GCV和CTL对HSV-TK/B7基因转染的大鼠乳腺癌细胞杀伤的体外实验

目的　观察羟甲基无环鸟苷 (GCV)、CTL对逆转录病毒介导的转染单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV TK)和共刺激分子 (B7)双基因的大鼠乳腺癌细胞的体外杀伤作用。方法应用基因重组技术 ,构建逆转录病毒载体GcTKpSN、GcpB7SN和GcTKpB7SN。以重组逆转录病毒感染细胞的培养上清液 ,感染大鼠乳腺癌细胞SHZ 88。经G4 18筛选阳性克隆并扩增后 ,给予GCV进行敏感性实验。将从正常SD大鼠脾细胞悬液中分离的T细胞 (CTL) ,与转染重组基因的乳腺癌细胞按不同比例共育后 ,进行细胞杀伤实验。结果　转染与未转染GcTKpB7SN基因的乳腺癌细胞相比较 ,前者对GCV的敏感性明显增强 (P <0 .0 1)。T细胞对经GcTKpB7SN基因修饰的乳腺癌细胞的杀伤作用 ,明显强于未转染Gc TKpB7SN基因的乳腺癌细胞 (P <0 .0 1)。结论　GCV对转染GcTKpB7SN基因的大鼠乳腺癌细胞具有体外杀伤作用。经GcTKpB7SN基因修饰的乳腺癌细胞 ,在体外能被T细胞杀伤。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因介导GCV治疗人膀胱癌的实验研究

探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes simplex virous thymidine kinase,HSV-TK)基因介导的丙氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)系统对人膀胱癌细胞(T24)生长的抑制作用。利用电穿孔技术将携有HSV-TK基因的重组逆转录病毒载体(pLXSN-TK)导入包装细胞PA317,获得转染后的逆转录病毒包装细胞PA317／TK。将BALB／c裸鼠24只随机分为4组(每组6只),建立人T24裸鼠荷瘤模型。治疗1,2组分别瘤内注射病毒悬液或PA317／TK细胞后再经GCV处理。对照1,2组则分别瘤内注射等量生理盐水或：PA317／TK细胞后再经等量GCV或生理盐水处理。观察各组肿瘤体积和瘤重的变化;采用原位杂交技术分析HSV-TK基因在肿瘤组织中的表达;采用流式细胞仪技术(Flow cytometry,FCM)和末端脱氧核苷酸介导的X-dUTP缺口末端标记技术(Termininal deoxynucleofidyl trasferase-mediated dUTP nick end labelling technigue,TUNEL)检测膀胱癌细胞凋亡。结果表明：(1)逆转录病毒介导的HSV-TK基因在体内能转染T24细胞,联合运用GCV后,肿瘤的生长速度明显减慢;(2)HSV-TK／GCV治疗后膀胱癌细胞凋亡现象明显增强。以上结果提示T24荷瘤裸鼠内HSV-TK／GCV系统对T24细胞的生长有明显的抑制作用,且可能与细胞凋亡引起的“旁观者效应”有关。HSV-TK／GCV系统在人类膀胱癌治疗方面具有明显的临床运用前景。     

转染HSV-TK的内皮祖细胞的靶向血管新生治疗胶质瘤体内外实验

目的 探讨转染单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)靶向血管新生及对胶质瘤的治疗作用.方法 将转染HSV-TK的EPCs和脐静脉内皮细胞、U87与U251胶质瘤细胞,以不同比例混合,经更昔洛韦(ganciclovir,GCV)作用,观察其旁观者效应.将转染HSV-TK的EPCs经尾静脉注入裸鼠皮下胶质瘤模型,观察各组肿瘤体积的变化,免疫组化检测各组中血管情况.结果 转染HSV-TK的EPCs对内皮细胞与胶质瘤细胞的旁观者效应,呈现时间依赖性与细胞比例依赖性.静脉注射转染后的EPCs,对裸鼠皮下胶质瘤生长具有明显抑制作用,并抑制血管生成.结论 转染HSV-TK的EPCs可能通过靶向血管新生来抑制胶质瘤生长.     

