多重聚合酶链反应检测革兰阳性／阴性细菌、真菌和mecA基因的临床评价

目的：评价多重聚合酶链反应（PCR）直接检测革兰阳性／阴性细菌、真菌和耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的可靠性和准确性。方法：采用细菌16rRNA基因通用引物、革兰阴性细菌特异引物、全真菌通用引物和mecA基因特异引物，通过多重PCR对271份临床无菌性体液扩增检测革兰阳性／阴性细菌、真菌和MRS，同时对这些标本进行细菌、真菌培养和甲氧西林对葡萄球菌MIC测定。结果：多重PCR诊断无菌性体液体革兰阳性／阴性细菌、真菌和MRS感染的特异性、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值和诊断效率分别为98.5％、97.0％、97.0％、99.0％、98.2％、99.1％、95.9％、95.9％、99.1％、98.5％、99.6％、100％、83.3％、100％、99.6％、100％、48.0％、100％、61.8％、71.7％。结论：多重PCR直接检测无菌性体液中革兰阳性／阴性细菌、真菌和mecA基因所致的MRS具有敏感、快速、特异、准确的优点，是一种可靠的实验诊断手段，但不能代替培养法。     

血液细菌16S rRNA基因检测的诊断价值

目的探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法用PCR技术扩增实验室保留株10株的16SrRNA基因,以乙型肝炎病毒-DNA、白假丝酵母菌和人类基因组DNA为对照,检测该方法的特异性;采用10倍比稀释法进行该方法的灵敏度检测。结果对所测细菌株均获得475bp扩增产物,而与乙型肝炎病毒-DNA、白假丝酵母菌和人基因组DNA无交叉反应;PCR最低能检测1.5×104/L大肠埃希氏菌。结论16SrRN基因PCR检测细菌感染的方法具有特异性、快速性和敏感性高等特点。     

多重聚合酶链反应检测革兰阴性杆菌中质粒介导ampC基因

目的运用多重聚合酶链反应（PCR）检测革兰阴性杆菌的质粒ampC基因,了解该基因在我院的流行情况。方法采用头孢西丁初筛试验筛选出符合头孢菌素酶（AmpC）表型筛选条件的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌共50株,通过热裂解法进行DNA抽提,采用6组ampC特异引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳区分PCR产物,进一步DNA测序确定其基因型。结果50株试验菌中有8株为阳性,分别为肺炎克雷伯菌5株,大肠埃希菌3株,基因型为CIT型1株,DHA型4株,EBC型3株。结论我院质粒介导ampC基因型主要为DHA型、EBC型和CIT型。多重PCR是特异性高、简便检测质粒ampC基因型的分子生物学方法。     

多重聚合酶链反应检测革兰阴性杆菌中质粒介导ampC基因

目的运用多重聚合酶链反应(PCR)检测革兰阴性杆菌的质粒ampC基因,了解该基因在我院的流行情况。方法采用头孢西丁初筛试验筛选出符合头孢菌素酶(AmpC)表型筛选条件的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌共50株,通过热裂解法进行DNA抽提,采用6组ampC特异引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳区分PCR产物,进一步DNA测序确定其基因型。结果50株试验菌中有8株为阳性,分别为肺炎克雷伯菌5株,大肠埃希菌3株,基因型为CIT型1株,DHA型4株,EBC型3株。结论我院质粒介导ampC基因型主要为DHA型、EBC型和CIT型。多重PCR是特异性高、简便检测质粒ampC基因型的分子生物学方法。     

巢式聚合酶链反应检测粪便幽门螺杆菌23S rRNA基因突变及其评价

幽门螺杆菌(Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡的重要致病因子,与胃黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤、胃癌的发生密切相关;含克拉霉素的三联疗法是根除Hp最主要、最常用的治疗方案;克拉霉素的耐药产生是根除治疗失败的主要原因[1].     

机采血小板细菌16s rRNA基因检测的临床研究

目的 探讨快速、可靠的检测机采血小板(PLT)细菌污染的新方法.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增1 308份献血员机采PLT 16s rRNA基因,以乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸(HBV DNA)、白假丝酵母菌和人类基因组DNA为对照,检测该方法的特异性;采用10倍倍比稀释法进行该方法的敏感性检测.结果 检测1308份献血员机采PLT,其中7份16s rRNA基因为阳性,阳性率为0.54%(7/1 308).而与HBV DNA、白假丝酵母菌和人基因组DNA无交叉反应;PCR最低能检测1.5 × 10~4cfu/L大肠埃希菌.结论 献血员机采PLT板细菌污染的阳性率为0.54%;利用PCR检测献血员机采PLT细菌16s rRNA基因的方法具有特异性、快速性和敏感性高等特点.     

