携带GFP和FLAG标签的真核表达载体介导细胞珠蛋白在细胞内表达的定位研究

目的分别构建带有绿色荧光GFP标签和带有FLAG标签的细胞珠蛋白(CYGB)真核表达载体,观察其在人肝星状细胞(LX-2)的表达定位情况,探讨细胞珠蛋白经不同载体介导表达的定位差异。方法提取人肝癌细胞(HepG2)总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得CYGB的cDNA,以cDNA为模板采用PCR法扩增得到CYGB编码序列。将其酶切后分别连接至带有GFP标签和FLAG标签的载体上,酶切与测序鉴定阳性克隆。随后将重组质粒分别瞬时转染LX-2细胞,Western blot鉴定表达情况。利用细胞免疫荧光定位,在荧光显微镜下观察两组定位差异。结果双酶切和测序鉴定表明pEGFP-N1-CYGB和pcDNA3.0-CYGB-FLAG真核表达载体构建成功;经Western blot鉴定,转染的两个载体都能够在LX-2细胞中表达融合蛋白;通过荧光显微镜发现,pEGFP-N1-CYGB和pcDNA3.0-CYGB-FLAG介导的表达产物分别定位在整个细胞和细胞质中。结论可能由于GFP分子量大等多种原因,导致带GFP标签的融合蛋白定位与带FLAG标签的定位不同,带FLAG标签的融合蛋白定位结果更加可信。     

稳定高效表达BRP 44的PC-3细胞系的建立

目的 建立稳定高效表达BRP 44的PC-3细胞系.方法 下载BRP 44的全长mRNA序列,用Oligo 6进行引物设计,在上下游引物的5'引入相应的Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ限制性内切酶识别序列及保护碱基.提取LNCaP细胞的总RNA反转录成cDNA进行PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA 3.1/myc-His A中构建成重组体.重组载体经酶切和测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染PC-3细胞、G 418筛选、Northern杂交检测并挑选出表达最强的亚克隆.结果 成功构建BRP 44的真核表达载体并获得高效稳定表达的BRP 44基因的PC-3细胞亚克隆.结论 高效稳定表达BRP44的PC-3细胞亚克隆可用于下一步研究.     

多基因真核表达载体的构建及其产物的亚细胞定位

目的构建一种多基因表达载体,实现同一载体单一启动子的调控下表达多个基因以及这些基因在同一细胞不同细胞器中的定位。方法利用存在于某些病毒核酸序列中的不同2A肽,合成1段包括2个2A肽和不同限制性内切酶位点的多肽序列,形成单一的开放读码框,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)Myc/His(B)相应的多克隆位点中,然后将带有膜定位的红色荧光蛋白(ERFP)、核定位的绿色荧光蛋白(EGFP)和胞浆定位的黄色荧光蛋白(EYFP)顺序插入2A肽之间的位点中,构建多基因真核表达载体pcDNA3.1 RGY。用脂质体转染小鼠成纤维NIH3T3细胞和人肾胚293细胞,利用流式细胞仪、荧光显微镜和共聚焦显微镜检测各种荧光蛋白的表达和亚细胞定位。结果转染24 h后用流式细胞仪检测,可同时检测到EGFP和ERFP的表达,且两种荧光蛋白的表达率十分接近;荧光显微镜下同时观察到绿色和红色荧光;共聚焦显微镜观察到在单一细胞上同时显示3种荧光,ERFP定位在细胞膜上,EGFP在细胞核中,而EYFP在细胞质中。结论通过串联方式将多个2A肽和基因置于同一个开放读码框中可实现在同一启动子的调控下表达多个基因。此外,在每个基因序列中加入不同的信号肽序列可将相应基因同时靶向不同的细胞器,实现同一细胞中不同的亚细胞定位。     

