诱导型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在舌癌细胞株中的表达

 【目的】探讨诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和血管内皮生长因子（VEGF）在舌鳞癌细胞株Tca8113中的表达,为进一步研究iNOS和VEGF在舌鳞癌肿瘤血管生成中的作用提供实验基础。【方法】采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法和SP免疫组化方法,对舌鳞癌细胞株Tca8113中iNOS和VEGF mRNA和蛋白表达情况进行检测。【结果】RT-PCR检测到舌鳞癌Tca8113细胞株中iNOS／VEGF mRNA条带明显,SP免疫组化检测到iNOS／VEGF蛋白在舌癌细胞胞浆中呈强阳性表达。【结论】iNOS／VEGF mRNA和蛋白在舌鳞癌Tca8113细胞株中呈高水平表达。     

诱导型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在舌癌细胞株中的表达

【目的】探讨诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和血管内皮生长因子（VEGF）在舌鳞癌细胞株Tca8113中的表达,为进一步研究iNOS和VEGF在舌鳞癌肿瘤血管生成中的作用提供实验基础。【方法】采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法和SP免疫组化方法,对舌鳞癌细胞株Tca8113中iNOS和VEGF mRNA和蛋白表达情况进行检测。【结果】RT-PCR检测到舌鳞癌Tca8113细胞株中iNOS／VEGF mRNA条带明显,SP免疫组化检测到iNOS／VEGF蛋白在舌癌细胞胞浆中呈强阳性表达。【结论】iNOS／VEGF mRNA和蛋白在舌鳞癌Tca8113细胞株中呈高水平表达。     

转人B7-H3基因鳞癌细胞株的建立及其检测

目的探讨转入B7-H3基因鳞癌细胞株的建立及其检测。方法采用脂质体介导法将已建好的真核表达质粒pEGFP-C1-B7-H3导入人鳞癌细胞Tca8113中（Tca8113/B7-H3）,RT-PCR检测B7-H3在该细胞中的表达,Western blot检测其蛋白的表达。经G418筛选后,用有限稀释法建立稳定高表达的带有B7-H3基因的Tca8113鳞癌细胞株。结果RT-PCR方法检测到目的基因B7-H3的一个215bp大小的cDNA扩增产物;DAB显色,裂解的Tca8113/B7-H3基因转染细胞膜蛋白中相对分子质量约65～86ku大小的特异性条带。转染B7-H3的Tca8113细胞,经过细胞传代培养后仍然能够检测到高表达的B7-H3基因,经过有限稀释法建立了Tca8113/B7-H3细胞株。结论成功建立了Tca8113/B7-H3细胞株,为以后的体内外试验提供了很好的平台,为近一步研究其抗肿瘤作用奠定了基础。     

转人B7-H3基因鳞癌细胞株的建立及其检测

目的探讨转入B7-H3基因鳞癌细胞株的建立及其检测。方法采用脂质体介导法将已建好的真核表达质粒pEGFP-C1-B7-H3导入人鳞癌细胞Tca8113中(Tca8113/B7-H3),RT-PCR检测B7-H3在该细胞中的表达,Western blot检测其蛋白的表达。经G418筛选后,用有限稀释法建立稳定高表达的带有B7-H3基因的Tca8113鳞癌细胞株。结果RT-PCR方法检测到目的基因B7-H3的一个215bp大小的cDNA扩增产物;DAB显色,裂解的Tca8113/B7-H3基因转染细胞膜蛋白中相对分子质量约65～86ku大小的特异性条带。转染B7-H3的Tca8113细胞,经过细胞传代培养后仍然能够检测到高表达的B7-H3基因,经过有限稀释法建立了Tca8113/B7-H3细胞株。结论成功建立了Tca8113/B7-H3细胞株,为以后的体内外试验提供了很好的平台,为近一步研究其抗肿瘤作用奠定了基础。     

CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及体外表达的研究

目的 构建钙网织蛋白/黑素瘤抗原基因-A3(CRT/MAGE-A3)双基因重组腺病毒载体,并进行体外表达研究.方法 从表达质粒pcDNA3/CRT中切取目的片段CRT,定向克隆至穿梭载体pShuttle-GFP-CMV.根据Genbank中提供的黑素瘤基因序列,设计并合成引物,以人肺癌组织cDNA文库为模板采用RT-PCR技术扩增人黑素瘤抗原基因-A3基因片段,测序后将黑素瘤抗原基因-A3基因片段定向克隆至穿梭载体,进而将穿梭载体克隆至Pac Ⅰ限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi.结果 目的 片段CRT转入穿梭载体后,酶切鉴定pShuttle-(△GFP)-CRT正确.人肺癌组织经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,测序证实为MAGE-A3 DNA后,克隆至穿梭载体pShutde-(△GFP)-CRT构建穿梭载体pShuttle-CRT-MAGE-A3,酶切鉴定证实构建正确.酶切穿梭载体将双基因片段克隆至腺病毒载体pAdxsi得到Ad-CRT/MAGE-A3病毒载体,酶切鉴定证实构建成功.转染293LP细胞并用Western blot检测到其体外表达.结论 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体并证实其能在体外有效表达CRT蛋白及MAGE-A3蛋白.     

真核表达质粒pBK-Fas的构建及转染舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑瘤效应

目的 研究Fas基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑制作用,构建Fas基因真核表达质粒pBK-Fas并将其转导入舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的Fas基因治疗提供实验基础.方法 采用RT-PCR反转录成cDNA扩增Fas基因全长,亚克隆到真核表达载体pBK-CMV内,构建出重组真核表达质粒pBK-Fas,酶切鉴定并测序.脂质体法将pBK-Fas转染入Tca8113细胞,RT-PCR检测Fas mRNA表达及半定量分析,琼脂糖凝胶电泳检测Fas转染细胞凋亡,流式细胞仪检测Fas蛋白表达.通过细胞生长曲线描记和软琼脂集落形成实验研究Fas基因的体外抑瘤效应.结果 PCR扩增后的产物在约1 008 bp处出现明显的特异性条带,重组质粒pBK-Fas经酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的Fas基因片段.经检测Fas基因转染能提高Fas mRNA 表达水平、Fas 蛋白表达强度,以及细胞凋亡指数.Fas基因转染能提高Fas蛋白的表达强度,由转染前的34.01±4.76上升到转染后的55.72±7.33,差异有统计学意义(P<0.01).Fas转染细胞株在Fas抗体作用下能够有效启动Fas介导的细胞凋亡途径.MTT法检测细胞增殖抑制率的结果显示PBK-Fas转染组 Tca8113细胞的增殖抑制作用最明显,表明Fas基因转染能增加舌鳞癌Tca8113细胞的增殖抑制率,结果与细胞生长曲线测定(计数法)结果具有一致性.软琼脂集落形成实验结果显示,与未转染细胞相比,重组质粒转染的Tca8113细胞群体倍增时间延长,克隆形成能力降低.结论 Fas基因片段被成功插入真核表达载体pBK-Fas质粒的多克隆位点.Fas基因转染能有效的抑制体外培养的舌鳞癌Tca8113细胞的生长.     

增强DNA聚合酶beta基因表达对人舌癌细胞生物学行为的影响

目的探讨DNA聚合酶beta（polβ）对人舌癌Tca8113细胞增殖和侵袭力的影响。方法运用野生型人polβ重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-polβ转染Tca8113细胞,分别用RT-PCR、Western blot检测polβ转录及蛋白表达水平;细胞生长实验检测舌癌细胞增殖的变化;Boyden室细胞侵袭实验检测舌癌细胞侵袭能力的变化。结果 pEGFP-C3-polβ转染Tca8113细胞获得稳定细胞株,与空白对照组及空载体组比较,polβmRNA及蛋白表达水平均明显增高,野生型polβ导入的舌癌细胞增殖和侵袭能力均明显减弱（P〈0.05）。结论 DNA polβ表达增强能够降低人舌癌细胞的增殖和侵袭能力。     

