-18 recombinant adenovirus is able to exert potent antitumor effects by inducing a predominantly T-cell-helper type 1 (Th1) immune response. Intrasplenic transplantation of adenovirus-mediated IL-18 gene-modified hepatocytes could be used as a targeting treatment for implanted liver carcinoma.     

胎肝前体细胞脾移植对大鼠急性肝功能衰竭的实验研究

目的 :探讨经脾内同种异体移植培养的原代胎肝前体细胞与成体肝细胞悬液对大鼠药物性肝衰竭的疗效 ,并观察脾内移植肝细胞的生物学特性。方法 :采用 D-氨基半乳糖 ( D- gal)建立大鼠急性肝衰竭模型 ,2 4 h后随机分为三组进行治疗。 A组 :经脾内移植体外培养 7d的肝细胞 2× 1 0 7;B组 :经脾内移植肝细胞悬液 2× 1 0 7;C组 :经脾内注射生理盐水1 ml。观察受体大鼠的存活率、肝脏功能和病理变化及移植肝细胞的生物学特性。结果 :A组、B组大鼠存活率 ( 77%、5 9% )与 C组大鼠存活率 ( 2 2 % )相比具有显著性差异 ,肝功能各项指标均有明显改善 ,A、B组与 C组大鼠的肝功能改变方面有统计学差异。经 HE和 PAS染色证实 ,移植的肝细胞在受体脾内结构和功能保持较好。结论 :经脾内移植的培养的原代胎肝前体细胞和肝细胞悬液均能提高大鼠药物性肝衰竭的存活率、改善肝功能及肝脏组织病理变化 ,但培养原代胎肝前体细胞优于成体肝细胞悬液。     

微囊化鼠肝细胞腹腔移植的实验研究

目的：建立急性肝功能衰竭大鼠腹腔内微囊化肝细胞移植的动物模型，观察微囊及肝细胞形态和超微结构改变，并探讨移植物转归。方法：实验组60只Wister大鼠（受体）建立急性肝功能衰竭模型，分离纯化SD（供体）大鼠肝细胞，进行微囊化包裹，以每只鼠2．5×10^7个微囊化肝细胞进行腹腔移植，在移植后1周、2周分别处死30只受体大鼠．回收微囊．进行细胞形态及超微结构的观察。对照组15只Wister鼠只接受同等量空微囊．对比观察两组生存率、肝功能。结果：实验组大鼠存活率和肝功能指标改善情况明显好于对照组，移植后1周，微囊膜较完整。微囊间可见小血管增生，其内细胞活性好（81％±3％），腹腔中未见到炎症和免疫反应的迹象．且电镜观察细胞内结构正常、胞浆内细胞器丰富、核内容物存在。移植2周后微囊膜开始纤维化，部分肝细胞有变性。结论：微囊化肝细胞移植，可以治疗急性肝功能衰竭。微囊及肝细胞随着移植时间出现退行性改变。微囊的纤维化可能是导致移植后肝细胞存活下降的主要原因。     

猿病毒40大T抗原基因(SV40Tag)肝细胞移植治疗手术介导的急性肝衰竭的实验研究

目的：研究带猿病毒 40大T抗原 (SV4 0 Tag)基因肝细胞移植对手术介导的ALF(Acuteliverfailure)大鼠肝功能及生存率的影响。方法 :雄性Wistar大鼠切除肝脏 90 % ,然后在脾实质内移植普通肝细胞和SV4 0 Tag(Simianvirus 40largeTantigengene)肝细胞 ,观察其肝功能指标及生存率情况。结果 :普通肝细胞移植和SV4 0 Tag细胞移植组肝功能指标及生存率均好于ALF组 ,而SV4 0 Tag肝细胞移植组生存率又高于普通肝细胞移植组。结论 :SV4 0 Tag肝细胞移植及普通肝细胞移植均可改善ALF大鼠的肝功能指标及生存率 ,而SV4 0Tag组长期生存率高于普通肝细胞移植组。     

PLA-O-CMC纳米粒子培养的猪肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝再生作用的初步研究