聚合酶链反应检测肿瘤细胞P16基因缺失及其临床意义

目的：探讨P16基因缺失与肿瘤的关系。方法：用聚合酶链反应（PCR）技术，检测56例肝癌、25例白血病患的P16基因缺失情况。结果：56例肝癌患中有13例P16基因缺失，25例白血病患中有8例P16基因缺失，缺失率分别为23.2%、32.0%。结论：P16基因缺失与肿瘤的发生密切相关，检测P16基因缺失有助于肿瘤的辅助诊断。     

聚合酶链反应检测献血者乙肝病毒基因

聚合酶链反应检测献血者乙肝病毒基因沈迎枫（江苏省血液中心，南京２１００４２）关键词献血员，聚合酶链反应，乙肝病毒基因目前不少城市血站仍主要采用ＥＩＡ检测ＨＢｓＡｇ和抗－ＨＢｃ来筛选献血者。我们用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对５１例已采用ＥＩＡ检测ＨＢｓＡｇ...     

聚合酶链反应检测稳定L型结核分枝杆菌

目的探讨聚合酶链反应(PCR)在结核分枝杆菌稳定L型检测的应用价值.方法采用结核分枝杆菌染色体基因重复保守序列为引物的PCR诊断试剂检测非高渗培养的结核分枝杆菌稳定L型纯培养物的染色体DNA.结果结核分枝杆菌稳定L型的染色体DNA经PCR扩增后电泳可见2条DNA带,其中1条主带与其亲代细菌型一致,另1条为相对分子质量较小的次带.结论结核分枝杆菌稳定L型仍保留了与细菌型染色体PCR引物反应的特异性序列和出现1条相对小分子质量的带,但仍然可用结核分枝杆菌PCR对其进行特异性检测与鉴定.     

应用16S rRNA宽范围聚合酶链反应快速检测临床无菌体液感染

目的应用16S rRNA宽范围聚合酶链反应（PCR）快速检测临床无菌体液感染,并与传统培养方法进行比较分析。方法收集94份临床无菌体液（血液、脑脊液、胸腹水、关节液）标本,提取细菌基因组DNA,应用16S rRNA宽范围PCR扩增,并将PCR阳性产物测序,然后将测序结果在美国国家生物技术信息中心（NCBI）上进行BLAST比对,从而确定菌种。同时,应用常规培养方法检测94份无菌体液标本,并对2种方法的结果进行比较。结果 16S rRNA宽范围PCR敏感性高,最低扩增浓度为103 CFU/mL,且该技术特异性高,其阳性扩增产物经测序比对后结果和培养结果完全吻合。另外,94例临床标本中应用培养方法培养出阳性例数为9例,阳性率为9.6%,而应用宽范围PCR,除培养阳性的9例均为阳性外,另外扩增出6例阳性标本,阳性率为15.9%,而此6例经测序证实分别为4株铜绿假单胞菌、1株黏质沙雷菌、1株肺炎链球菌。结论 16S rRNA宽范围PCR与培养技术比较起来,敏感性高,特异性强,有望成为临床无菌体液病原体感染快速筛查的方法。     

重复序列片段基因扩增用于阴沟肠杆菌的分型研究

目的 用重复序列片段基因扩增方法对阴沟肠杆菌进行分型研究。方法 选用肠杆菌科基因间的重复序列(ERIC)进行扩增,对阴沟肠杆菌进行分型研究,并与其抗生素耐药特征进行比较。结果 阴沟肠杆菌分成6种不同基因型,不同基因型有不同的耐药特征。结论 本法简便易行,重复性好,适合于临床分离的病原菌的分型及医院感染的分子流行病学研究。     

实时荧光聚合酶链反应检测空肠弯曲菌

目的探索一种快速、敏感、特异的空肠弯曲菌检验方法。方法根据GenBank公布的空肠弯曲菌基因序列,在其保守区域设计特异性引物与探针以建立基于TaqM an探针的实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行研究。结果该方法对空肠弯曲菌可产生特异扩增信号,对其他非空肠弯曲菌菌属无响应,其检测敏感性可达10 cfu/mL。反应体系具有很高的稳定性。结论实时荧光PCR可快速、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌,具有较强的实际应用价值。     