靶向舌癌Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子基因的siRNA表达载体构建及体外抑制作用

目的构建靶向舌癌Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的siRNA表达载体并在体外检测其对VEGF基因表达的抑制作用。方法设计合成靶向舌癌Tca8113细胞VEGF基因的siRNA cDNA序列并与Psilencer2.1-U6-neo连接,构建VEGF-siRNA表达载体（Pu-VEGF-siRNA）,酶切鉴定和测序确认后,经脂质体Lipofectamine2000转染入Tca8113细胞,以空载体组为实验对照组（Pu-HK）,未转染组为空白对照组。采用酶联免疫吸附（ELISA）和免疫组化方法检测染后Tca8113细胞VEGF蛋白表达差异。结果经过双酶切鉴定和测序分析,成功构建了靶向Tca8113细胞VEGF基因的siRNA表达载体。与实验对照组和空白对照相比较,转染Pu-VEGF-siRNA后Tca8113细胞的VEGF蛋白表达明显下降（P〈0.05）,但两对照组间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论成功构建了靶向舌癌Tca8113细胞VEGF基因的siRNA表达载体,且该载体在体外能有效抑制Tca8113细胞VEGF蛋白的表达。     

利用T7噬菌体展示技术构建人舌鳞癌细胞多肽文库

目的:本研究拟构建人舌鳞癌细胞株Tca8113的T7噬菌体展示多肽文库,为进一步筛选和鉴定与舌鳞癌相关的蛋白或多肽打下基础.方法:人舌癌细胞株Tca8113,QiaGen法提取细胞mRNA,逆转录合成双链cDNA后与T7Select 10-3载体连接,体外包装并扩增得到1-7噬菌体展示多肽文库.结果:构建了人舌鳞癌细胞株Tca8113的T7噬菌体展示多肽文库,原始文库重组滴度为鳞癌1.7×106 pfu,扩增后滴度为3×1010 pfu/mL.随机从文库中抽取10个克隆PCR扩增插入片断,电泳结果显示构建的文库中均有插入片段,文库插入率高达100%.所构建的文库插入片断大小在(0.4～1.0)kbp之间.结论:成功构建了人舌癌细胞株Tca8113的T7噬菌体展示多肽文库,为下一步筛选和鉴定与舌癌相关的蛋白或多肽奠定了基础.     

pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒的构建与蛋白表达

目的:通过基因重组方法构建pCMV-Myc-PIASxβ质粒,在真核细胞中高效表达重组蛋白并进行检测。方法:用SalⅠ和NotⅠ将PIASxβ片段从pGADT7载体中酶切后,利用DNA重组技术将其定向插入pCMV-Myc载体中。获得正确重组质粒后,瞬转CHO细胞系,用Western blotting检测Myc-PIASxβ重组融合蛋白表达。结果:经过酶切,片段回收,连接转化,获得重组质粒。重组pCMV-Myc-PIASxβ克隆通过酶切和测序鉴定其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASxβ为一条大小5 641 bp的条带;XbaⅠ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASXβ为2条大小分别为3 291和2 349 bp 的条带,符合预计大小。Western blotting检测证实,在相对分子质量68 000处（PIASxβ融合蛋白）有特异的蛋白表达条带,与重组质粒相符。结论：成功构建了pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒,为深入研究PIAS家族的功能奠定良好的基础。     

Iressa与顺铂联合抑制舌鳞癌细胞增殖的实验研究

【目的】探讨EGFR靶向治疗药物Iressa与顺铂联用对舌鳞癌细胞增殖的抑制作用。【方法】采用MTT的方法检测Iressa与顺铂联用对舌鳞癌细胞系Tscca和Tca8113抑制作用的效率。【结果】Iressa抑制Tscca和Tca8113细胞增殖的IC50值分别为18.03 μmol/L和29.98 μmol/L（P=0.002）;Iressa与顺铂联用加强了对舌鳞癌细胞系Tscca、Tca8113的增殖抑制,而且当Iressa提前24h或48h使用时,这种协同作用更加明显。【结论】Iressa可抑制舌鳞癌细胞系Tscca和Tca8113的增殖,与顺铂联用可协同抑制Tscca和Tca8113的增殖,这种抑制作用具有浓度和顺序依赖性。     

