RECK基因GFP融合蛋白表达载体的构建、鉴定及在脑胶质瘤细胞中的表达

目的:获得RECK基因GFP融合蛋白表达载体并使其在脑胶质瘤细胞SHG44中表达。方法:用基因克隆的方法构建RECK基因GFP融合蛋白表达载体,通过酶切和测序鉴定,用绿色荧光蛋白表达载体对RECK基因在人脑胶质瘤细胞SHG44中进行亚细胞定位。结果:所得RECK基因融合蛋白表达载体序列与预期相符。pEGFP-RECK表达质粒转染SHG44细胞后,荧光信号主要集中在与细胞质有关的部位。结论:成功构建了GFP-RECK融合蛋白表达质粒,这为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

稳定高效表达BRP 44的PC-3细胞系的建立

目的 建立稳定高效表达BRP 44的PC-3细胞系.方法 下载BRP 44的全长mRNA序列,用Oligo 6进行引物设计,在上下游引物的5'引入相应的Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ限制性内切酶识别序列及保护碱基.提取LNCaP细胞的总RNA反转录成cDNA进行PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA 3.1/myc-His A中构建成重组体.重组载体经酶切和测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染PC-3细胞、G 418筛选、Northern杂交检测并挑选出表达最强的亚克隆.结果 成功构建BRP 44的真核表达载体并获得高效稳定表达的BRP 44基因的PC-3细胞亚克隆.结论 高效稳定表达BRP44的PC-3细胞亚克隆可用于下一步研究.     

GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位

目的：构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位。方法：采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3通过酶切和测序鉴定正确后,脂质体法将重组质粒转染至LNCaP中,利用GFP抗体通过Western blotting检测 GFP-SUMO-3融合蛋白的表达,通过荧光显微镜观察其在细胞中的表达及分布。结果：重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3经BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,得到大小分别为4 700和312 bp的条带,与预期结果一致。测序结果显示,GFP在N端,是阅读框正确的SUMO-3的基因序列。在LNCaP细胞中过表达GFP-SUMO-3融合蛋白,Western blotting得到相对分子质量为39 000的蛋白表达条带,与GFP-SUMO-3大小相符。荧光显微镜观察,转染重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3　的细胞中呈绿色荧光,主要在细胞核内表达,与DAPI重合。结论：成功构建重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3,并表达代绿色荧光蛋白的SUMO-3融合蛋白,鉴定出SUMO-3在LNCaP细胞中的核定位性。     

GFP-HPV16 E2及其删除突变体融合蛋白在真核细胞中的表达与定位

目的构建人乳头瘤病毒16型E2(HPV16 E2)及其N端(TAD)、C端(DBD)删除突变体与增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的真核表达载体,观察其在Hela细胞中的表达与定位。方法HPV16 E2基因经PCR扩增后,与pMD-T载体连接,经蓝白斑筛选、PCR、双酶切鉴定及序列分析后,将E2基因亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2。PCR扩增TAD、DBD基因片段,将其双酶切后插入pEGFP-C1,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD。将3种质粒转染Hela细胞,在荧光显微镜下观察融合蛋白的表达与定位。结果重组载体经PCR、双酶切鉴定及测序证明插入片段序列正确,且在Hela细胞中能表达目的蛋白;GFP-E2融合蛋白在细胞核与细胞质中都有表达,但主要分布于细胞核;而GFP-DBD融合蛋白仅在细胞核内;GFP-TAD融合蛋白仅在细胞质中。结论构建的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2、pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD均在Hela细胞中表达,并确定了各自在细胞内的定位。     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

hPlk2基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人Polo样激酶2(hPlk2)真核表达载体并证实该融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。最后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hPlk2在COS-7细胞内的定位。结果:hPlk2基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小为2 058 bp,并测序成功。Western blot检测到了pEGFP-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为105 kDa。pEGFP-hPlk2在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。结论:成功构建了hPlk2基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPlk2蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。     

细胞分裂调控基因MAD2与GFP融合的真核表达质粒的构建及表达

目的：构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中表达.方法：通过RT-PCR扩增,获得MAD2基因的完整序列.将此片断插入pEGFP-N1载体多克隆位点区,构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒.应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察表达的绿色荧光.结果：成功构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.结论：该载体的成功构建,为研究MAD2基因在细胞分裂中的功能及定位建立了有效的观察体系.     

