携带增强型绿色荧光蛋白基因的shRNA真核表达载体的构建

目的：构建携带EGFP的shRNA真核表达载体。 方法: 应用PCR的方法从pBSK/U6质粒上扩增出U6启动子及其下游的Xbal、SalI和BamHI酶切位点，并增加NotI位点。将扩增的产物连入pEGFP-C1载体MluI位点处，构建成携带EGFP的siRNA真核表达载体。应用该载体介导针对EGFP的短发夹环RNA（pEGFP/U6/EGFP），转染U251细胞，通过荧光显微镜和流式细胞仪检测EGFP的表达，验证所构建载体在细胞内产生RNA干扰的效果。 结果: 与对照组比较pEGFP/U6/EGFP在细胞内对EGFP的抑制效果达89.8%。 结论: 成功构建携带EGFP的shRNA真核表达载体。     

增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达

目的构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与轮状病毒（RV）VP6基因融合表达载体,研究融合蛋白表达及在细胞中的分布。方法提取A组人RVTB-Chen株VP6基因,用PCR扩增VP6编码cDNA片段。将此基因片段与真核表达载体pEGFP-C1携带的EGFP融合;运用脂质体的方法,将获得的重组质粒转染到MA104细胞中,在荧光显微镜下观察蛋白的表达及其在细胞中的分布情况。结果成功构建了融合表达质粒;转染细胞后,融合蛋白可在MA104细胞中表达且主要分布在胞质中。结论RVVP6可与EGFP融合表达,融合蛋白在细胞质中呈均匀的分布,与RV感染细胞中合成的VP6蛋白的分布有较大的差别。     

重组质粒pEGFP-C1-STAT6的构建及在HeLa细胞中表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)为报告基因的重组质粒pEGFP-C1-STAT6,观察其在HeLa细胞中的表达.方法 以重组质粒pCLNEO-STAT6为模板,PCR法扩增出目的 基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP-C1上,构建重组质粒pEGFP-C1-STAT6,脂质体法转染HeLa细胞,Western 印迹检测融合蛋白的表达,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的定位和分布.结果 成功构建质粒pEGFP-C1-STAT6,并在HeLa细胞中实现表达;Western 印迹检测到融合蛋白EGFP-STAT6;在荧光显微镜下观察到绿色的融合蛋白表达和定位.结论 重组质粒pEGFP-C1-STAT6构建成功,可用于标记STAT6蛋白,为进一步研究STAT6在信号转导中的作用机制奠定基础.     

AngRem104基因与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-1细胞中的表达定位

构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒AngRem104-pEGFP-N1，利用脂质体转染体外培养的COS-1细胞，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察AngRem104-EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位，用RT-PCR和Western blot方法验证其mRNA和蛋白的表达。结果表明在空载体pEGFP-N1转染组中，COS-1细胞内绿色荧光呈弥散分布；重组质粒AngRem104-pEGFP-N1转染组中，绿色荧光集中在细胞核中，随着表达量的增高，绿色荧光在细胞核中聚集成团块状，颗粒状，RT-PCR的结果表明AngRem104在重组质粒转染组中的表达明显高于空载体和空白对照组。Western blot的结果也确证了AngRem104-EGFP融合蛋白的表达。提示新基因AngRem104/pEGFP融合基因真核表达载体在真核细胞COS-1中获得了表达，细胞所表达的融合蛋白具有An-gRem104和EGFP的双重活性，可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位，为基因功能研究提供了线索。     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

EBF3与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:构建早期B细胞因子3(EBF3)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 使EBF3-EGFP融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达.方法:采用RT-PCR技术, 从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3全长编码基因, 构建EBF3与EGFP的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 用脂质体转染技术将pEGFP/EBF3导入HepG2, 使EBF3-EGFP融合蛋白得到表达.结果:经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实, EBF3基因已正确插入pEGFP-N1中EGFP基因的上游, 获得融合基因表达载体pEGFP/EBF3.将pEGFP/EBF3导入HepG2细胞24 h后, 在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内, 转染pEGFP/EBF3和pEGFP-N1后48 h的转染效率分别为52%和59%.Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24 h和48 h细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87 000的EBF3-EGFP融合蛋白, 转染pEGFP/EBF3后48 h和72 h, S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组和未转染细胞组, 表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展, 从而促进细胞增殖.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP/EBF3, 并在HepG2细胞中进行了表达, 为进一步研究EBF3的功能提供实验基础.     