小鼠CD1d1编码区基因的克隆与鉴定

目的:克隆小鼠CD1d1编码区基因。方法:提取小鼠小肠组织总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠CD1d1编码基因,PCR产物连接pGEM-T载体,转化大肠杆菌,用限制性酶切和DNA序列测定对阳性克隆进行鉴定。结果:扩增出一条与预期片段大小相符的特异DNA条带,限制性酶切应显示目的基因片段插入T载体,序列测定表明所获取的基因大小为1011bp。结论:成功克隆了小鼠CD1d1编码基因,为进一步重组蛋白及其抗体的制备奠定了基础。     

新疆紫草素对肿瘤细胞生长抑制作用的研究

目的：探讨新疆紫草案对小鼠胶质瘤细胞C6、人舌鳞癌细胞Tca—8113和人宫颈癌细胞HeLa细胞的体外生长抑制作用。方法：显微镜观察经新疆紫草案作用后细胞形态的变化；应用MTT法和平板克隆形成法检测新疆紫草案对小鼠胶质瘤细胞C6、人舌鳞癌细胞Tca—8113和人宫颈癌细胞HeLa的生长抑制作用。结果：新疆紫草案对C6、Tca—8113和HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用。但作用方式不同，对C6和Tca—8113主要以作用于细胞质为主，细胞以坏死为主，而对于HeLa细胞则主要作用于细胞核，引起细胞的凋亡。结论：本研究表明，在体外实验中，新疆紫草案对小鼠胶质瘤细胞C6、人舌鳞癌细胞Tca—8113和人官颈癌细胞HeLa细胞3种不同类型的肿瘤细胞均具有明显的杀伤和抑制作用，表现出剂量一效应关系。待进一步研究后，作为抗肿瘤药物可以应用于临床。     

Iressa与顺铂联合抑制舌鳞癌细胞增殖的实验研究

 【目的】探讨EGFR靶向治疗药物Iressa与顺铂联用对舌鳞癌细胞增殖的抑制作用。【方法】采用MTT的方法检测Iressa与顺铂联用对舌鳞癌细胞系Tscca和Tca8113抑制作用的效率。【结果】Iressa抑制Tscca和Tca8113细胞增殖的IC50值分别为18.03 μmol/L和29.98 μmol/L(P=0.002);Iressa与顺铂联用加强了对舌鳞癌细胞系Tscca、Tca8113的增殖抑制,而且当Iressa提前24h或48h使用时,这种协同作用更加明显。【结论】Iressa可抑制舌鳞癌细胞系Tscca和Tca8113的增殖,与顺铂联用可协同抑制Tscca和Tca8113的增殖,这种抑制作用具有浓度和顺序依赖性。     

异土木香内酯对人舌鳞癌Tca8113细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

目的 研究异土木香内酯对舌鳞癌细胞Tca8113的增殖、迁移和侵袭能力的影响.方法 用CCK-8法检测异土木香内酯作用于舌鳞癌Tca8113细胞的半数抑制浓度(IC50),EDU实验方法检测异土木香内酯抑制Tca8113细胞增值能力.检测土木香内酯对Tca8113细胞凋亡影响实验.Western Blot检测异土木香内酯对Tca8113细胞凋亡蛋白表达的影响.结果 实验结果表明,异土木香内酯作用于舌鳞癌Tca8113细胞的半数抑制浓度(IC50)为20μM,20μM异土木香内酯可以抑制舌鳞癌Tca8113细胞活性(P<0.01),细胞增值能力(P<0.01);进一步结果表明,异土木香内酯还可以抑制对Tca8113 P迁移,同时降低Tca8113细胞侵袭能力(P<0.01);促进Tca8113细胞凋亡的影响(P<0.01).Western Blot实验结果表明,异土木香内酯可以下调舌癌Tca8113细胞的Bcl-2蛋白,上调caspase3蛋白的表达.结论 实验结果表明异土木香内酯对舌癌Tca8113细胞有抑制作用.     

