河南新乡2008年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的:对2008年分离自河南新乡手足口病患者粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源.方法:将手足口病患者粪便标本接种敏感细胞进行分离传代培养,制备抗原片进行间接免疫荧光检测,采用特异性引物进行PCR鉴定,将病毒基因组分为8个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树.结果:测序获得的3株EV71病毒基因组全长均为7 405 nt,VPI氨基酸序列同源性达100%.Blast分析表明F3(F8)-Henan-08毒株均与安徽阜阳2008年分离的EV71毒株同源性最高,而F4-Henan-08毒株与我国台湾省2004年分离的EV71毒株同源性最高.序列进化分析表明,新分离毒株属于C4基因亚型.结论:新分离的河南EV71毒株与安徽阜阳分离的毒株可能具有相同来源.     

登革1型病毒广州2006年分离株的基因组特征与进化分析

目的 对2006年分离自广州登革热患者血清的4株登革1型病毒(GZ57/06、GZ63/06、GZ69/06和GZ128/06)进行全基因组序列测定,并同其他毒株序列进行比对分析,以了解其基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将登革1型病毒分离株基因组分为9个片段进行RT-PCR扩增,5'与3'末端序列采用RACE法扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果 测序获得的4株广州登革1型病毒基因组全长均为10 735核苷酸(m),编码3 393个氨基酸.5'和3'端各有一段非编码区,长度分别为94nt和462nt.4株病毒的编码区与非编码区核苷酸及氨基酸序列存在一些差异,其中GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株的基因组核苷酸和氨基酸序列同源性均在99%以上,而GZ128/06株变异较其他3株大,编码区差异尤其明显.序列比对分析表明,GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株均与泰国2001年分离毒株ThD1/0049/01和ThD1/0102/01同源性最高,而GZ128/06毒株与缅甸1998年分离毒株D1.Myanrmr.31987/98同源性最高.这些新分离毒株与东南亚毒株属于同一基因型.结论 新分离毒株可能来自泰国等东南亚国家和地区,不同毒株表型差异可能与其基因组特征具有密切关系.     

WJBC株盖塔病毒基因组序列测定及与其他甲病毒的系统进化关系

目的对WJBC株盖塔病毒（GETV）进行基因组序列测定,阐明其与已报道的GETV及其他甲病毒的关系。方法将GETV基因组编码区分12段分别进行RT-PCR扩增,将扩增产物直接进行测序,非编码区采用RACE法进行扩增,扩增产物纯化后连入pGEM-T easy载体,经转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆鉴定后测序,应用DNAStar软件将测序结果拼接获得基因组序列。结果与结论 GETV基因组核苷酸共11 696 nt,编码3721个氨基酸,非结构基因编码2468个氨基酸,结构基因编码1253个氨基酸,结构基因和非结构基因之间有44 nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5＇端和3＇端分别有78、411 nt的非编码区。序列同源性分析结果表明,此株病毒与M1株盖塔病毒同源性最高,两者核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸序列同源性为99.2%。     

新疆南疆地区羊口疮病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

为确定新疆喀什等地区羊场发生的疑似羊口疮(ORF)的病原,利用GSFs细胞从送检的羊口鼻痂皮中分离获得的毒株,通过PCR鉴定确定该病原为羊口疮病毒(ORFV),命名为ORFV/XJ-NJ/2017/China株。然后对该分离株的B2L基因和ORFV121基因进行克隆,测序,并与其它ORFV序列进行遗传进化分析。结果表明:ORFV/XJ-NJ/2017/China的B2L基因全长为1097bp,编码365个氨基酸,ORFV121基因长889bp,编码296个氨基酸,与Gen Bank中收录的其他ORFV流行株相比,B2L基因核苷酸的同源性为94.7%~98.5%,与疫苗株的核苷酸同源性为97%,推导的氨基酸同源性为95%~97%,;ORFV121基因核苷酸的同源性为93.6%~99.1%,推导的氨基酸同源性87.7~98%。利用软件构建系统进化树分析,根据B2L基因遗传进化树分析结果表明,该分离株与印度分离株亲缘关系最近;由ORFV121基因遗传进化分析结果表明,该分离株与我国NA1/11分离株亲缘关系最近.根据B2L基因和ORFV121基因的遗传进化分析,其分离得到的病毒株可能是国内外流行重组后产生的一个变异株,为羊口疮病毒的后续研究提供依据。     

基孔肯雅病毒WJ0601株基因组全序列测定及分析

目的对保存的基孔肯雅病毒WJ0601株基因组序列进行测定,并阐明该病毒与已报道毒株序列的关系。方法对基孔肯雅病毒基因组编码区分14段进行RT-PCR扩增,对非编码区采用RACE法进行扩增,将扩增产物直接进行测序,应用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列。结果与结论基孔肯雅病毒WJ0601株基因组核苷酸共11826nt,编码3722个氨基酸,其中5′端的2/3基因组编码4种非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4;3′端的1/3基因组编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白。结构基因和非结构基因之间有68nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5′端和3′端分别有76nt、526nt的非编码区。序列同源性分析结果表明,此株病毒与S27-African株的同源性最高,两者核苷酸序列同源性为99.9%,氨基酸序列同源性为99.8%,同属于（ESCA）基因型。     

