RNAi对结肠癌HCT-8细胞桩蛋白表达的沉默作用观察

目的观察RNA干扰（RNAi）对结肠癌HCT-8细胞桩蛋白（Paxillin）表达的沉默作用。方法构建针对Paxillin基因序列的短发卡RNA（shRNA）表达载体,并转染至结肠癌HCT-8细胞,72 h后分别用实时定量PCR和Western blot法测定转染细胞中Paxillin mRNA及蛋白。结果根据针对Paxillin基因设计了小干扰RNA（siRNA）序列,构建了shRNA表达载体,并成功转染至HCT-8细胞。以空白对照组作均一化,转染Paxillin-shRNA_1、Paxillin-shRNA_2、Paxillin-shRNA_3、Paxillin-shRNA_NC的细胞及空白对照组细胞Paxillin mRNA相对表达量分别为0.66±0.28、0.31±0.11、1.00±0.22、1.05±0.32、1.00±0.29,Paxillin蛋白相对表达量分别为0.62±0.11、0.39±0.13、0.74±0.21、0.94±0.09、1.00±0.16。结论 RNAi可沉默结肠癌HCT-8细胞Paxillin的表达。     

稳定高表达CYP2E1基因肝癌HepG2细胞系的构建

目的构建稳定高表达CYP2E1基因的肝癌HepG2细胞系。方法通过NCBI查询CYP2E1的编码序列,设计并构建表达质粒p LV(Exp)-Puro-CMVm-CYP2E1,用载体对应的慢病毒包装质粒(p MDLg/pRRE、pRSVREV和p MD2.G)共同转染293T细胞。利用携带CYP2E1基因的慢病毒(Lenti-CYP2E1-e GFP-Puro)感染HepG2细胞系,采用嘌呤霉素抗性筛选方法构建高表达CYP2E1肝癌HepG2细胞系。增强绿色荧光蛋白检测转染情况,荧光定量PCR及Western blotting检测HepG2、空载及转染CYP2E1基因的HepG2细胞系中CYP2E1 mRNA和蛋白。结果 HepG2细胞系均成功转染CYP2E1基因。HepG2、空载及转染CYP2E1基因的HepG2细胞系中CYP2E1mRNA相对表达量分别为1.02±0.06、1.06±0.05、7.42±0.07,蛋白相对表达量分别为0.26±0.02、0.29±0.01、1.61±0.08,转染CYP2E1基因的HepG2细胞系与前两者比较,P均<0.05。结论通过慢病毒转染成功构建了稳定高表达CYP2E1基因的肝癌HepG2细胞系。     

miR-133a-3p重组腺相关病毒的构建及抑制LX-2细胞α-SMA基因表达

目的构建miR-133a-3p重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)过表达载体并转染肝星状细胞,鉴定其转染及干预作用。方法体外培养肝星状细胞株LX-2细胞,试验分为DMEM对照组,AAV8-Scrambled对照组,AAV8-miR-133a-3p组,应用qRT-PCR法检测miR-133a-3p转染表达量,检测胶原蛋白(COL1A1)、-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和TGF-β/Smad信号通路基因的表达量。结果重组腺相关病毒成功构建并转染LX-2细胞,AAV8-miR-133a-3p转染LX-2细胞组的miR-133a-3p相对表达量为11 000±343.10,与DMEM对照组比较差异有统计学意义(t=32.07,P0.01)。AAV8-miR-133a-3p转染组与DMEM组α-SMA mRNA的相对表达量分别为0.42±0.06 vs 1.00±0.09(t=5.72,P0.05),COL1A1 mRNA的相对表达量为0.34±0.03 vs 1.00±0.04(t=12.66,P0.01)。结论重组腺相关病毒成功转染LX-2细胞,且能抑制肝星状细胞纤维化标志物α-SMA的表达,为探讨miR-133a-3p在调控肝星状细胞所致纤维化中的作用奠定了理论基础。     