pEGFP—VEGF165重组质粒的构建及在血管内皮细胞中的表达

采用PCR技术,从原核表达质粒PUC19-VEGF165中获得上下游含有HindⅢ和BamH I酶切位点的目的基因VEGF165,与真核载体pEGFP-C1构建重组质粒pEGFP-VEGF165,观察其在内皮细胞中的表达。结果表明,带有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-VEGF165构建成功,并在PEI的介导下成功转染脐静脉内皮细胞（HUVEC）,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白表达,ELISA检测证明VEGF在细胞上清中有效表达,RT—PCR证明了VEGF165mRNA水平上的有效表达。此研究结果将为再狭窄的基因治疗提供实验基础。     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

SEDL基因及其突变体真核表达载体的构建与鉴定

目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。     

重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白荧光质粒在软骨细胞的表达

背景：白细胞介素1受体拮抗蛋白能延缓骨性关节炎进程,通过转基因方法可以使白细胞介素1受体拮抗蛋白表达的增加。 目的：观察重组人重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况。 方法：双酶切法切取重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白的c-DNA片段,通过T4DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上。体外分离培养兔关节软骨细胞,然后用构建的重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白质粒经脂质体转染软骨细胞,通过荧光显微镜观察转基因的表达和荧光定量PCR检测其表达。 结果与结论：获得重组人pEGFP-C1-IL-1Ra真核表达载体质粒,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确。荧光显微镜观察有绿色荧光蛋白表达,荧光定量PCR鉴定证实转染的软骨细胞基因得到表达。     

人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165)的真核表达载体，并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法：利用基因克隆技术，将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用BamHI和XhoI双酶切后，再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞，然后以G418筛选阳性克隆。用免疫细胞化学鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组体中已插入目的基因片段VEGF165，免疫细胞化学证实，重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达。结论：成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165。并在骨髓基质细胞中得到表达，为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据。     

动脉内皮细胞中TIE2启动CREG真核表达质粒pTIE2-CREG-EGFP-N1的表达

背景：血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提。 目的：构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2启动子来启动表达的E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)融合的真核表达质粒。 方法：根据GenBank中公布的TIE2基因的启动子序列,人工合成TIE2启动子DNA序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1中构建pTIE2-EGFP-N1。同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ 双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定。应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。 结果与结论：经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1质粒正确;体外转染48 h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL的构建及鉴定

背景：FasL通过与靶细胞上Fas结合诱导程序性细胞死亡,可维持机体内稳态,诱导同种异基因移植免疫耐受,促进肿瘤细胞凋亡。 目的：构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因hFasL的真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL。 方法：通过实时聚合酶链反应RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增出hFasL基因,与真核空载体 plRES2-EGFP一起,经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接,从而构建pIRES2-EGFP-hFasL。用紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度,经酶切、PCR技术、基因测序等方法进行鉴定。 结果与结论：扩增出的hFasL条带大小约846 bp,构建的plRES2-EGFP-hFasL经酶切后在846 bp和2 000 bp处有特异性条带,DNA测序证实hFasL与Genebank上的序列完全一致。提示成功构建了含有hFasL及EGFP的真核表达载体plRES2-EGFP-hFasL。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体真核表达载体的构建及表达

背景：单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1真核表达载体的构建可以为研究单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1在病毒潜伏复发中的功能奠定基础。 目的：构建含存单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1的真核表达载体,并通过转染非洲绿猴肾细胞(Vero),验证载体的体外表达情况。 方法：根据单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1基因序列设计一对引物,以单纯疱疹病毒Ⅱ型 333标准株基因组为模板PCR法扩增出开放读码框1基因,克隆至真核表达载体上,并进行酶切鉴定以及测序;利用X-fect转染试剂盒将重组质粒pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1转染vero细胞,RT-PCR检测其mRNA水平的表达,并用荧光倒置显微镜观察融合蛋白的表达。 结果与结论：开放读码框1基因的体外扩增目的片段为741 bp,所构建的真核表达载体pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1经双酶切鉴定,与预期大小一致,测序结果与NCBI收录的开放读码框1基因序列一致;重组质粒pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1转染vero细胞后,RT-PCR 验证有目的基因的转录,荧光显微镜观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达。表明成功构建pEGFP-C2/潜伏相关转录体开放读码框1真核表达载体,并且实现其在非洲绿猴肾细胞(Vero)中的表达。     

