大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表达质粒的构建及表达

目的构建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞COS-7中的有效表达。方法以含有p55全长基因的质粒为模板,通过PCR扩增p55基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经酶切后再将p55基因重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入COS-7细胞,RT-PCR检测其基因转录情况,SDS-PAGE鉴定其表达相应的目的蛋白质情况。结果成功扩增了p55基因片段,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDS-PAGE方法证实该片段能在COS-7细胞中有效表达目的蛋白质。结论成功构建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究奠定了基础。     

APP基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的 构建淀粉样前体蛋白(APP)基因真核表达载体,转染SH-SY5Y细胞,建立稳定转染细胞系.方法 从质粒pcDNAs-APP中经PCR扩增出APP基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染SH-SY5Y细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,通过印迹法(Western blot)检测APP的表达. 结果 pcDNA3.1(+)-APP重组体经PCR扩增后片段大小约为2 300 bp,与预期相同.测序结果与目的序列相同,重组体载体构建成功.Western印迹检测到SH-SY5Y细胞中APP的表达. 结论 成功构建pcDNA3.1(+)-APP真核表达载体并稳定转染SH-SY5Y细胞,成功表达了目的基因,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础.     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ(NTPase-Ⅱ)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-NTPase-Ⅱ并在COS-7细胞中进行瞬时表达。方法以pBAD-HisB-NTPase-Ⅱ质粒为模板,PCR扩增NTPase-Ⅱ目的基因,将其克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,双酶切及测序鉴定重组质粒。阳离子脂质体法转染COS-7细胞并经SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白的表达。结果经鉴定,弓形虫pcDNA3.1(+)-NTPase-Ⅱ核酸疫苗质粒构建成功。以脂质体法转染COS-7细胞后,转染细胞可成功地表达弓形虫NTPase-Ⅱ蛋白。结论证实了弓形虫NTPase-Ⅱ蛋白能在真核细胞中表达,为该基因的核酸疫苗研究提供了实验依据。     

Krüppel-like factor4慢病毒表达载体构建及其对胃癌细胞BGC-823生物学行为的影响

目的 构建Krüppel-like factor4(KLF4)过表达慢病毒载体,探讨其对胃癌细胞株BGC-823生物学行为的影响.方法 检测BGC -823中KLF4 mRNA的表达水平;用真核表达质粒pcDNA3.1IE-KLF4-EGFP,将KLF4基因连人慢病毒载体pLv-UbC-IRES2-EGFP中,构建pLv-KLF4-IRES2-EGFP重组慢病毒表达载体.将酶切和测序鉴定后的重组质粒转染至BGC-823中,观察转染情况,RT-PCR检测KLF4 mRNA.慢病毒包装后转染BGC-823细胞,Western印迹检测KLF4蛋白.结果 重组质粒经酶切和DNA测序证实目的基因插入正确;pcDNA3.1IE-KLF4-EGFP转染BGC-823细胞后KLF4 mRNA升高.慢病毒包装后转染BGC-823检测到目的蛋白KLF4.KLF4能够将细胞阻滞于G1/S,抑制其生长、促进细胞凋亡,减少细胞侵袭能力.结论 转染BGC-823后KLF4蛋白检测证实慢病毒载体成功构建,KLF4能抑制胃癌细胞的恶性转化.     

HIV-1B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5’端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确。RT PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV1B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

人NPTX2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建入神经元正五聚蛋白2(NPTX2)真核表达载体.转染人胰腺癌细胞PANC1,建立稳定转染的细胞系.方法 通过双酶切的方法获得人NPTX2全长cDNA,利用Not I和EcoR I酶切位点将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序验证盾,用脂质体转染法转染PANC1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的PANC1细胞,用实时定量PCR方法筛选NPTX2 mRNA高表达克隆.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)-NPTX2真核表达载体.并建立了稳定转染的PANC1细胞,成功表达了目的 基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染PANC1细胞系的建立为进一步研究NPTX2基因在胰腺癌细胞的作用奠定了良好的基础.     