AsTP1的生物信息学分析及其细胞中的定位

目的 分析三氧化二砷反式激活基因1 (AsTP1)的结构及细胞定位.方法 采用生物信息学软件对AsTP1结构进行真核生物细胞定位预测;利用融合绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein ,GFP)定位的方法,通过构建pEGFP-C1-AsTP1重组质粒,将重组质粒pEGFP-C1-AsTP1转染Jurkat T 细胞和HepG2细胞,在荧光显微镜下观察AsTP1蛋白的亚细胞定位.结果 生物信息学预测AsTP1蛋白为胞内定位,大多数定位在细胞核,部分在细胞质内.有2个可能的酪蛋白激酶II磷酸化位点分别在26 aa和38 aa;1个蛋白激酶C磷酸化位点在40 aa.荧光显微镜下观察发现,AsTP1蛋白主要定位在细胞核,在细胞质中也有表达.结论 初步明确了AsTP1的蛋白亚细胞定位,为进一步研究AsTP1基因的功能建立基础.     

hRNF6基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的 构建环指蛋白6(RNF6)真核表达栽体,并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 提取工具细胞HEK-293的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hRNF6全长编码基因,并将其克隆至pCDNA3.1-myc-his A及pEGFP-C1表达栽体中.将构建的重组质粒测序并转染到工具细胞HEK-293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用共聚焦激光扫描显微镜观察DEGFP-RNF6在工具细胞CV-1和胃癌SGC-7901细胞内的定位.结果 hRNF6全长基因序列克隆到了真核表达载体pCDNA3.1-myc-his A和pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为2 058 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为78 kDa.pEGFP-RNF6在CV-1细胞和胃癌SGC-7901细胞内定位以细胞核为主,在细胞质内少量表达.结论 成功的构建了hRNF6全长基因真核表达载体,pEGFP-RNF6蛋白主要定位于胃癌细胞核内.     

人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HEK293细胞中表达.方法:通过RT-PCR从HEK293细胞总RNA中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列,与载体pEGFP-C1连接构建H2B基因与GFP融合表达的真核表达质粒pEGFP/H2B,经酶切和测序鉴定;应用脂质体转染技术将重组质粒转染HEK293细胞观察融合蛋白的表达.结果:成功构建H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达载体,与对照组中转染空载体pEGFP-C1的HEK293细胞中的弥漫荧光相比,转染重组质粒的细胞中可观察到绿色荧光蛋白集中表达在细胞核内,分裂期细胞中可见与染色体形态一致的绿色荧光.结论:该载体的成功构建为研究染色体的分离机制建立了有效的观察体系.     

应用GFP质粒构建及转染技术探讨Syk(L)核移位机制

【目的】通过研究Syk(L)在乳腺癌细胞亚细胞器中的分布和移位机制,探讨Syk(L)抑制乳腺癌的可能性机制。【方法】采用细胞胞核、胞浆分离技术和Westernblot的方法,检测乳腺癌细胞系BT474中两种Syk蛋白异构体在细胞内的分布。构建绿色荧光蛋白(GFP)和Syk(L)核移位相关功能域融合蛋白质粒,转染入Cos7细胞内,荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞内的分布。【结果】BT474细胞的细胞浆中可检测到Syk(S)和Syk(L)的表达,细胞核中只检测到Syk(L)的表达。在Cos7细胞中,GFP与Syk(L)的缺失域(deletiondomain,DEL域)融合蛋白均匀分布于细胞内,GFP与Syk(L)的IDB域融合蛋白聚集于细胞核中;将DEL域上的294K、300K、及305K突变域非碱性氨基酸后构建成GFP-IDB(L)-M,突变的融合蛋白则失去核聚集现象。【结论】在乳腺癌细胞中,Syk(L)可从细胞胞浆移位到细胞核内。Syk(L)的IDB域具有完整的核移位功能,能将融合的胞浆蛋白GFP转移到细胞核内;DEL域的碱性氨基酸具有核定位信号功能。Syk(L)在乳腺癌细胞中的抑癌功能与其核移位有关。     