白细胞介素-23基因的克隆及真核双表达载体的构建

[目的]通过分别克隆白细胞介素-23（IL-23）基因的双亚基p19和p40,构建pcDNA3-IL-23真核双表达载体,为通过IL-23基因转染树突状细胞（dendritic cell,DC）增强其介导的免疫抗肿瘤作用提供基础。[方法]一步法从小鼠脾脏及胸腺中提取p19和p40总RNA,RT—PCR法扩增p19和p40的cDNA,扩增产物与pMD18-Tvector连接并热转化至大肠杆菌JM109,PCR法筛选阳性克隆,提取质粒并进行DNA的测序鉴定,将pMD18-p19和DMD18-p40分别限制性酶切,在对pcDNA3表达载体限制性酶切后将切胶回收的p19和p40片段分别克隆至pcDNA3．0表达载体,对阳性质粒进行XhoI/KpnI双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳分析。[结果]脾脏及胸腺中提取p19和p40总RNA电泳鉴定是完整的,克隆的p19和p40 cDNA经测序鉴定与Genebank中序列完全一致。构建的pcDNA3．0-p19和pcDNA3．0-p40质粒分别限制性酶切后得到了593bp和1028bp的基因片段;构建的pcD．NA3．0-IL-23表达载体限制性酶切后得到了1．62kbD的p19＋p40片段。[结论]成功克隆了小鼠IL-23基因,并分别构建了pcDNA3-p19、pcDNA3-p40和pcDNA3-IL-23真核表达载体,为IL-23基因转染DC来增强其免疫活性创造了条件。     

人视网膜母细胞瘤蛋白真核表达载体的构建及其在前列腺癌细胞中的表达与定位

目的构建人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma 1,RB-1)基因真核表达载体,并在前列腺癌细胞株PC-3中表达,为进一步研究其在前列腺癌发病中的作用和机制打下基础。方法采用PCR方法扩增RB-1基因编码区的全长序列,并加上FLAG标签,利用分子克隆技术将其重组于CMV载体中。利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性。转染PC-3细胞,用Western Blot检测其表达,用免疫荧光检测其在细胞中的定位。结果克隆的RB-1真核表达载体完全正确,Western Blot检测到RB-1有表达,免疫荧光检测其主要定位于细胞核内。结论成功地构建了RB-1真核表达载体,其能够在PC-3中高效表达,并主要定位于细胞核内。     

PTTG1基因上调表达对A549细胞增殖和凋亡的影响

目的研究人垂体瘤转化基因1(human pituitary tumor transforming gene 1,PTTG1)上调表达对肺腺癌细胞株(A549)增殖和凋亡的影响.方法构建含PTTG1基因的真核表达载体,脂质体法转染A549细胞并用G418筛选出高表达的阳性克隆株,实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitation PCR)和免疫细胞化学(immunocytochemical assay,ICA)分别检测PTTG1 mRNA及蛋白表达的改变,3H胸腺嘧啶核甙(3H-TdR)掺入法检测细胞增殖活性,AnnexinⅤ异硫氢酸荧光素(FITC)试剂盒检测凋亡情况.结果成功构建含PTTG1基因的真核表达载体,获得上调表达PTTG1的A549细胞,转染含PTTG1基因重组质粒的A549细胞增殖活性较未转染组细胞及转染空白质粒组细胞均显著增强(P＜0.05);3组细胞间的凋亡率无显著差异.结论PTTG1基因能显著促进A549细胞的增殖,而对细胞凋亡没有影响.     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

人CD154基因真核表达载体的构建及在Eca109细胞中的表达

目的：构建人CD154基因真核表达质粒pcDNA3．1-CD154,初步观察转染该质粒后Eca109细胞的细胞生物学特性。方法：人外周血单个核细胞体外经PHA激活后提取总RNA,用RT—PCR技术扩增人CD154cDNA全长并构建真核表达质粒pcDNA3.1—CD154,用Lipofectamine^TM 2000介导pcDNA3．1-cDl54质粒转染食管癌Eca109细胞株,RT—PCR检测转染细胞中CD154 mRNA的表达,观察细胞生长特征。结果：用T7／SP6通用引物测序证实重组质粒中插入片段为正向插入的人CD154基因。pcDNA3．1-CD154转染Eca109细胞后细胞异型性明显改善,生长速率减慢。结论：pcDNA3．1-CD154构建成功;转染该质粒的Eca109细胞生物学特性发生改变。     

PRMT2真核表达载体构建及在乳腺癌MCF7细胞的亚细胞定位

目的 构建携带人蛋白质精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)基因的真核表达载体pEGFP-N1-PRMT2,观察其转染乳腺癌MCF7细胞后融合蛋白在细胞中的亚细胞定位,为进一步研究PRMT2基因在乳腺癌中的作用奠定实验基础.方法 以本实验室保存的pGEM-T-PRMT2载体为模板进行聚合酶链反应(PCR)特异扩增PRMT2基因片段,将扩增片段经HindⅢ和Sal Ⅰ双酶切后克隆到pEGFP-N1载体,酶切与测序鉴定阳性克隆;激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在乳腺癌MCF7细胞中的定位.结果 成功构建了pEGFP-N1-PRMT2重组真核表达载体,融合蛋白主要聚集成颗粒状分布于除核仁以外的核浆中,胞质中少量弥散分布.结论 pEGFP-N1-PRMT2重组真核表达载体的构建为进一步研究PRMT2基因在乳腺癌及其内分泌治疗中的作用奠定实验基础.     

