水蛭素基因在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化

目的：利用ＤＮＡ重组技术在大肠杆菌中融合表达水蛭不基因。方法：将水蛭素变体１的基因ＨＶ１克隆到ｐＥＺＺ３１８表达载体,转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９菌株,ＩＰＴＧ诱导表达,增减上清液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳检测,ｈＩｇＧ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析纯化。结果：表达的融合蛋白相对分子质量为２０ｋＤ,表达上清的抗凝血酶和为４７ＡＴＵ／ｍｌ。结论：在大肠杆菌中表达的水蛭素融合蛋白对凝血酶的凝血功能具有显著的抑     

水蛭素衍生物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

制备水蛭素衍生物，首次按照天然水蛭素分子中的氨基酸顺序，设计了水蛭素的基因，基因中融合了ＲＧＤ三肽编码顺序，形成水蛭素衍生物编码基因，用ＤＮＡ合成仪，分１０个寡核苷酸合成水蛭素衍生物基因。其中６个寡核苷酸组成Ｎ－端大片段，４个寡核苷酸组成Ｃ－端大片段。     

水蛭素衍生物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

制备水蛭素衍生物，首次按照天然水蛭素分子中的氨基酸顺序，设计了水蛭素的基因，基因中融合了ＲＧＤ三肽编码顺序，形成水蛭素衍生物编码基因，用ＤＮＡ合成仪，分１０个寡核苷酸合成水蛭素衍生物基因。其中６个寡核苷酸组成外端大片段，４个寡核苷酸组成Ｃ－端大片段。各大片段与载体ｐＵＣ１９重组和无性繁殖后，通过ＫｐｎⅠ位点连接成编码水蛭素衍生物分子的完整基因。经核苷酸顺序分析证实后，水蛭素衍生物基因与表达载体重组，转化大肠杆菌，筛选含重组质粒的细菌，命名为ｐＳＧＨＲＥ。结果：ｐＳＧＨＲＥ菌破碎后，上清和沉淀部分都有水蛭素活性。上清活性约２０ＡＴＵ／ｍｌ菌液。结论：我们构建了水蛭素衍生物基因的克隆并在大肠杆菌中得到表达。     

水蛭素的分离与纯化

水蛭是一种名贵的中药材,它的涎液中有一种抗凝血物质,称为水蛭素(Hirudin),水蛭素是至今为止世界上最强的凝血酶特效抑制剂。天然水蛭素产生于医用水蛭的唾液腺,大多数制取方法是以整个水蛭为原料,水蛭躯体中有较大量的结构与水蛭素类似,但无生物活性的“伪水蛭素”组分存在,它们将增加水蛭素分离的难度,本实验将水蛭分为三个部分,分别提取水蛭的口部,头部和身体的其他部位,这样就可以省去分离伪水蛭素而产生的不必要的麻烦,大大的提高生产效率,从而为水蛭素的药用提供了可能,现将研究结果报告如下。     

水蛭素衍生物基因的克隆及其在哺乳类细胞中的表达

设计特异性更高的水蛭素新突变体。化学合成编码水蛭素基因，并融合了ＲＧＤ３编码序列，通过连接，克隆、酶切筛选、ＤＮＡ序列分析，得到真核表达质粒ｐＡＰＲ－ＨＤ，表达质粒转染ＣＨＬ细胞，经Ｇ４１８筛选，获得表达克隆。     

水蛭素衍生物基因的克隆及其在哺乳类细胞中的表达

设计特异性更高的水蛭素新突变体。化学合成编码水蛭素基因，并融会了ＲＧＤ３肽编码序列，通过连接、克隆、酶切筛选、ＤＮＡ序列分析，得到真核表达质粒ｐＡＰＲ－ＨＤ，表达质粒转染ＣＨＬ细胞，经Ｇ４１８筛选，获得表达克隆。结果：细胞培液中，重组水蛭素衍生物的活性达到１０ＡＴＵ／ｍｌ，并有抗血小板凝集作用。结论：水蛭素新突变体具有预防血栓性疾病的应用前景，但其表达水平和稳定性有待于进一步提高。     

重组水蛭素药理学研究进展

1955年Markwardt从医用水蛭咽周腺体中成功地分离出水蛭素纯品。水蛭素是一种高效、特异的凝血酶抑制剂,具有强大的抗凝、抗栓活性。但因水蛭来源匮乏,使水蛭素的研究与临床应用受到限制。随着分子生物学和基因工程技术的发展,使其人工合成成为可能。自1986年以来,国外已有几个实验室成功地应用基因工程方法获得相当量的结构与药理活性     