沉默ABCC4基因表达对人胰腺癌PANC1、BxPC-3细胞增殖的影响

目的 检测ABCC4基因沉默后对人胰腺癌PANC1、BxPC-3细胞增殖及细胞周期的影响.方法 构建插入靶向ABCC4的shRNA片段的重组慢病毒载体,感染人胰腺癌细胞株PANC1和BxPC-3.采用实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测感染细胞的ABCC4 mRNA及蛋白表达,克隆形成实验测定感染细胞形成的克隆数,流式细胞仪检测感染细胞的细胞周期.结果 成功构建了插入靶向ABCC4的shRNA片段的重组慢病毒载体.重组慢病毒感染PANC1及BxPC-3细胞后,细胞ABCC4 mRNA表达被抑制(0.28 0.01比1.00±0.03,0.22 ±0.02比1.00 ±0.03,P值均＜0.05);ABCC4蛋白表达亦显著下调;感染的PANC1细胞克隆形成数量显著减少(4比65,P＜0.05);细胞周期阻滞在G1期[(54.98±1.78)％比(42.93±0.88)％,(68.55±0.75)％比(54.76 ±0.29)％].结论 沉默人胰腺癌PANC1和BxPC-3细胞的ABCC4基因表达可显著抑制癌细胞的增殖,使细胞阻滞于G1期.     

siRNA干扰人胰腺癌T3细胞系KAI1基因的表达

目的 应用小分子干扰RNA(small interference RNA,siRNA)干扰KAI1基因在人胰腺癌T3细胞系的表达,为基因治疗胰腺癌打下基础.方法 针对KAI1基因CD82片段序列设计A、B、C、D 4个siRNA靶序列,构建针对KAI1基因(CD82)含siRNA片段的慢病毒载体.以脂质体2000转染T3细胞,测定病毒滴度.以空载体、含不同靶序列siRNAd1载体的病毒感染T3细胞(MOI=5),采用实时PCR方法检测CD82mRNA的表达.结果 正常对照组、空载体对照组、A靶序列组、B靶序列组、C靶序列组和D靶序列组CD82 mRNA表达量分别为1.398 ±0.242、1.311 ±0.048、0.664±0.093、0.345 ±0.032、0.641 ±0.049和0.147±0.049,各靶序列组的表达量明显低于空载体对照组(P＜0.01).结论 应用RNAi可有效抑制T3细胞KAI1基因CD82片段的表达.     

胰腺癌CFPAC1细胞增殖诱导配体基因shRNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人胰腺癌细胞株CFPAC1增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的shRNA慢病毒表达载体.方法 应用基因工程技术,筛选出针对APRIL基因的RNAi靶序列,与pGCL-GFP载体连接,构建慢病毒表达载体LV-shAPRIL;将连接产物转化到DHSα感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.再用LV-shAPRIL、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒.重组慢病毒感染CFPAC1细胞,实时定量PCR和Western blotting检测CFPAC1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达.结果 PCR和测序结果与构建的慢病毒载体的预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为5×107TU/ml.构建的慢病毒载体感染CFPAC1细胞后第4天、第4周和第8周,APRIL mRNA表达量较空载体慢病毒感染组分别下降了73%、70%和71%;APRIL蛋白表达量分别下降了66%、63%和62%(P＜0.05).而各时间段未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无明显差异(P＞0.05).结论 成功构建了APRIL基因的shRNA慢病毒表达载体LV-shAPRIL.     

慢病毒介导的E2F-1沉默对人胃癌细胞MGC803中药人参黄芪复方药物敏感性的影响

目的:利用重组慢病毒介导的E2F-1基因沉默载体感染人胃癌MGC-803细胞,观察其对中药人参黄芪复方药物敏感性的影响.方法:将胃癌MGC-803细胞接种于培养板中分为4组:正常组(正常培养基)、空白对照组(中药培养基)、阴性对照LV-RNAi组(中药培养基+感染空载体慢病毒颗粒2.0×109TU/mL)、E2F-1-RNAi-LV组(中药培养基+感染E2F-1基因重组慢病毒颗粒2.0×109TU/mL),分别采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测E2F-1mRNA及蛋白表达;MTT方法检测细胞的增殖抑制率;Giemsa染色检测细胞的克隆形成;流式细胞仪检测细胞的凋亡;细胞划痕实验检测细胞迁移能力.结果:E2F-1基因沉默蛋白及mRNA表达水平均明显下降,差异有统计学意义(0.384±0.036vs0.883±0.051和0.923±0.049,0.220±0.056vs0.729±0.021和0.712±0.037,P<0.05).中药人参黄芪复方能抑制人胃癌MGC-803细胞生长、诱导胃癌细胞凋亡、抑制细胞克隆形成及迁移;与空白对照组及阴性对照组相比较,E2F-1基因沉默组MGC-803细胞增殖抑制率、细胞凋亡率显著提高,其细胞克隆形成、细胞迁移面积显著降低,差异均有统计学意义(0.789±0.013vs0.484±0.060和0.454±0.006,0.383±0.027vs0.114±0.038和0.089±0.051,0.024±0.003vs0.036±0.004和0.052±0.002,0.553±0.038vs0.897±0.020和0.928±0.051,P<0.05).结论:重组慢病毒载体介导的E2F-1基因沉默能有效增强中药人参黄芪复方对人胃癌MGC-803细胞的药物敏感性.     