西尼罗病毒Chin-01株基因组非编码区的序列测定及分析

目的对西尼罗病毒(WNV)Chin-01株基因组非编码区(UTR)序列进行测定,了解其与已报道毒株的序列差异及系统发育关系。方法采用5′和3′RACE法对Chin-01株病毒基因组的UTR进行RT-PCR扩增,测定扩增产物序列,采用DNAstar软件对该株及其他9株WNV的UTR进行序列同源性分析,同时构建了基于3′UTR的系统发育树,并用RNA structure软件预测其二级结构。结果Chin-01株基因组5′和3′UTR分别为96nt和630nt,序列同源性分析的结果表明,其5′UTR与其他9株的同源性均达到99%或100%,而3′区UTR与埃及Eg101株的同源性最高,达98·1%。5′UTR的起始核苷酸为AG,并含有一段与3′UTR互补的14nt序列。3′UTR的末端为CUOH,包含一段完全保守的5nt序列,以及三个保守的称为CS2、RCS2和CS1的基序。二级结构预测发现,Chin-01株5′UTR呈长茎环结构,3′UTR的3′端也可形成多个保守的茎环结构。结论Chin-01株与埃及Eg101株亲缘关系最为密切。     

1株辛德毕斯病毒基因组编码区序列测定及分析

目的:对保存的一株辛德毕斯病毒基因组编码区序列进行测定,阐明其与已报道毒株序列的差异.方法:对辛德毕斯病毒基因组编码区进行分段RT-PCR扩增,将扩增产物直接进行测序,采用DNA Star软件将分段测序结果拼接得到全长编码区序列.结果与结论:此株辛德毕斯病毒基因组编码区全长11 322 nt,编码3 774个氨基酸,其中非结构基因长7 539 nt,编码4种非结构蛋白NSp1,NSp2,NSp3,NSp4;结构基因全长3 735 nt,编码5种结构蛋白E1,E2,E3,6K和C蛋白.非结构基因和结构基因之间有48 nt的不翻译连接区.序列同源性分析结果表明,此株病毒与HRsp株的同源性最高,两者核苷酸序列同源性为99.7%,氨基酸序列同源性为99.6%.此株病毒与HRsp株病毒亲缘性最高,同属于南非-欧洲组.     

1株保存的马雅罗病毒基因组序列测定及分析

目的对保存的WJBC株马雅罗病毒(MAYV)基因组序列进行测定,阐明其与已报道毒株的关系及追溯其可能来源。方法将MAYV基因组编码区分10段进行RT-PCR扩增,扩增产物直接进行测序,非编码区采用RACE法进行扩增,扩增产物纯化并连接pGEM-T easy载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆鉴定后进行测序,用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列。下载MAYV核苷酸序列,利用MEGA5.0软件构建系统进化发生树。结果与结论 WJBC株MAYV基因组核苷酸(nt)共11 429 nt,编码3679个氨基酸,其中5’端的2/3基因组编码4种非结构蛋白nsP1,nsP2,nsP3,nsP4;3’端的1/3基因组编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白。结构基因和非结构基因之间有26 nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5’端和3’端分别有76、290 nt的非编码区。进化树结果显示,WJBC株马雅罗病毒与TRVL4675株MAYV亲缘性最高。     

我国登革2型病毒43株包膜E蛋白基因的特征

对我国1987年流行的登革2型病毒43株包膜E蛋白基因的核苷酸序列进行了分析。结果表明登革2型病毒43株包膜E蛋白基因核苷酸序列含1485个核苷酸，编码495个氨基酸，并就其核苷酸序列及其相应的氨基酸序列与其它的登革2型病毒株进行了比较，发现核苷酸序列与我国1985年分离的登革2型病毒04株，新几内亚C株（NGC），牙买加株1409（JAM）和马来西亚当地流行株M1（登革出血热）、血2（登革休克综合征）、M3（登革热）同源性分别是95.8%、94.6%、97.5%、925%、92.7%和939%，氨基酸序列的同源性分别是94.3%、94.3%、96.0%、93.7%、93.7%和91.5%，推断出的氨基酸序列显示出12个保守的半胱氨酸残基和两个潜在的糖基化位点，分别位于Asn-67和Asn-153位。     

新分离呼肠病毒基因组片段S1全长cDNA克隆及其序列分析

目的：克隆测序新分离呼肠病毒的S1全长基因组片段，并对其进行序列分析。方法：从接种呼肠病毒的L929细胞中提取病毒基因组，用改进的单引物扩增技术获得S1片段的全长cDNA克隆井测定其全序列。结果：新分离呼肠病毒的S1片段长1437bp，其核苷酸序列与已知的1—3型呼肠病毒标准株的同源性分另1为59％，61％和48％；推测的cr1序列与标准株的同源性分别为52％，60％和26％。结论：新分离呼肠病毒的S1片段与目前已知的分离株相比有很大差异，有可能是2型呼肠病毒的一个独立分支。