发酵液中重组水蛭素的分离纯化

目的：建立毕赤酵母(pichia)高密度表达的重组水蛭素(recombinant hirudin-2,rHV2)分离纯化工艺。方法：高密度培养重组毕赤酵母并诱导表达水蛭素至胞外,发酵液经超滤、透析、离子交换层析。分离纯化rHV2目的蛋白;采用SDS-PAGE和抗凝血酶活力分别检测目的蛋白纯度和活性。结果：纯化样品经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,重组水蛭素比活性为6000ATU／mg,纯化收率达38．6％。结论：超滤、透析和离子交换层析可用于发酵液中大规模分离纯化重组水蛭素。     

脑出血后脑组织水,离子变化及水蛭素的作用

目的 探讨自发性脑出血脑水肿的发生机制及水蛭素的作用。方法 利用大鼠自体新鲜无肝素未凝动脉血定量脑出血模型,观察不同时间大鼠脑出血周围脑组织含水量、离子含量的变化,并以大鼠脑出血后脑内注射凝血酶特异抑制水蛭素的实验,研究水蛭素对水肿程度及离子含量变化的影响。结果 大鼠脑出血后早期脑组织含水量、离子随时间推移而升高,而水蛭素可减轻其水肿程度及离子变化（Ｐ〈０．０５）。结论 凝血酶与实验性脑出血脑水肿     

水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.     

重组水蛭素Ⅲ的分离纯化与鉴定

目的 :从分泌型重组水蛭素 Ⅲ 基因工程菌发酵液中分离纯化水蛭素 Ⅲ。 方法 :将发酵液经离心、大孔吸附树脂处理后 ,用DEAE- celluloseDE5 2离子交换层析 ,进而用HPLC反相层析。结果 :总收率达 5 0 %以上 ,纯度达 99.9% ,比活力达 90 0 0ATU/mg。结论 :分离纯化系统令人满意 ,回收率较高。     

水蛭素对脑出血后脑水肿36例分析

目的 探讨水蛭素对脑出血后脑水肿与脑组织损伤的影响。方法 随机将70例脑出血患者分为对照组和治疗组。时照组常规治疗,治疗组加用水蛭胶囊口服治疗。治疗前及治疗后3d、2周两组均行头颅CT、血清肌酸激酶（CPK）检查及临床神经功能缺损评分。结果 治疗组的脑水肿带,血清CPK和神经功能缺损评分的改善优于对照组,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 水蛭素可以减轻脑出血后血肿周围的水肿与组织损伤,从而提高临床疗效。     

纤维蛋白原平板法测定水蛭素活性

目的:报告一种新的水蛭素活性测定方法--纤维蛋白原平板法.方法:以纤维蛋白原作为底物,在纤维蛋白原平板上进行免疫扩散反应,精确测量沉淀圈直径,绘制标准凝血酶活力标准曲线.在标准曲线上查出凝血酶与水蛭素反应后的剩余凝血酶活力,计算出水蛭素活性.结果:系列活力浓度10、5.0、2.5、1.25、0.625、0.312 5 NIH/ml的标准凝血酶其免疫扩散沉淀圈直径与酶活力呈良好的线性关系(r=0.9959).结论:采用系列活力浓度的标准凝血酶与被水蛭素抑制后的剩余凝血酶同在一块纤维蛋白原平板上进行免疫扩散反应的方法,实验成本低,操作简便,结果客观,准确度较好.     

脑出血后脑组织水、离子变化及水蛭素的作用

目的　探讨自发性脑出血脑水肿的发生机制及水蛭素的作用。方法　利用大鼠自体新鲜无肝素未凝动脉血定量脑出血模型 ,观察不同时间大鼠脑出血周围脑组织含水量、离子含量的变化 ,并以大鼠脑出血后脑内注射凝血酶特异抑制剂水蛭素的实验 ,研究水蛭素对水肿程度及离子含量变化的影响。结果　大鼠脑出血后早期脑组织含水量、离子随时间推移而升高、变化 ,而水蛭素可减轻其水肿程度及离子变化 (P <0 .0 5 )。结论　凝血酶与实验性脑出血脑水肿的产生发展关系密切 ,早期应用水蛭素可减轻脑出血脑水肿。     

水蛭抗凝血活性物质分析及水蛭素提取纯化的研究进展

水蛭是一味传统的中药材,水蛭素是从水蛭体内和新鲜唾液中提取的天然多肽,具有抗凝血作用,在临床上广泛应用,但并不是所有品种的水蛭体内都含有水蛭素。该文综述了几种常见水蛭中含有的抗凝血活性物质成分以及水蛭素的提取和纯化方法,旨在为高效快速提取水蛭素的方法的深入研究提供参考和借鉴。     