HSV-TK/HSV-sr39TK基因工程T细胞的研制

目的：制备慢病毒载体为基础的野生型及突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK/HSV-sr39TK）基因工程T细胞（TK^＋T及sr39TK^＋T细胞）,观察给予前体药物丙氧鸟苷/无环鸟苷后小鼠T淋巴细胞对其敏感性及存活情况。方法：构建含HSV-TK/HSV-sr39TK及内部核糖体进入位点序列（IRES）和绿色荧光蛋白基因（GFP）的双顺反子慢病毒载体;采用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒转染293T细胞,收集病毒上清感染刀豆蛋白刺激的小鼠T淋巴细胞,给予不同浓度的前体药物GCV/ACV,用Cell Counting Kit（CCK-8）等方法检测T细胞的存活率。结果：转染293T细胞后,病毒滴度达10^6/U/ml以上;含不同启动子的病毒载体转染效率CMV〉PUB〉PGK,对小鼠T淋巴细胞的感染效率以CMV启动子最高;IC50值的测定显示sr39TK^＋T细胞对GCV和ACV的敏感性较TK^＋T细胞分别提高约2.5和17.4倍;ACV及GCV浓度在1～10μmol/Lsr39TK^＋T细胞活率下降最为明显,ACV组细胞存活率由（98.4±2.7）%下降为（49.9±5.9）%,GCV组由（97.9%±2.7）%下降为（33.7±5.3）%,P〈0.05,随ACV及GCV浓度的增加,细胞活率下降趋势有所减弱;TK^＋T细胞对GCV敏感,细胞活率由（97.9±2.7）%下降为（38.4±5.5）%,（P〈0.05）,对ACV不敏感,细胞活率由（98.4±2.7）%下降为（73.8±7.4）%,P〉0.05。结论：成功构建了HSV-TK/HSV-sr39TK基因工程T细胞,不同启动子对慢病毒载体在293T细胞的转染效率、转导自杀基因在T淋巴细胞内的表达均有影响;HSV-sr39TK^＋T细胞对GCV和ACV的敏感性高于TK^＋T细胞。     

单纯疱疹病毒载体用于基因治疗的研究进展

基因治疗（gene therapy）是向功能缺陷或病变的细胞及组织引入互补的正常基因或治疗性功能基因,使其表达而达到治疗疾病的方法。它是伴随着基因工程技术和分子生物学的发展而逐渐形成的一种新型“分子治疗”。单纯疱疹病毒在基因治疗方面有着很广泛的研究,首先它不论是在体外还是体内都是一个高容量,高效表达的载体,可以承载其他基因,同时,它所含的TK基因,可以辅助抗病毒药更昔洛韦（Ganciclovir,0CV）,用于肿瘤的治疗。本文将就这两个方面做一综述。     

单纯疱疹病毒载体用于基因治疗的研究进展

基因治疗(gene therapy)是向功能缺陷或病变的细胞及组织引入互补的正常基因或治疗性功能基因,使其表达而达到治疗疾病的方法。它是伴随着基因工程技术和分子生物学的发展而逐渐形成的一种新型“分子治疗”。单纯疱疹病毒在基因治疗方面有着很广泛的研究,首先它不论是在体外还是体内都是一个高容量,高效表达的载体,可以承载其他基因,同时,它所含的TK基因,可以辅助抗病毒药更昔洛韦(Ganciclovir,GCV),用于肿瘤的治疗。本文将就这两个方面做一综述。     

肝癌HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效策略

HSV-tk/GCV系统在临床当中的应用日趋完善,不仅应用范围越来越广泛,同时也逐渐成为了提高治疗效率的重要措施之一。但是伴随着临床应用资料的不断增加,HSV-tk/GCV系统也表现出一定程度上的缺陷,因此需要通过其他领域的共同研究对临床治疗方案进行改进与补充,将治疗效率进行强化与提高。目前的增效策略当中包括了亲和性的强化、表达水平的提高、免疫系统的协作、双自杀基因的联合使用、细胞周期的全面激活、各类肿瘤的治疗方案融合等内容。本次研究将针对HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统在肝癌当中的增效策略进行多重分析,同时对其未来的发展提出可行性建议。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因融合表达产物的免疫学 …