重组小鼠质粒pEGFP-NGB的构建和在培养神经胶质细胞中表达的实验研究

目的：构建重组小鼠质粒pEGFP-NGB并研究其在培养神经胶质细胞中的表达。方法：采用RT-PCR从小鼠脑组织总RNA中扩增出该基因的全序列cDNA,并克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-NGB表达载体。采用GeneJamer转染试剂和pEGFP-NGB重组子混合后转染至培养神经胶质细胞中,观察NGB在培养神经胶质细胞中mRNA以及蛋白表达。结果：阳性克隆测序结果显示所测序列与Genbank序列一致。RT-PCR和Western-blot结果表明转染重组质粒pEGFP-NGB培养神经胶质细胞NGB mRNA和蛋白均有较高的表达。荧光显微镜下观察发现, 培养神经胶质细胞中有较多绿色荧光蛋白表达。结论：(1)成功构建pEGFP- NGB重组子;(2)构建的pEGFP-NGB重组子可在培养神经胶质细胞中表达。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-Axin的构建及其在神经胶质瘤细胞内的表达

目的:构建真核表达载体pIRES2EGFPAxin,并在神经胶质瘤细胞系C6中进行表达。方法:用PCR的方法扩增Axin基因,构建真核表达载体pIRES2EGFPAxin,经NheI及SalI双酶切鉴定并测序。通过脂质体法转染C6细胞,用荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,用免疫组化染色的方法检测细胞中Axin的表达。结果:构建了真核表达载体pIRES2EGFPAxin,用脂质体法转染神经胶质瘤细胞C6后,经荧光显微镜和免疫组化染色法检测,可见细胞内有EGFP及Axin的表达。结论:成功地构建真核表达载体pIRES2EGFPAxin,并在神经胶质瘤细胞C6中表达,为研究Axin对肿瘤的生物学作用以及Axin在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础。     

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,相关系数大于0.9972,方法检出限为0.041mg/L,相对标准偏差小于1.0%,加标回收率为82%～109%。本法操作简单,灵敏度较高,线性范围宽,不失为一种较好的测定方法。0牙膏工业Toothpas虻恼婧吮泶镌靥逯?构建重组质粒pEGFP-NGB表达载体。采用GeneJamer转染试剂和pEGFP-NGB重组子混合后转染至培养神经胶质细胞中,观察NGB在培养神经胶质细胞中mRNA以及蛋白表达。结果:阳性克隆测序结果显示所测序列与Genbank序列一致。RT-PCR和Western-blot结果表明转染重组质粒pEGFP-NGB培养神经胶质细胞NGBmRNA和蛋白均有较高的表达。荧光显微镜下观察发现,培养神经胶质细胞中有较多绿色荧光蛋白表达。结论:(1)成功构建pEGFP-NGB重组子;(2)构建的pEGFP-NGB重组子可在培养神经胶质细胞中表达。     

MAGE-3基因稳定转染的HHCC细胞系的建立及其mRNA的表达

目的：构建肿瘤抗原MAGE-3基因的真核表达载体，建立MAGE-3基因稳定转染的人肝细胞癌细胞系（human hepatocellular carcinoma cell line，HHCC）。方法：利用分子生物学方法，构建带有MAGE-3基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-3，经脂质体法转染HHCC后，用G418筛选阳性克隆。在荧光显微镜下观察HHCC中EGFP的表达，用RT-PCR法检测HHCC中MAGE-3 mRNA的表达。结果：成功地构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-3。以其转染HHCC后，经荧光显微镜及RT-PCR分别检测到MAGE-3 mRNA转录和EGFP的表达。结论：建立了1株可稳定转染MAGE-3基因的肝细胞癌HHCC，为进一步应用该基因进行肝癌的免疫治疗提供了实验依据。     

VEGF真核表达载体的构建及在内皮与心肌细胞内的表达

目的：探讨外源性人VEGF165基因在内皮细胞与心肌细胞内表达的可行性。方法：构建了(vaseular endothelium growth factor,VEGF)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因其表达载体pIRES2—FGFP—VEGF165，以脂质体法转染内皮细胞和心肌细胞，采用荧光显做镜检测内皮细胞与心肌细胞中EGFP的表达，同时利用免疫组织化学方法检测VEGF的表达。结果：成功地构建了真核表达载体pIRES2—EGFP—hVEGF165，采用脂质体法转染内皮细胞与心肌细胞后，经荧光显微镜观察，可见细胞内有EGFP的表达，同时经免疫组化证实有VEGF的表达。结论：采用脂质体法可以成功地将外源性VEGF165基因转染到内皮细胞与心肌细胞中，并进行表达。本研究为今后利用VEGF基因治疗心肌缺血等疾病提供了实验基础。