一步法RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的：建立一步法RT—PCR检测APL患者PML—RARα融合基因的实验方法。方法：用特异引物一步法RT—PCR检测PML—RARα融合基因,并作灵敏度试验。结果：本方法的灵敏度可达到1：10^3水平。对25例APL患者检测PML—RARα融合基因,阳性率为100％,并可检测出PML—RARα融合基因各种融合方式。结论：一步法RT—PCR检测PML—RARα融合基因有很好的灵敏度和特异性,操作简便、快速,特别适用于临床检测。     

16S～23SrDNA内转录间隔区序列聚合酶链技术鉴定凝固酶阴性葡萄球菌

目的采用分子生物学技术鉴定凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)。方法用16S-23SrDNA内转录间隔区序列PcR(ITS-PCR)技术，对6株质控菌和171株已通过AutoScan-4微生物分析仪鉴定过的CNS临床分离株进行分型鉴定。结果质控菌株及经APIStaph系统确证的11种CNS得到各自不同的ITS-PCR电泳类型，建立了该技术在本实验室的CNS初级数据库，包括表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、华纳葡萄球菌、头部葡萄球菌、孔氏葡萄球菌解脲亚种、松鼠葡萄球菌、耳葡萄球菌和模仿葡萄球菌。只有松鼠葡萄球菌表现了多态性。该ITS-PCR数据库对所研究的临床株的识别率为93．57％(160／171)，准确率达93．75％(150／160)。API Staph系统证明，ITS-PCR法鉴定结果较为准确，AutoScan-4微生物分析仪检测CNS至少有9．36％(16／171)是不确切的。结论ITS-PCR证明是一项有价值，对CNS可选用的简便、快速、可靠，廉价的分子生物学鉴定技术。     

Detection ofPlasmodium ovalemalaria parasites by species-specific 18S rRNA gene amplification

A polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for the specific detection ofPlasmodium ovale, one of the four malaria parasites that infect humans. On the basis of sequence variation of thePlasmodium18S ribosomal RNA (rRNA) gene, oligonucleotide primers for PCR were designed to amplify various fragments of theP. ovalegene. Using a recombinant plasmid with the completeP. ovale18S rRNA gene as target, 59 primer combinations were tested so that at least one of the pairs was species-specific while the other primer was either genus conserved orP. ovalespecies-specific. Three primer pairs yielding DNA fragments at stringent conditions were further tested against genomic DNA of four human malaria species. This approach yieldedP. ovalespecies-specific primer pairs that may be useful for further field testing.     

基于16S rRNA的聚合酶链反应技术用于肺部感染患者痰标本中军团菌的检测

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)方法,检测肺部感染患者痰液中军团菌属特异性16S rRNA基因。方法利用军团菌属特异性16S rRNA基因保守序列设计引物和探针,优化反应条件和反应体系,对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他病原菌标准菌株进行检测,验证该方法的特异性和敏感性。对150例肺部感染患者痰液标本进行检测,阳性者对基因扩增产物测序作验证试验。结果该方法检测军团菌属所有标准菌株均出现阳性信号,其他非军团菌属检测结果均为阴性,灵敏度为10 cfu/ml。150例肺部感染患者的痰液标本,经荧光定量PCR法检出军团菌阳性27例,阳性率为18.0%(27/150),经16S rRNA基因测序验证,阳性率为15.0%(22/150),经χ2检验二者差异无统计学意义(χ2=3.2,P﹥0.05),表明其较好的符合性和等效性。结论 realtime PCR法检测患者痰液标本中军团菌,具有快速、敏感、特异等特点,适用于临床军团菌感染调查及快速检测。     

比较重复序列PCR与多位点序列分型技术用于光滑假丝酵母菌的基因分型检测

目的 评价REP-PCR基因分型技术在临床光滑假丝酵母菌株分型中的应用价值。方法收集2009-2010年上海瑞金医院、上海仁济医院、上海华山医院、安徽医科大学附属医院、深圳人民医院38株光滑假丝酵母菌。采用MLST法扩增光滑假丝酵母菌的6个管家基因内片段,扩增片段测序后与数据库数据比对得出等位基因谱,从而得到相应的序列型（sequence type,ST）。采用REP-PCR法设计Ca21、Ca22、Com21引物扩增38株光滑假丝酵母菌重复序列,通过电泳比较分析,获得REP-PCR型。比较两种分型方法的结果和效率。结果 以Ca22-Com21为引物的REP-PCR分型效果最好。REP-PCR和MLST分型结果相同,38株光滑假丝酵母菌共产生5种REP-PCR型,分别为A、B、C、D、E型,对应于MLST的ST7、ST3、ST19、ST45和新型。REP-PCR比MLST耗时短。结论REP-PCR方法简单快速,且分辨率与MLST技术相同,可作为实验室大量菌株分型的首选方法。