大肠杆菌分泌表达重组水蛭素Ⅲ的新方法研究

目的:在已有的分泌表达载体pTASH基础之上构建一种更为高效的新型大肠杆菌分泌表达载体,并检验其分泌表达水平是否提高。方法:提取原始质粒pTASH作为模板,用PCR扩增重组水蛭素基因表达盒片段以后,再插入到原表达载体pTASH的BamHⅠ位点上,从而产生含有两个串联的水蛭素基因表达盒单元的质粒p(TASH)2,转入大肠杆菌进行摇瓶表达。结果:双表达盒菌种p(TASH)2进行摇瓶水平的培养,其上清液抗凝血酶活性可达3 500 ATU.ml-1。结论:与单表达盒质粒pTASH的表达水平(2 000 ATU.ml-1)相比,双表达盒质粒p(TASH)2的摇瓶表达水平显著提高。     

重组水蛭素体内抗凝活性的实验研究

目的：研究重组水蛭素的抗凝活性,为水蛭素新药开发提高实验依据,方法：家兔iv重组水蛭素前及后心脏采血,应用血凝仪测定凝血酶时间（TT）,凝血酶原时间（PT）,和活化的部分凝血活酶时间（APTT）,并考察其抗凝活性的量效和时效关系。结果：重组水蛭素能明显延长TT和APTT,且呈剂量依赖性,但在所试剂量范围内对PT无明显影响,其延长TT和APTT的作用随时间而下降,作用持续约60min,结论：重组水蛭 素具有明显抗凝作用,明显强于现有抗凝药肝素,且其作用强度与同剂量德国产基因重组水蛭素Refludan相同。     

广东菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列测定

【目的】研究地理因素对水蛭素基因结构变异的影响。【方法】抽提广东菲牛蛭基因组DNA ,根据已发表的水蛭素基因设计一对引物 ,从基因组DNA扩增出一特异性的大约 70 0bp片段 ,再回收、克隆和测序。【结果】广东菲牛蛭水蛭素基因全长为 6 42bp ,基因有 4个外显子 ,被三个内含子隔开。与马尼拉菲牛蛭水蛭素基因Hm1、Hm2 的同源性分别为 90 %与和 88 6 %。【结论】地理因素会影响菲牛蛭水蛭素基因结构的变异。     

凝血酶滴定法测定云南菲牛蛭中水蛭素含量的改进研究

目的 改进原云南省菲牛蛭质量标准中水蛭素的含量测定方法。方法 考察白瓷板法代替原试管方法、两种浓度的凝血酶溶液、几种滴定体积对含量测定的影响;用原方法和改进后的方法分别对五批样品进行滴定比较。结果 改进后,用白瓷板法测定,配制两种浓度的凝血酶溶液（40NIH·mL-1与20NIH·mL-1）,采用几种滴定体积（1～5μL）,每1min滴加1次,先滴加高浓度凝血酶溶液初测消耗的凝血酶溶液体积后,再用两种浓度的凝血酶溶液重新进行精确测定;增加空白对照实验,限定反应时间为10min;菲牛蛭样品浓度在0.00678～0.0597g·mL-1（r=0.9983）内与消耗的凝血酶单位量呈线性相关;五批样品的含量为156.68～234.25U·g-1,RSD均小于5%;含量供试品溶液在4℃下24h内稳定。结论 改进后的方法简便、快速,重复性和准确度较原方法好,可作为一种新的云南菲牛蛭水蛭素含量测定方法。     

水蛭素基因毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选

目的:构建水蛭素变异体HV1毕赤酵母分泌型表达载体,获得高拷贝稳定整合菌株,为大量获得重组水蛭素蛋白,进行功能研究及其临床应用奠定基础. 方法:根据水蛭素HV1的氨基酸序列及毕赤酵母偏爱的密码子,设计HV1编码基因,分为8条寡核苷酸片段进行DNA合成,经磷酸化、退火、连接和PCR扩增得到优化的HV1全长基因,测序结果正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,得到pPIC9K-HV1,SalI线性化后转化毕赤酵母GSM1168,G418梯度筛选转化菌,PCR鉴定目的基因的整合. 结果:获得了水蛭素毕赤酵母表达载体pPIC9K-HV1,G418抗性筛选得到高拷贝菌株,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中. 结论:成功构建了水蛭素HV1毕赤酵母表达载体,获得了高拷贝稳定整合菌株,为大规模表达纯化HV1蛋白及其临床应用奠定了基础.