目的:探讨胶原凝胶包埋聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米粒子粘附培养猪肝细胞移植对急性肝衰竭(ALF)大鼠肝的再生作用。方法:D-氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠ALF模型;48h后分别将5mlⅠ型胶原凝胶包埋的PLA-O-CMC纳米粒子粘附培养24h猪的肝细胞、5mlⅠ型胶原凝胶固定培养24h的猪肝细胞、5ml培养24h的猪肝细胞悬液(均含5.0×107个)移植到各组ALF大鼠腹腔内,并以5mlRPMI1640腹腔内注射作为阴性对照。观察大鼠14天存活率和受体肝脏的病理变化。结果:移植后14天ALF大鼠的存活率:单纯肝细胞移植组(Ⅰ组)为56.25%,胶原肝细胞移植组(Ⅱ组)为62.5%,纳米胶原肝细胞移植组(Ⅲ组)为75%,阴性对照组(Ⅳ组)为18.75%,各移植组14天存活率高于对照组(P<0.05),各移植组间无统计学意义(P>0.05)。ALF大鼠肝脏再生于ALF后5～7天最为显著;各组肝脏病理变化以Ⅲ组恢复最好,双核细胞最多,肝再生最快。结论:应用PLA-O-CMC纳米粒子和Ⅰ型胶原联合培养猪肝细胞移植于ALF大鼠腹腔内能促进肝脏的再生。     

GDNF基因修饰神经干细胞移植治疗大鼠帕金森病

目的探讨孕14~15 d胎鼠中脑来源神经干细胞（mNSCs）被胶质源性神经营养因子（GDNF）基因修饰并移植于帕金森病
模型大鼠纹状体区的治疗作用。方法取孕14~15 d胎鼠解剖显微镜下分离中脑腹侧组织进行mNSCs培养,培养5 d后行GFP/
GDNF基因修饰。PD大鼠模型的建立参照大鼠脑立体定向图谱,立体定向中脑背盖腹侧区、内侧前脑束注射6-羟多巴胺。将
PD大鼠随机分组,将基因修饰的干细胞以及无基因修饰干细胞移植到帕金森病大鼠纹状体区,建立空白mNSCs（PBS替代）移
植组、GFP基因修饰mNSCs移植组、GDNF基因修饰mNSCs移植组3个实验组。移植细胞前后进行行为学评估,以腹腔注射阿
朴吗啡（APO 0.5 mg/kg）诱导PD大鼠旋转圈数作为细胞移植的治疗作用评估手段。免疫荧光组织化学鉴定移植细胞存活、迁
移和分化。结果GDNF基因修饰神经干细胞移植组较对照组和GFP基因修饰神经干细胞移植组有明显的行为改善;移植56 d
后,GDNF基因修饰mNSCs移植组较其他两组检测到更多细胞存活,向多巴胺能神经元分化较其他两组都有增加趋势。结论
GDNF基因修饰mNSCs移植可显著改善PD大鼠的运动障碍,其分子机制有待进一步研究。
     

混合细胞共微囊化对肝细胞功能的支持作用

目的观察大鼠肝细胞、转基因肝星状细胞株HGF／CFSC和／或大鼠骨髓来源Thy-1^＋β2M^-细胞（BDTC）共微囊化对肝细胞生物学活性的支持,及腹腔移植混合细胞微囊对急性肝衰竭大鼠肝功能的改善作用。方法利用微囊发生器制备含肝细胞或混合细胞的微囊,依微囊内包裹细胞种类不同,分为微囊化肝细胞组、微囊化肝细胞＋CFSC／HGF组）和微囊化肝细胞＋CFSC／HGF＋BDTC组,通过观察囊内细胞形态和体外培养测定培养液中白蛋白和尿素的分泌,判断各组囊内肝细胞活性和功能的维持;将90％肝大部切除所致的急性肝衰竭大鼠按照移植微囊种类不同分为空囊对照组和上述3个实验组（每组10只）,观察腹腔植入后不同时间大鼠的一般状况、存活时间、血生化改变、肝组织再生及微囊化移植物的组织学特征。结果与单独肝细胞微囊者相比,混合细胞微囊内肝细胞存活时间超过1倍,培养液中白蛋白分泌和尿素合成量明显增加（均P〈0．01）;与对照组相比,微囊化肝细胞或微囊化混合肝细胞移植后,急性肝衰竭大鼠的肝功能显著改善、存活率明显提高（10／10 vs 1／10）,其肝组织再生完全;移植21—42d时,部分微囊附着于肝脏表面并出现血管化,微囊表面存在不同程度的纤维化,微囊内仍有存活的细胞,以微囊化混合肝细胞组优于微囊化肝细胞组。结论混合细胞共微囊化能明显改善囊内肝细胞的存活寿命、形态和功能的维持,微囊化混合肝细胞腹腔移植对促进急性肝衰竭大鼠的肝功能恢复具有显著作用。     