人PETA-3/CD151基因RNAi慢病毒载体的构建及沉默效应鉴定

目的构建PETA-3/CD151shRNA慢病毒表达载体,并在人乳腺癌细胞株MCF-7细胞鉴定其转染及基因沉默效果。方法应用基因工程技术,构建4条针对PETA-3基因的RNAi靶序列,分别与慢病毒载体Pg LV3连接,构建重组慢病毒表达载体PETA-3-shRNA-1~4;将连接产物转化到Top10感受态细胞,经筛选阳性克隆、测序鉴定。应用脂质体法转染293FT细胞,进行病毒包装及滴度测定。将包装产生的4种重组慢病毒分别感染MCF-7细胞,实时定量PCR和Western印迹检测MCF-7细胞PETA-3 mRNA和蛋白的表达。根据筛选的结果,选取最有效的载体进行病毒的大量包装。结果 4个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,感染MCF-7细胞96 h后,PETA-3-shRNA-2 mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降,其中mRNA表达下降85%,蛋白表达下降84%(均P<0.05)。shRNA-2病毒载体大量包装后其滴度为1×109TU/ml。结论成功构建针对PETA-3基因的慢病毒载体PETA-3-RNAi-LV3,体外感染MCF-7细胞后可有效抑制PETA-3基因和蛋白的表达。     

沉默小窝蛋白1对棕榈酸作用下的胰岛β细胞存活的影响

目的探讨小窝蛋白1(Cav1)对棕榈酸作用下的胰岛β细胞存活的影响。方法通过慢病毒载体构建Cav1沉默的小鼠胰岛素瘤NIT-1细胞株和小鼠原代胰岛(Cav1-shRNA组),以空载体病毒组作为对照组(Ctrl-shRNA),并设空白对照组,各组均分别加入脱脂牛血清白蛋白和棕榈酸(0.5 mmol/L)处理24 h及48 h,通过四甲基偶氮唑蓝比色法及Hoechst33342/碘化丙啶(PI)双染色法检测细胞活性及细胞凋亡,实时荧光定量PCR、Western blot检测凋亡相关的mRNA及蛋白表达水平。结果采用t检验和单因素方差分析法进行统计学分析。结果与对照组比较,棕榈酸处理组的细胞存活率显著下降(0.89±0.10比0.24±0.04,t=13.49,P<0.01),P18、P19的mRNA和蛋白表达均上调(1.00±0.09比1.30±0.04、1.00±0.04比1.37±0.13,t=5.28、4.71,均P<0.05;0.87±0.04比1.48±0.05、1.02±0.06比1.41±0.07,t=16.50、7.33,均P<0.01);含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-6、Caspase-9和Caspase-12的mRNA表达水平明显上调(1.00±0.04比1.57±0.08、1.01±0.15比1.57±0.20、1.02±0.19比1.57±0.09,t=11.04、3.88、4.53,均P<0.05),蛋白表达也明显上调(0.86±0.10比1.28±0.11、0.69±0.01比0.86±0.06、0.70±0.02比1.18±0.01,t=4.89、4.84、37.18,均P<0.01)。而Cav1-shRNA+棕榈酸组细胞存活率较Ctrl-shRNA+棕榈酸组显著上升(0.53±0.10比0.26±0.08,t=4.71,P<0.01),P19的mRNA和蛋白表达均下调(1.53±0.18比0.66±0.04、1.48±0.05比0.70±0.02,t=8.17、25.09,均P<0.01);Caspase-6、Caspase-7、Caspase-9和Caspase-12的mRNA表达水平下调(1.82±0.11比1.03±0.07、1.43±0.24比0.42±0.15、1.41±0.22比0.51±0.18、1.45±0.18比0.42±0.13,t=5.48~10.49,均P<0.01),蛋白表达也下调(0.99±0.14比0.63±0.11、0.90±0.14比0.62±0.04、0.90±0.02比0.60±0.04、1.30±0.01比0.65±0.04,t=3.50~27.31,均P<0.01)。结论Cav1沉默可以通过影响胰岛β细胞Caspase家族,促进其增殖、减少棕榈酸作用下的β细胞凋亡,保护脂毒性下胰岛β细胞活性。     