GFP-hDaxx融合蛋白在真核细胞中的表达与鉴定

目的：构建GFP-hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP/hDAXX，并在HeLa细胞中表达，为进一步研究hDaxx在细胞凋亡、病毒感染中的作用提供实验基础。方法:用T4DNA连接酶将hDaxx亚克隆入载体pEGFP，筛选阳性克隆。将质粒pEGFP／hDaxx转染HeLa细胞，Western-Blotting鉴定表达产物，荧光显微镜观察GFP-hDaxx融合蛋白在细胞内的定位。结果：成功构建了GFP-hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP／hDaxx，GFP-hDaxx融合蛋白成功表达并定位HeLa细胞核。结论:GFP-hDaxx融合蛋白成功地在真核细胞表达并定位于细胞核。     

F10基因与绿色荧光蛋白融合载体的构建及亚细胞定位

目的：构建F10基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达载体，进而观察F10基因编码蛋白在细胞内的定位情况。方法：运用RT—PCR技术从葡萄胎组织中分离F10基因的完整ORF，构建pEGFP-N2／F10和pEGFP—C2／F10的融合表达载体，以1Apofect AMINE2000为介导剂，将重组载体转染入人乳腺癌细胞MCF-7，并在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察表达的融合蛋白。结果：显微镜下观察到，GFP／F10融合蛋白呈不规则的颗粒状、环状分布于细胞核，或细胞浆，或者在核浆中均有分布，而且在细胞浆中主要分布在细胞器中。而对照的pEGFP蛋白均匀分布在整个细胞浆和细胞核。结论：F10蛋白在细胞的不同周期分布不同，或在细胞核，或在细胞胞浆中，或者在核浆中均有分布。     

Construction of GFP-AWP1 fusion gene vector and its expression in 293 cells]

OBJECTIVE: To construct green fluorescent protein (GFP)-AWP1 (a novel human protein associated with protein kinase C-related kinase 1) fusion gene vector for observing the expression and localization of AWP1 in 293 cells. METHODS: The coding region in AWP1 cDNA was amplified by RT-PCR from human endothelial cell line ECV304 and recombined into pEGFP-C2 plasmid expressing GFP. After identification with restriction endonucleases and sequence analysis, the recombinant plasmid was transfected into 293 cells with the cationic liposome DOTAP as the transfection reagent. The expression and localization of AWP1 were observed under a fluorescence microscope. RESULTS: Restriction endonuclease assay and sequence analysis verified the successful construction of the recombinant vector pEGFP-C2/AWP1, and GFP-AWP1 fusion protein was highly efficiently expressed in 293 cells. Under fluorescent microscope, green fluorescence was seen homogeneously distributed in the entire cell body of the cells transfected by the empty vector pEGFP-C2, but diffusely in the cytoplasm of the cells transfected by the recombinant vector pEGFP-C2/AWP1. CONCLUSION: GFP-AWP1 fusion gene vector is successfully constructed and the fusion protein expressed in the cytoplasm of 293 cells.     

人GFP-AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWP1(associated with protein kinase C related kinase 1,AWP1)表达载体,观察AWP1在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区,并将其重组于GFP表达载体pEGFP-C2中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导,转染293细胞。荧光显微镜观察AWP1在细胞内的表达和分布。结果 GFP-AWP1融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下,在不携带外源基因的空载体pEGFP-C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中;在重组质粒pEGFP-C2/AWP1转染的293细胞,绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP-AWP1融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。     