目的 研究ＴＫ基因在真核细胞中的表达。方法 应用已构建和表达的单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（ＨＳＶ－１ＴＫ）融合蛋白免疫兔制备抗ＨＳＶ－１ ＴＫ血清,并以免疫印迹法鉴定其特异性,以免疫荧光法检测ＨＳＶ－１ ＴＫ基因在转染人肝癌细胞系中的表达。结果 免疫印迹显示,自制和国外提供的抗ＴＫ兔血清,均能特异性地识别Ｍｒ约为９７０００的ＴＫ融合蛋白。免疫荧光染色得到的结果满意,而且自制抗血清的效价和染色强度均优     

AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究

目的探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷（HSV-TK/GCV）自杀基因系统体外靶向杀伤肝癌细胞效应。方法构建人AFP增强子驱动的pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,脂质体转染肝癌细胞,检测TK mRNA和蛋白表达,MTT法检测GCV对肝癌细胞的杀伤作用。结果成功构建pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,在AFP阳性HepG2细胞中检测到TK mRNA和蛋白表达,添加GCV可特异性地杀伤HepG2细胞,而AFP阴性的SMMC7721细胞生长不受影响。结论 AFP增强子驱动的TK/GCV自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞。     

不同启动子指导的HSV1-sr39TK/GCV系统对小鼠淋巴细胞的敏感性研究

目的观察慢病毒载体中不同启动子指导的突变型单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-sr39TK)基因在小鼠T淋巴细胞内的表达差异,并进一步比较对丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)的敏感性。方法用亚克隆技术将PCR扩增的HSV1-sr39TK基因分别连接至慢病毒载体不同启动子后,然后在HSV1-sr39TK基因后以内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites,IRES)连接绿色荧光蛋白(green fluorescent pro-tein,GFP)报告基因;采用三质粒包装系统包装病毒,将病毒感染刀豆蛋白A(concanavalin,ConA)激活的小鼠淋巴细胞,分别用流式细胞术、RT-PCR法鉴定HSV1-sr39TK和GFP基因在小鼠淋巴细胞的表达,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法观察感染不同病毒的淋巴细胞对前体药物GCV的敏感性。结果不同启动子指导的HSV1-sr39TK及GFP基因均可在小鼠淋巴细胞表达,巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子驱动表达能力最强,磷酸甘油激酶(phosphoglycerokinase,PGK)启动子最弱。感染含CMV启动子病毒的淋巴细胞对GCV的IC50值最小。结论在小鼠淋巴细胞内CMV启动子驱动的慢病毒载体HSV1-sr39TK基因表达最强,对前体药物GCV敏感性最高。     

Application of shRNA-containing herpes simplex virus type 1 (HSV-1)-based gene therapy for HSV-2-induced genital herpes

HSV-1-based vectors have been widely used to achieve targeted delivery of genes into the nervous system. In the current study, we aim to use shRNA-containing HSV-1-based gene delivery system for the therapy of HSV-2 infection. Guinea pigs were infected intravaginally with HSV-2 and scored daily for 100 days for the severity of vaginal disease. HSV-2 shRNA-containing HSV-1 was applied intravaginally daily between 8 and 14 days after HSV-2 challenge. Delivery of HSV-2 shRNA-containing HSV-1 had no effect on the onset of disease and acute virus shedding in animals, but resulted in a significant reduction in both the cumulative recurrent lesion days and the number of days with recurrent disease. Around half of the animals in the HSV-2 shRNA group did not develop recurrent disease 100 days post HSV-2 infection. In conclusion, HSV-2 shRNA-containing HSV-1 particles are effective in reducing the recurrence of genital herpes caused by HSV-2.     

All-trans retinoic acid enhances bystander effect of suicide-gene therapy against medulloblastomas

In our previous study we evaluated the antitumor effect of herpes simplex virus-thymidine kinase gene (HSV-tk) on human medulloblastomas (MBs) in a therapeutic delivery system using the immortalized neural stem cell (NSC) line C17.2. However, our findings indicated that the bystander effect between C17.2tk and Daoy MB cells was weak compared to the bystander effect between NSCtk and C6 glioma cells. Gap junction intercellular communication (GJIC) is the main mechanism mediating the bystander effect in HSV-tk gene therapy. All-trans retinoic acid (ATRA) has been shown to up-regulate the expression of Connexin43 and GJIC. In this study we investigated the synergistic effect of ATRA and HSV-tk gene therapy in the treatment of MBs. We found that the expression of Connexin43 in Daoy cells was significantly increased when cells were exposed to 3 μmol/l of ATRA (P < 0.05). After co-culturing C17.2tk cells with Daoy cells at different ratios ranging from 1:1 to 1:16, ATRA significantly increased the bystander anti-tumor effect compared to ATRA-untreated cells (P < 0.05). In intracranial co-implantation experiments, mice co-implanted with C17.2tk/Daoy cells and treated with a combination of ATRA and GCV had significantly smaller tumors compared to the animals treated with GCV alone (P < 0.05). Together, our results show that ATRA enhanced the tumoricidal effect in HSVtk/GCV suicide gene therapy against Daoy MB cells by strengthening the bystander effect in vitro and in vivo.     