靶向人BRG1基因的慢病毒载体构建及效率验证

目的:构建靶向人BRG1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并验证其沉默效率。方法:设计3个针对人BRG1基因的特异性shRNA序列(shBRG1),构建于pLKO.1慢病毒载体中,并与psPAX2和pMD2.G质粒共同转染293T细胞以包装成慢病毒颗粒。将包装好的慢病毒感染人主动脉平滑肌细胞(HASMC),应用实时荧光定量PCR和western blot检测BRG1 mRNA和蛋白表达水平,判断其沉默效率。结果:3种shBRG1干扰序列均成功插入慢病毒载体中且测序正确,3种慢病毒均可有效降低BRG1 mRNA表达水平(P均0.01)。其中shBRG1-3的沉默效率最高,其感染HASMC后BRG1蛋白表达水平较对照组显著下降(P0.01)。结论:靶向人BRG1基因的shRNA慢病毒表达载体构建成功,shBRG1-3慢病毒能够有效降低BRG1 mRNA和蛋白表达水平。     

小鼠SOCS1基因沉默重组慢病毒载体的构建及其在DC2.4细胞中的表达

目的构建携带小鼠SOCS1基因沉默重组慢病毒载体,鉴定其在小鼠树突状细胞系(DC2.4)中SOCS1基因的表达并筛选稳定沉默表达SOCS1基因的小鼠树突状细胞系。方法根据小鼠SOCS1基因筛选相应靶序列,与表达载体pYr-Lvsh连接后转化感受态DH5α细胞,挑取细胞克隆进行酶切及测序鉴定,鉴定正确的载体转染293FT细胞,进行慢病毒包装及滴度测定。将包装的慢病毒PLV-musSOCS1-shRNA转染DC2.4细胞系,通过荧光显微镜、流式细胞仪及real-time PCR检测DC2.4细胞中SOCS1基因的表达,通过台盼蓝染色检测转染后细胞活性。结果表达载体pYr-Lvsh测序显示引物完全连接到载体上。将测序所得序列与引物比对,PLV-musSOCS1-sh构建成功。扩增后检测慢病毒滴度约为4×109 TU/ml。慢病毒转染24h后荧光显微镜下可见少量表达绿色荧光的DC2.4细胞,且随着时间的延长,转染成功的细胞逐渐增多,细胞内荧光强度渐次增强,48h后表达量明显增多,72h后更加明显。经流式细胞仪检测,转染48h及72h细胞绿色荧光表达率均达100%。对照组的细胞活性为(92.27±0.80)%,转染组转染后48h的细胞活性为(88.40±0.92)%,差异有统计学意义(t=5.499,P0.01);转染组转染后72h的细胞活性为(44.97±3.70)%,与对照组及48h转染组比较差异有统计学意义(t值分别为21.637和19.733,P0.01)。real-time PCR检测,转染组SOCS1基因相对表达量较空病毒载体对照组下调约75.3%(t=-10.179,P0.01)。结论构建的慢病毒PLV-musSOCS1-shRNA在DC2.4细胞中成功沉默SOCS1基因并稳定表达,成功筛选出低表达SOCS1基因的小鼠树突状细胞系,为通过SOCS1基因沉默调控DC免疫状态抗真菌感染免疫等相关研究奠定了基础。     