解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠Caspase-8、BID的影响

目的解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠Caspase-8、Bid的影响。方法将急性肝衰动物模型随机分成模型组、裸肝细胞移植组、微囊化肝细胞移植组、解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植组。造模后24 h、48 h、72 h、120 h和168 h测定ALT、AST,免疫组化法检测Caspase-8、Bid表达。结果解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植组ALT、AST下降,48 h、72 h与裸肝组、微囊组比较差异有统计学意义(P<0.05);解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植组Caspase-8、Bid表达下降,48～168 h较裸肝组、微囊组有统计学意义(P<0.05)。结论解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植显著改善肝衰大鼠肝功能及预后。     

Proliferation of retrorsine-treated SD rat immortalized hepatocytes after intrasplenic transplantation]

OBJECTIVE: To investigate the effect of retrorsine on the proliferation of SD rat immortalized hepatocytes after intrasplenic transplantation. METHODS: Immortalized hepatocytes from SD rats was prepared by transfecting the primary hepatocytes with a retroviral vector SSR69 expressing the genes encoding Simian virus 40 T large antigen. Twenty-four adult SD rats were randomly assigned to 3 equal groups designated respectively as A, B, and C groups. Intraperitoneal retrorsine injections at the dose of 26 mg/kg.b.w. were performed twice in groups A and B at the interval of two weeks before hepatocyte transplantation. After 20% hepatic lobe resection were completed in all the groups, groups A and C received intraplenic transplant with immortalized hepatocytes, while group B received normal hepatocyte transplant. Post-mortem examinations were performed on the spleen samples with HE staining. Albumin expression in the transplanted hepatocytes was examined by immunohistochemical staining, and the ultrastructure of the transplanted cells was observed under transmission electron microscope. RESULTS: Histological examination demonstrated that the rat spleens in all the 3 groups contained cluster of transplanted hepatocytes from 1 week to 3 weeks after the transplantation, and the proliferation of the transplanted cells were comparable between groups A and B, but both of which showed significant difference from group C. Albumin excretion by the immortalized hepatocyte was identified in all the groups, and the transplanted immortalized cells preserved normal cell ultrastructure. CONCLUSION: Immortalized hepatocytes of SD rat have the normal cell ultrastructure and albumin-excretion function, and retrorsine can promote the proliferation of the transplanted hepatocytes.     

辅助性肝移植门静脉动脉化治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究

目的 探讨门静脉动脉化异位辅助肝移植对大鼠急性肝功能衰竭的治疗作用和肝动脉血供对移植肝早期功能的影响。方法 将切除85％肝脏的急性肝功能衰竭大鼠随机分为三组：A组（n=20)，异位辅助肝移植门静脉动脉化加肝动脉血供建立；B组（n=20)，异位辅助肝移植门静脉动脉化；C组（n=10)，为对照组。观察肝衰组和移植组大鼠生存情况、肝功能变化、残肝和移植肝病理结构改变以及肝动脉血供对移植肝早期功能影响。结果 A组和B组大鼠2周生存率分别是85．7％和64．3％，C组大鼠48h存活率为0。移植肝再灌注后，A组胆汁分泌率比B组明显增高（P＜0．05），术后2周内，A组血清ALT、GGT、Tbil值显著降低（与B组比较，P＜0．05）。移植术后14天，A组和B组残肝细胞都明显增生，肝功能恢复正常，而移植肝开始萎缩，肝细胞变性，汇管区有淋巴细胞浸润。结论 辅助肝移植门静脉动脉化为急性肝功能衰竭提供了有效的支持作用，使原肝再生，肝功能恢复正常，而移植肝逐渐萎缩丧失功能。在大鼠辅助肝移植中，肝动脉血供有助于改善移植肝早期功能，防止术后胆道并发症的发生。     

T细胞分化群40补体免疫球蛋白基因修饰骨髓间充质干细胞在肝移植排斥反应中的作用

目的探讨T细胞分化群40补体免疫球蛋白(CD40LIg)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)肝移植排斥反应中的作用。方法采用双袖套法建立DA-Lewis大鼠原位肝移植模型,经门静脉输注CD40LIg基因转染的MSCs,观察大鼠肝移植术后肝功能的变化、生存情况和移植肝病理形态学的改变,检测肝移植大鼠干扰素(INF-γ)和白细胞介素4(IL-2)水平的变化。结果(1)基因转染MSCs组生存时间显著长于对照组、单纯MSCs组和基因转染组,而单纯MSCs组和基因转染组又较对照组显著延长(P<0.05)。(2)对照组谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)、IL-2和INF-γ水平在肝移植术后急剧升高,各时段均显著高于3个治疗组(P<0.05);(3)肝脏组织病理检查,对照组呈重度排斥反应,单纯MSCs组和基因转染组为轻度排斥反应,而基因转染MSCs组无明显排斥反应。结论 CD40LIg基因修饰MSCs可以延长肝移植大鼠的存活时间,抑制大鼠肝移植的排斥反应。     