三氧化二砷体外诱导口腔鳞癌细胞凋亡的研究

目的 探讨三氧化二砷（As2O3)对口腔鳞癌细胞的体外生物学作用及机制。方法 采用形态学、MTT、克隆形成试验、DNA梯度降解试验、原位末端标记及流式细胞仪等方法，对As2O3在Tca8113细胞系中的作用进行体外研究。结果 As2O3对Tca8113细胞产生明显的生长抑制作用，MTT显示生长抑制率为76.3%。DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪显示As2O3诱导了Tca8113细胞凋亡。流式细胞仪显示As2O3的Tca8113细胞凋亡与细胞周期阻滞有关。结论 As2O3对口腔鳞癌细胞具有显著的体外生长抑制及凋亡诱导作用。     

舌鳞癌细胞对Iressa的敏感性及其表皮生长因子受体突变

目的研究中国人舌鳞癌细胞系对表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂Iressa的敏感性及其EGFR突变,初步探讨Iressa在头颈鳞癌治疗中的价值。方法以中国人舌鳞癌细胞系Tscca和Tca8113为研究对象,采用MTT法检测Iressa对其增殖的抑制作用;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;对Tscca和Tca8113进行EGFR外显子18～21测序。结果 Iressa对Tscca、Tca8113均有显著的增殖抑制作用,呈剂量依赖性。细胞周期分析显示,较低浓度Iressa(18.2μmol/L和36.4μmol/L)可使Tscca和Tca8113细胞G0/G1期比例增高;流式细胞仪分析显示高浓度Iressa可诱导Tscca和Tca8113细胞凋亡。测序发现Tscca和Tca8113的EGFR外显子20存在同一静止突变,即2361G-A,Q787Q。结论 Iressa可抑制Tscca和Tca8113的增殖,呈剂量依赖性;较低浓度时诱导细胞周期G0/G1期比例增高,高浓度时诱导凋亡,其抑制作用与EGFR突变未见相关性。     

VES诱导口腔鳞癌Tca8113细胞凋亡的实验研究

目的 明确VES对口腔鳞癌细胞Tca8113的作用,为临床应用VES防治口腔鳞癌提供科学的实验数据.方法 RT-PCR法检测促凋亡基因bax在Mrna水平上的表达,Western blot检测促凋亡基因bax在蛋白水平上的表达.结果 bax基因在Mrna水平上及蛋白水平上表达上调.结论 VES诱导口腔鳞癌细胞Tca8113的凋亡作用,bax基因可能参与该过程.     

丙型肝炎病毒C,E2,NS3区基因嵌合重组载体的构建

【目的】构建包含丙型肝炎病毒（HCV）C区、E2区及NS3区的嵌合重组载体。【方法】设计合成3对寡核苷酸引物,用PCR法从HCV重组质粒pHCVc、pBE2和pGMXNS3-5中特异扩增出编码HCVC区、E2区和NS3区抗原的部分基因片段（501、603和900bp）,分别用HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后,逐个定向连接到质粒pcDNA3中,转化宿主菌XL1-Blue,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。【结果】酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符,测序结果与文献报道序列及预计结果一致,证实符合表达框架。【结论】成功构建了HCV嵌合重组质粒pcDNA3-C-E2-NS3。     

JSH-23对人舌鳞癌细胞Tca8113增殖和凋亡的影响

目的 探讨JSH-23阻断NF-κB信号通路后人舌鳞癌细胞Tca8113增殖和凋亡的情况及NF-κB信号通路相关凋亡抑制基因Bcl-2的表达变化,进而为临床舌鳞癌的干预和治疗寻找新的药物提供实验依据.方法 采用体外培养人舌癌Tca8113细胞的方法,经不同浓度JSH-23作用不同时间后,用MTT法、RT-PCR及Western blot等方法检测JSH-23对Tca8113细胞增殖、凋亡的影响.采用SPSS13.0统计软件对数据进行方差分析及t检验.结果 Tca8113细胞经JSH-23作用后,增殖受到明显抑制,20 μmol/L JSH-23作用48 h时,抑制作用最为显著,细胞生长抑制率达到60.45％.同时,Bcl-2凋亡抑制基因表达减少,与对照组相比,JSH-23作用48 h后,Bcl-2表达显著减少47.85％,差异有统计学意义（P＜0.05）;Bcl-2蛋白含量也明显减少,作用48 h后,Bcl-2蛋白表达相对光密度值分别下降50.93％ （P ＜0.01）.结论 JSH-23作为NF-κB信号通路抑制剂,可以明显抑制人舌鳞癌细胞的增殖,同时显著下调Bcl-2基因及蛋白的表达.