慢病毒携带的短发夹RNA对乳腺癌细胞乙酰肝素酶基因表达的沉默作用

目的通过构建短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,探讨慢病毒携带的shRNA对乳腺癌细胞乙酰肝素酶(HPA)基因表达的沉默作用。方法采用RNA干扰(RNAi)序列设计原则,以乳腺癌HPA基因为靶基因,将构建5对shRNA重组慢病毒载体,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过Western印迹检测HPA-shRNA对MDA-MB-231细胞HPA蛋白表达水平的影响;用CCK-8的方法检测HPA-shRNA对乳腺癌细胞的生长抑制作用及5-氟尿嘧啶(5-Fu)对乳腺癌细胞的杀伤作用,运用transwell实验检测HPA-shRNA对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。进一步,运用流式分析的方法检测HPA-shRNA对乳腺癌细胞周期的影响。建立小鼠转移瘤模型,检测HPA-shRNA在体内对乳腺癌细胞的生长抑制作用。结果成功构建HPA-shRNA重组慢病毒载体。在体外,实验组HPA-shRNA1组、HPA-shRNA3组、HPA-shRNA4组有效沉默了人乳腺癌MDA-MB-231细胞HPA的表达,HPA蛋白表达明显降低(P<0.05)。HPA-shRNA1对乳腺癌细胞的生长具有良好的抑制作用,HPA-shRNA1能够增加乳腺癌细胞对5-Fu的敏感性。此外,HPA-shRNA1能够诱导乳腺癌细胞在S期发生细胞周期阻滞。在体内,HPA-shRNA1组HPA基因mRNA相对表达量明显低于阴性对照组(P<0.05),HPA-shRNA1能够沉默乳腺癌移植瘤HPA mRNA表达。在体内HPA-shRNA1同样能够抑制乳腺癌细胞生长。结论 HPA-shRNA重组慢病毒载体可有效抑制乳腺癌HPA基因的表达,进而发挥良好的抗肿瘤作用。     

大鼠PAX2基因RNA干扰慢病毒载体的构建及沉默效果

目的构建PAX2特异性shRNA干扰慢病毒载体并观察其对大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)中PAX2基因的沉默效果。方法采用PAX2基因RNAi靶点序列合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与pGCSIL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定。用脂质体转染法将质粒共转染293T细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染NRK52E细胞,RT-PCR、Western印迹检测PAX2 mRNA和蛋白的表达。结果 PCR与DNA测序证实合成的含PAX2 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。经RNA干扰后的靶细胞PAX2 mRNA及蛋白表达水平明显降低。结论成功构建人PAX2基因RNA干扰慢病毒载体,为以PAX2基因为靶点的梗阻性肾病基因治疗研究奠定了基础。     

氨基醇类化合物HT24对多房棘球蚴原头节微管蛋白表达水平的影响

目的探索氨基醇类化合物HT24对多房棘球蚴原头节微管蛋白表达水平的影响。方法从感染多房棘球蚴的BALB/c小鼠体内分离原头节,体外培养1 d后分为对照组和低、中、高浓度组,分别加入终浓度0.5%的二甲基亚砜(DMSO)和25、 50、 100μmol/L的HT24共培养,每组设3个平行孔,每孔含原头节约2 000个。HT24作用后第1～3天观察虫体活性及形态改变,第3天透射电镜下观察原头节焰细胞超微结构的变化情况,第3、 5、 7天实时荧光定量PCR (qPCR)检测原头节中α9-,β2-,β4-和β6-微管蛋白基因的mRNA相对转录水平,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测原头节中β-微管蛋白的相对表达量。组间比较使用双因素方差分析方法。结果氨基醇类化合物HT24作用后第3天,低浓度组多房棘球蚴原头节轮廓模糊,虫体胀大,透明度降低,部分钩突脱落;中浓度组原头节明显胀大,钩突脱落;高浓度组原头节全部死亡,虫体缩小。透射电镜观察结果显示,中、高浓度组焰细胞胞膜破裂,胞质内纤毛断裂,出现大的缺口或断裂口,部分纤毛溢出,游离于细胞外。qPCR结果显示,相较于对照组(100),低、中、高浓度组第7天α9-微管蛋白基因mRNA相对转录水平分别为8.01±1.54、 9.84±0.40和7.85±2.60, 3组间差异有统计学意义(P 0.01);β2-微管蛋白基因mRNA相对转录水平分别为10.97±0.69、 11.83±0.97和6.48±1.52, 3组间差异有统计学意义(P 0.01);β4-微管蛋白基因mRNA相对转录水平分别为10.61±1.24、 8.31±1.05和7.47±0.96, 3组间差异有统计学意义(P 0.01);β6-微管蛋白基因mRNA相对转录水平分别为8.83±0.80、 7.89±1.30和5.63±2.25, 3组间差异有统计学意义(P 0.01)。Western blotting分析结果显示,HT24作用后第3天低、中、高浓度组β-微管蛋白的相对表达量分别为0.36±0.06、 0.23±0.03和0.61±0.06,均低于对照组(0.67±0.05)(P 0.01);第5天分别为1.12±0.03, 0.55±0.04, 0.30±0.02,均高于对照组(0.26±0.03)(P 0.01);第7天分别为0.73±0.05, 0.36±0.04, 0.40±0.04,其中中、高浓度组低于对照组(0.73±0.05)(P 0.01)。结论氨基醇类化合物HT24能降低多房棘球蚴原头节微管蛋白基因mRNA和蛋白的表达水平,影响微管蛋白功能,从而抑制多房棘球蚴的生存。     