前列腺癌组织转移相关基因CD44v6的表达意义

目的　探讨转移相关基因 CD4 4 v6在前列腺癌中的表达及意义 .方法　以免疫组化 S- P法对 6 7例前列腺癌标本进行染色及分析 .结果　 CD4 4 v6在前列腺癌中有较高的表达 ,阳性率为 4 1.8% (2 8/ 6 7) .其中无转移者阳性率为 16 .0 %(4/ 2 5 ) ,有淋巴结或远处转移者阳性率 5 7.1% (2 4 / 4 2 ) ,两者比较差异有显著性 (P<0 .0 1) CD4 4 v6阳性表达与前列腺癌分化程度 (r=0 .4 6 3,P<0 .0 5 )及临床分期 (r=0 .4 12 ,P<0 .0 5 )相关显著 .CD4 4 v6阳性的前列腺癌患者术后生存期显著低于阴性患者 (9.5 % vs 39.3% ,P <0 .0 5 ) .结论　CD4 4 v6阳性表达与前列腺癌的发生、发展及预后有关     

CD133和CD44在前列腺癌中的表达及意义

目的 探讨CD133和CD44在前列腺癌中的表达及意义.方法 72例前列腺癌组织标本作为病例组,以33例正常前列腺组织作为观察组,应用免疫组织化学技术检测二组CD133和CD44的表达,并分析其不同临床病理特征中表达的差异.结果 观察组中CD133和CD44的表达阳性率均明显高于对照组,差异均有显著的统计学意义(P＜0.01),CD133和CD44的表达与前列腺癌病理分级分级,临床分期,远处转移等指标密切相关(P＜0 05).结论 前列腺癌中CD133和CD44异常表达,二者在前列腺癌中发挥重要作用.     

肺癌组织中CD44s、CD44v6的表达及其临床意义

目的探讨标准型CD44（CD44s）和变异型CD44（CD44v6）在肺癌组织中的表达及其临床意义。方法应用免疫组织化学法检测96例原发性肺癌患者组织CD44s和CD44v6的表达情况。结果CD44s和CD44v6在小细胞肺癌患者中不表达,而表达于非小细胞肺癌（NSCLC）患者中,且CD44s和CD44v6在鳞癌中的表达强度高于腺癌;在NSCLC患者中CD44s强表达于高分化肺癌组织中,而CD44v6高表达于低分化肺癌组织中;在淋巴结转移的患者中CD44v6强表达,而CD44s表达水平则较低或不表达;早期肺癌患者多强表达CD44s,而进展期肺癌多强表达CD44v6。结论CD44s和CD44v6可作为一项评价肺癌的组织病理类型、淋巴结是否转移、临床分期及预后的重要指标。     

CD44分子在乳腺癌中的表达

目的:研究粘附分子CD44在乳腺癌中的表达及其与临床病理特征的关系,以求更加深入地探讨乳腺癌侵袭和转移的机制,为乳腺癌临床的诊治提供参考.方法:采用免疫组织化学ABC法,研究CD44S及CD44V6在52例乳腺浸润性导管癌组织中的表达强度.结果:在52例乳腺癌中,CD44S阳性18例(34.6%),阴性34例(65.4%);CD44V6阳性16例(30.8%),阴性36例(69.2%).CD44的表达未发现与病人年龄、肿瘤大小、病理分期、组织学分级、雌孕激素受体有统计学相关,CD44V6的表达,腋淋巴结阳性组的表达率明显高于腋淋巴结阴性组,且组织学分级Ⅲ级CD44V6阳性表达率明显高于Ⅰ Ⅱ级.结论:CD44V6在乳腺癌中的表达与肿瘤的组织学分级及腋淋巴结状态密切相关.     