Stra 6基因的克隆及其在U251细胞中的表达定位

目的:从人胎盘cDNA文库中获得Stra6基因的全长阅读框架,通过融合GFP蛋白的表达观察其在人脑胶质母细胞瘤细胞株U251中的表达定位及形态学影响。方法:应用高保真PCR技术从人胎盘cDNA文库中扩增出特异片段,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-Stra6,转染U251细胞,荧光倒置显微镜观察蛋白表达定位及对形态学影响。结果:获得含人Stra6基因全长阅读框架的重组质粒pEGFP-Stra6,融合GFP的Stra6蛋白大多表达于细胞质和细胞膜。可观察到转染后的细胞呈现分化状态。结论:Stra6基因过表达使U251细胞形态改变,可能在细胞分化中起作用。     

PRMT2及其剪接体在乳腺癌MCF-7细胞中的亚细胞定位及意义

目的：构建蛋白质精氨酸甲基转移酶2( PRMT2)及其差异剪接体与绿色荧光蛋白( GFP)的真核表达载体,转染后观察其融合蛋白在乳腺癌MCF-7细胞中的表达及亚细胞定位,为进一步研究PRMT2基因及其新的差异剪接体在乳腺癌中的作用奠定基础。方法以pGEM-T-PRMT2/α/β/γ载体为模板,设计引物,PCR扩增目的基因,并将PCR产物克隆至pcDNA3.1/NT-GFP-topo载体,转化后将阳性克隆扩增,对 PCR 产物进行跑胶鉴定和测序。提取 pcDNA3.1/NT-GFP-PRMT2/α/β/γ及空载体pcDNA3.1/NT-GFP质粒,用脂质体介导转染MCF-7细胞,在激光共聚焦显微镜下,观察外源性PRMT2/α/β/γ融合蛋白在MCF-7细胞中的亚细胞定位。采用Western blot法检测各重组融合蛋白在MCF-7细胞中的表达。结果各GFP在细胞中均有表达,但其在细胞中的分布位置不一致。 PRMT2α与PRMT2γ的融合蛋白同PRMT2的分布一致,均聚集于核仁外的核浆,胞质中有少许分布;而PRMT2β和空载体的荧光蛋白的分布一致,都均匀分布于细胞的胞质和胞核,包括核仁部分。 Western blot法检测表明各重组融合蛋白在MCF-7细胞中均有表达。结论 PRMT2及其各剪接体的亚细胞定位不同,可能提示其在功能方面存在差异。     

s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达与定位

目的:观察s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达及定位。 方法：根据s-lap基因的编码区序列, 应用PCR技术突变其3′末端终止密码子, 并通过基因重组技术将其与GFP基因融合,构建s-lap/GFP重组质粒;采用脂质体转染法, 将s-lap/GFP融合基因转入Hela细胞中, 用荧光显微镜观察其表达。 结果:s-lap/GFP重组质粒序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜显示, 在转染GFP基因的Hela细胞中,荧光呈网状均匀分布于细胞浆内,而细胞核内低表达;在转染s-lap/GFP融合基因的Hela细胞中,荧光均匀分布于整个细胞,尤其以细胞核内高表达。 结论：s-lap/GFP融合蛋白可在人Hela细胞中表达,并主要定位于细胞核。     

GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在真核细胞内的表达与定位

目的:研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白在巨噬细胞(MΦ)内的表达与定位。方法:将真核表达载体pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD和pEGFP-C1/DBD及pEGFP-C1分别转染MΦ,48h后用倒置荧光显微镜观察荧光情况,以确定GFP及融合蛋白的表达;以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测相应蛋白质的表达。结果:在荧光显微镜下,4种质粒转染的细胞,pEGFP-C1组细胞内均有荧光;pEGFP-C1/E2组荧光主要在细胞核,但细胞浆也有;pEGFP-C1/DBD仅在细胞核有荧光,pEGFP-C1/TAD仅在细胞浆有荧光。Western blot检测到GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在细胞内的表达。结论:GFP-E2及其突变体融合蛋白均能在巨噬细胞内表达,且GFP-E2主要定位于细胞核,GFP-DBD定位于细胞核内,GFP-TAD定位于细胞浆。