RNAi沉默HMGN5基因对肺癌A549细胞增殖的影响

目的构建HMGN5基因的shRNA慢病毒载体,并在肺癌A549细胞上鉴定其沉默效率,观察其对细胞增殖能力的影响。方法筛选HMGN5基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA,与LentiLox3.7慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒,感染肺癌A549细胞,设阴性组及干涉组,应用Real-time PCR和Western印迹的方法检测HMGN5在mRNA和蛋白水平的沉默效率,MTT和克隆形成实验观察HMGN5基因沉默对A549细胞增殖的影响。结果构建的shRNA慢病毒颗粒感染A549细胞后,干涉组HMGN5基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降了71.7%,显著抑制其蛋白表达;MTT结果表明细胞增殖能力明显降低,干涉组克隆形成能力较阴性组明显减弱。结论成功构建了HMGN5基因的shRNA慢病毒表达载体,其能够在肺癌A549细胞上有效沉默靶基因。HMGN5基因具有影响肺癌细胞恶性增殖的能力,为肺癌的基因治疗奠定了实验基础。     

利用CRISPR/Cas9慢病毒载体构建敲除大鼠肝星状细胞COX-2基因的细胞模型

目的通过构建CRISPR/Cas9慢病毒载体,转染HSC-T6细胞,获得能稳定表达Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞,为后期的功能研究提供良好的工具和手段,为临床上治疗肝纤维化提供新策略。方法设计合成COX-2基因特异性的sgRNA(COX-2-sgRNA-1、COX-2-sgRNA-2、COX-2-sgRNA-3),并将其连接至GV371载体上,提取重组后的质粒,将其与包装质粒共同转染到293T细胞,形成慢病毒颗粒,荧光法检测病毒滴度。按照MOI值计算病毒最适用量,先将Lenti-Cas9-puro转染至HSC-T6细胞,嘌呤霉素筛选得到HSC-T6-Cas9细胞,再用Lenti-COX-2-sgRNA-EGFP转染至HSC-T6-Cas9细胞获得HSC-T6-COX-2-/-细胞,通过Cruiser酶切检测及Western Blot等方法在基因和蛋白水平上进行敲除验证。计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果通过测序验证COX-2-sgRNA表达载体构建成功。重组表达质粒和包装质粒共同转染到293T细胞,形成慢病毒颗粒,荧光法检测病毒滴度均在1×108以上。成功构建能稳定传代的Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞模型。HSC-T6-Cas9细胞中LV-Cas9-Puro mRNA相对表达量(541.93±105.76)高于CON组细胞(1.00±0.02),差异具有统计学意义(t=12.995,P<0.01)。通过Cruiser酶切检测及Western Blot试验,结果提示CRISPR/Cas9慢病毒表达载体能在靶点起作用,其中COX-2-sgRNA-2敲除作用最明显,并且COX-2蛋白表达水平较CON组和NC组相比显著下降(P值均<0.05),提示COX-2-sgRNA有活性。结论成功构建了针对COX-2靶基因的CRISPR/Cas9慢病毒载体,获得稳定的COX-2基因敲除的HSC-T6-COX-2-/-细胞。     