CD44基因在非小细胞肺癌组织中的表达及其与预后的关系

目的：探讨CD44基因在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与临床预后的关系。方法：应用RT-PCR方法检测36例NSCLC组织中CD44基因的表达,并进行3年随访。结果：36例NSCLC组织有21例ＣＤ44基因过量表达,过量表达率为58.3%。CD44 mRNA在NSCLC 组织中的表达与患者的年龄、性别、组织学类型、病理分级、TNM分期及肿瘤大小无关,而与淋巴结转移有关(χ² =9.787,P<0.01)。③ 经aplan-Meier生存曲线分析表明,36例NSCLC组织中 CD44过量表达组生存率低于一般表达组 (χ²=5.9116, P<0.05)。结论：CD4 4基因过量表达的NSCLC患者淋巴结转移率高,CD44基因的表达检测对NSCLC患者的预后判断和术后放疗及 化疗具有指导性作用。     

卵巢上皮癌中CD44基因mRNA内含子9的检测及临床意义

目的:研究卵巢上皮癌中CD44基因mRNA内含子9的滞留情况及其临床意义.方法:采用半定量RT-PCR方法检测不同卵巢组织中CD44基因mRNA内含子9的滞留率及相对含量.结果:内含子9在正常卵巢组织中无滞留;在卵巢良性、交界性、恶性上皮性瘤中滞留率及相对含量分别为36.67%和8.37%,87.50%和86.87%, 93.33%和91.17%;恶性和交界性上皮性卵巢瘤中内含子9的滞留率及相对含量明显高于良性上皮性卵巢肿瘤(P<0.01);不同组织学类型和临床分期内含子9的滞留率和相对含量无显著性差异(P>0.05).结论:检测内含子9的滞留可能成为新的卵巢癌生物学诊断方法.     

非小细胞肺癌中CD44v6的表达及意义

目的 探讨非小细胞肺癌中CD44v6的表达及其临床意义.方法 应用免疫组化法对72例非小细胞肺癌组织进行CD44v6检测.结果 CD44v6阳性染色定位于肺癌细胞质,阳性表达率为68%,其表达强度与非小细胞肺癌的组织学分级、淋巴结转移及临床分期呈显著相关(P均＜0.01),鳞癌CD44v6的表达率与腺癌有差异性(P＜0.05), CD44v6的表达强度与病人的年龄、性别均无关(P均＞0.05).结论 CD44v6在非小细胞肺癌的发生发展过程中有一定的作用,检测CD44v6可能成为判定非小细胞肺癌恶性程度、评估其侵袭性及转移性的重要指标.     

胃癌患者CD44v6 mRNA的表达

目的探讨CD44v6在胃癌发展、转移中的作用.方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测64例胃癌患者胃癌及其正常胃黏膜CD44v6 mRNA表达.结果胃癌患者胃的正常黏膜有少量CD44v6 mRNA表达;胃癌组织CD44v6 mRNA的表达阳性率高于其正常黏膜.胃癌组织CD44v6mRNA表达阳性率在淋巴结转移患者(75.56%)高于无淋巴结转移者(36.84%),有远处转移者(92.86%)高于无远处转移组(41.87%),患者性别、肿瘤长径＜5cm与≥5cm、肿瘤发生部位、大体类型、组织类型、组织学分化程度、浸润深度和TNM分期与CD44v6表达阳性率无关.结论胃的正常黏膜有少量CD44v6表达,胃癌组织CD44v6表达明显增多,CD44v6表达较多提示淋巴结转移和远处转移的可能.     

食管癌组织CD44V5基因的表达

目的: 探讨CD44V5的基因表达与食管癌临床病理及预后的关系. 方法: 应用免疫组织化学S-P法对85例食管癌标本和20例正常的食管组织进行CD44V5的基因产物测定,并对其中50例患者进行了术后3 a随访. 结果: CD44V5在食管癌中的阳性表达率为61.2%,而在正常食管组织中的阳性表达率为20.0%. 在食管癌中CD44V5的表达与食管癌的浸润深度(χ2=5.96, P<0.01)、分化程度(χ2=7.28, P<0.01)、淋巴结转移(χ2=6.88, P<0.01)及预后(χ2=4.52, P<0.01)有显著性相关,而与食管癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、病理类型均无相关性(P>0.05). 结论: CD44V5在食管癌中的不同表达与食管癌的淋巴结转移及预后显著相关,可为临床预测食管癌淋巴结转移及评估预后提供重要的参考指标.