人胚胎肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭的效果分析

目的 探讨人胚胎肝细胞移植治疗急性肝衰竭(ALF)的疗效及能否成为移植细胞源.方法 采用四甲基偶氮唑盐法检测人胚胎肝细胞增殖情况;免疫细胞化学检测其ALB、细胞角蛋白-18(CK-18)的表达; D-氨基半乳糖(D-gal)药物诱导ALF的实验动物模型;人胚胎肝细胞移植治疗ALF的动物模型,包括移植组与对照组在肝功能指标[ALT、AST、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)]的差异性比较.免疫组织化学法检测植入脾脏中的人胚胎肝细胞ALB及CK-18的表达.结果 培养第5天左右细胞数量达到最高峰,每天完成4～5次分裂,胚胎肝细胞的生长曲线呈抛物线型.免疫细胞化学检测提示其具有表达ALB、CK-18的功能; D-gal 1.6 g/kg腹腔注射72 h后大鼠ALF模型制备成功;移植第3～5天后,移植组与对照组比较,肝功能(ALT、AST、ALP、TBIL)指标差异有统计学意义(P<0.01).植入脾内的肝细胞具有分泌并表达CK-18、ALB的功能.结论 人胚胎肝细胞脾内移植能有效治疗ALF,并可能成为肝细胞移植的靶细胞源.     

异种冻存肝细胞移植治疗急性肝衰的可行性研究

目的：探讨冻存猪肝细胞移植治疗大白鼠急性肝衰的可行性。方法：将猪肝细胞在液氮中冻存１５０ｄ后移植给切除８０％肝叶的大鼠。结果：冻存肝细胞活率为冻前的７８％，光、电镜显示细胞完整，细胞内糖原和葡萄糖－６－磷酸酶丰富。移植组鼠的存活率为１６／ｌ７，明显高于对照组３／９，Ｐ＝０．００２。但肝衰后２和７ｄ的两组间残肝重量及肝功能生化值并无显著差异。结论：冻存猪肝细胞移植可治疗急性肝衰，其作用机理可能是综合效应的结果。     

骨髓间质干细胞肝向诱导分化前后肝功能代偿能力的比较

目的探讨不同分化状态骨髓间质干细胞移植对急性肝功能衰竭大鼠的肝功能重建的影响,并进行综合比较评估。方法以D一氨基半乳糖胺（D—gal）构建的雌性大鼠急性肝衰竭模型后大鼠,随机分为4组：BMSCs移植组,幼稚肝细胞移植组,成熟肝细胞移植组和空白对照组,结合多项血生化指标对不同分化阶段BMSCs的肝功能代偿能力进行综合评估。并以sry基因为分子标志,采用PCR技术检测植入细胞在受体动物体内的存留状态及定位情况。结果各组肝衰模型动物经细胞移植后,所测各项血清生化指标均有显著变化。血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）的水平明显下降,白蛋白（ALB）的水平有所上升。各移植组之间相比,诱导至成熟肝细胞状态的细胞无论对肝功能的改善或是降低动物死亡率,效果均为最优。细胞移植后的第30天,仍能在受体动物肝脏内检查到sry基因信号。结论体外诱导分化至不同阶段的BMSCs均能在一定程度上代偿衰竭肝脏的功能,而诱导分化至成熟状态的细胞对肝功能的代偿能力最强,可作为代偿肝功能的重要细胞源之一.     

肝移植大鼠肠外营养模型的建立与评价

目的建立稳定的肝移植大鼠全肠外营养(TPN)模型.方法以二袖套法进行大鼠原位肝移植,并采用改制的代谢笼及输液保护架,术后6 h从右颈外静脉给予含中长链脂肪乳剂的TPN,观察其大体情况及7 d存活率、肝功能、移植肝组织学改变.结果 30例肝移植大鼠TPN支持后7 d存活率86.7%(26/30),光镜检查肝细胞无坏死,电镜检查线粒体结构完整.结论本实验所建立的大鼠肝移植TPN模型稳定、重复性好、易于操作.