荷叶生物碱对THP-1单核细胞源性巨噬细胞泡沫化及B类Ⅰ型清道夫受体表达的影响

目的观察荷叶生物碱对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)所致人THP-1巨噬细胞泡沫化及B类Ⅰ型清道夫受体(SR-BⅠ)表达的影响,探讨荷叶生物碱抗动脉粥样硬化的可能机制。方法建立THP-1源性泡沫细胞模型后,采用不同剂量荷叶生物碱(0、25、50、100 mg/L)分组共孵育24 h。油红O染色观察细胞内脂质蓄积情况;分别用荧光定量PCR、Wesetern Blot检测细胞中SR-BⅠmRNA水平和蛋白水平。结果与空白对照组比较,ox-LDL对细胞内脂滴积聚呈浓度依赖性;且细胞SR-BⅠ的mRNA水平(分别为1.00±0.00、0.53±0.04、0.30±0.04和0.18±0.03)及蛋白表达(分别为1.00±0.00、0.62±0.10、0.39±0.08和0.22±0.05)呈浓度依赖性降低(P<0.01);加入荷叶生物碱干预后,细胞内脂滴随荷叶生物碱浓度的增加而减少,细胞SR-BⅠmRNA水平(分别为0.32±0.02、1.07±0.02、1.28±0.03和1.49±0.03)及蛋白表达(分别为0.28±0.03、1.06±0.02、1.32±0.03和1.41±0.02)浓度依赖性增加(P<0.01)。结论荷叶生物碱上调人THP-1单核细胞源性泡沫细胞SR-BⅠ的表达,促进细胞内胆固醇流出,可能是荷叶生物碱抗动脉粥样硬化的机制之一。     

慢病毒介导的CyPA基因沉默对非小细胞肺癌细胞生长的影响

目的 构建特异性沉默CyPA基因的慢病毒颗粒,体外观察其对非小细胞肺癌H1299细胞生长的影响. 方法根据已筛选的特异性沉默CyPA基因靶序列寡核苷酸,合成一对正义反义寡核苷酸DNA,采用基因克隆技术分别插入PGCL-GFP慢病毒载体,以脂质体法将重组PGCL-GFP与病毒包装载体pHelper1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,制备假包装病毒颗粒(Lv-shCyPA)并感染非小细胞肺癌H1299细胞,4 d后采用RT-PCR、Western-blot及MTT分别检测CyPA基因mRNA、蛋白表达水平及H1299细胞增殖状态.结果 构建的LV-shCyPA慢病毒颗粒感染H1299细胞,CyPA mRNA及蛋白表达显著下调,H1299细胞生长明显减缓,与未转染病毒、阴性对照病毒转染的H1299细胞比较有显著差异(P＜0.05).结论 成功构建了沉默CyPA基因慢病毒载体,其产生的假包装病毒颗粒能特异地沉默CyPA基因,抑制H1299细胞增殖,提示CyPA可能在非小细胞肺癌的发生发展中发挥一定的作用.     

慢病毒载体介导的结缔组织生长因子基因沉默对下游基因的影响

目的利用RNA干扰技术,以慢病毒为载体,介导结缔组织生长因子(CTGF)基因沉默,并观察其对下游基因表达的影响。方法用构建的CTGF小干扰RNA(siRNA)慢病毒转移质粒与包装质粒、包膜蛋白质粒共转染293T细胞,包装成介导CTGF基因沉默的慢病毒载体;感染肝星状细胞系HSC-T6,应用Real-time PCR和Western免疫印迹法筛选基因沉默效率最高的慢病毒载体;再根据绿色荧光蛋白(GFP)表达水平检测感染效率;应用Real-time PCR法检测CTGF基因沉默后HSC-T6中金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2和I型胶原mRNA表达水平。结果包装的慢病毒载体感染HSC-T6细胞的效率高于50%;感染HSC-T6细胞后,CTGF的表达在mRNA和蛋白水平均受到明显抑制,其中TS1具有最佳的抑制效率;HSC-T6细胞CTGF基因沉默后,其TIMP-1、TIMP-2和I型胶原mRNA水平也显著降低。结论包装的慢病毒载体在HSC-T6中具有较好的感染效率和CTGF基因沉默效果,基因沉默后可进一步抑制HSC-T6细胞TIMP-1、TIMP-2和I型胶原的基因表达,这在抗纤维化的研究中具有积极的意义。