结核分枝杆菌FurB基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌铁调控基因furB真核表达载体。方法以BamHⅠ和HindIII双酶切pQE-80L-furB获得furB基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定后以阳离子聚合物转染COS-7细胞,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pcDNA3.1(-)-furB,RT-PCR结果证明furB可在COS-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,显示COS-7细胞内有FurB蛋白的表达。结论成功构建了结核分枝杆菌furB基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-furB,furB基因可以在COS-7细胞中表达。     

增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和表达

目的　构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)编码基因的真核表达载体 pcDNA3.1(+) GFP,并观察其在Hep 2细胞中的表达情况。　方法　据已知的EGFP基因序列,设计合成 1 对引物,并引入Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切位点。应用PCR技术,从含有 EGFP的 pAdTrack CMV中扩增 EGFP编码基因。通过 TA连接将其克隆入pGEM T easy载体,经PCR及限制性内切酶鉴定后,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,转化Esche richia coli DH5α感受态细胞,于Amp+ LB平板上筛选阳性克隆。重组子经 Hind Ⅲ和EcoRⅤ双酶切、PCR鉴定,将该载体转染人喉癌细胞 Hep 2 后 48 h观察 EGFP表达情况。　结果　成功构建了含 EGFP 编码基因的真核表达载体pcDNA3.1(+) GFP,并成功转染Hep 2细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光。　结论　获得可产生绿色荧光的 EG FP,能方便地用作报告基因和筛选标记。     

核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其在A549中的表达

目的 建立人核心蛋白聚糖(decorin,DCN) 真核表达载体,并在A549细胞中进行表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 用PCR法扩增出DCN分子编码序列的cDNA全长,与pcDNA3.1(+)载体连接,构建真核表达载体pcDNA3.1-decorin,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染A549细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和Western印迹法检测其表达.结果 获得了约1 080 bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型DCN cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中.RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和Western印迹方法可见转染组细胞DCN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染DCN的A549细胞株.     

State of knowledge of helminth fauna of freshwater fishes of Poland

A total 89 fish and lamprey species has been recorded from Polish freshwater habitats. Twenty-seven of them (30.3%) have not been surveyed for parasitic helminthes. Some of the latter fishes are either rare or not easily accessible. Other live only in specific habitats in scattered localities. An important obstacle for studying parasite faunas of some fishes may be their status on an endangered species. Among the non-surveyed fishes, are those which have been relatively recently introduced to Poland or migrated there on their own. The present paper attempts to review all hitherto not studied helminthologically fish species, their habitats, localities and current protection status.     

高血压降压治疗目标的再认识

根据传统的高血压水平的定义,1993年WHO高血压治疗指南提出血压控制目标为<140/90mm Hg(1mm Hg=0.133kPa),但是并非所有患者都必须将血压降至同一水平,而应根据患者情况进行个体化治疗。Framingham进行的一项长达10～12年的心血管事件研究发现,第5年后,正常上限血压[收缩压(SBP     

Lack of correlation of degree of villous atrophy with severity of clinical presentation of coeliac disease

BACKGROUND AND AIM: Both the clinical presentation and the degree of mucosal damage in coeliac disease vary greatly. In view of conflicting information as to whether the mode of presentation correlates with the degree of villous atrophy, we reviewed a large cohort of patients with coeliac disease. PATIENTS AND METHODS: We correlated mode of presentation (classical, diarrhoea predominant or atypical/silent) with histology of duodenal biopsies and examined their trends over time. RESULTS: The cohort consisted of 499 adults, mean age 44.1 years, 68% females. The majority had silent coeliac disease (56%) and total villous atrophy (65%). There was no correlation of mode of presentation with the degree of villous atrophy (p=0.25). Sixty-eight percent of females and 58% of males had a severe villous atrophy (p=0.052). There was a significant trend over time for a greater proportion of patients presenting as atypical/silent coeliac disease and having partial villous atrophy, though the majority still had total villous atrophy. CONCLUSIONS: Among our patients the degree of villous atrophy in duodenal biopsies did not correlate with the mode of presentation, indicating that factors other than the degree of villous atrophy must account for diarrhoea in coeliac disease.