PGK驱动逆转录病毒载体介导HSV-TK/GCV控制GVHD的研究

目的：研究磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子驱动的逆转录病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK／GCV）系统在小鼠异基因骨髓移植（allo-BMT）后能否减轻移植物抗宿主病（GVHD）。方法：将转HSV-TK基因的逆转录病毒感染供鼠（C57BL/6鼠）脾淋巴细胞，感染后细胞与供鼠骨髓细胞混合移植给Coγ7射线照射后的受鼠（BALB／c鼠）。移植后腹腔注射GCV，用药1周，按移植后首次给药时间，分为GCV0d组、GCV7d组、GCV12d组。观察移植后受鼠生存期、存活率、GVHD发生率及严重程度、T细胞免疫重建（CD3、CD4、CD8）及异基因嵌合等指标。结果：TK／GCV0d组、TK／GCV7d组小鼠平均生存时间分别为（26.90±4.88）d、（27.00±4.80）d，较TK／GCV12d组（21.504±3.26）d和移植对照组（15.10±O.43）d明显延长（P〈0.05），TK／GCV0d组与TK／GCV7d组之间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。对照组小鼠12～14d100％发生Ⅲ～Ⅳ级GVHD，实验组死亡小鼠有Ⅱ～Ⅳ级GVHD病理学改变，而长期生存小鼠仅出现Ⅰ～Ⅱ级GVHD。TK／GCV0d组、TK/Gcv7d组、TK／GCV12d组在移植后5、10、15d3个时间点检测CD4^＋ T细胞均高于对照组（P〈0.05），CD8^＋ T细胞均低于对照组（P〈0.05）。移植后30d检测10只受鼠异基因嵌合率均在95％～100％。结论：PGK启动子驱动的逆转录病毒载体介导HSV-TK／GCV系统能有效控制小鼠allo-BMT后GVHD，移植后早期预防性用药效果优于发生GVHD后治疗性用药。     

AFP启动子驱动的yCD/TK双自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的体内外研究

目的： 研究携带甲胎蛋白（AFP）启动子的酵母菌胞嘧啶脱氨酶/胸苷激酶（yCDglyTK）双自杀基因体内外靶向性杀伤肝癌细胞的效果和机制。方法: 构建携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因表达质粒。通过阳离子脂质体将携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因转染HepG2和SMMC7721细胞,用MTT法测定不同浓度氟胞嘧啶（5-FC）、更昔洛韦（GCV）及联合治疗的杀伤作用,用流式细胞仪检测细胞周期。建立裸鼠肝癌皮下种植瘤模型,观察自杀基因体内杀瘤效果以及细胞凋亡的情况。结果: 成功构建的携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因靶向性地在AFP阳性的HepG2细胞上表达,而AFP阴性的SMMC7721细胞无表达,GCV、5-FC及两者联合可有效抑制HepG2细胞生长,随药物浓度的增高而杀伤作用增强,药物间抑瘤效果比较是GCV＋5-FC＞5-FC＞GCV,而SMMC7721细胞的生长未受影响。体内实验可见GCV、5-FC及两药联合对转染后的HepG2细胞种植瘤有明显的抑制效果,并检测到明显的细胞凋亡,而对SMMC7721细胞种植瘤的生长无影响,种植瘤内极少凋亡细胞。结论: 携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因能有效地靶向性地杀伤AFP阳性的肝癌细胞,细胞凋亡可能是其杀伤的重要机制之一。     

Detection of lentiviral suicide gene therapy in C6 rat glioma using hyperpolarised [1‐13C]pyruvate

Hyperpolarised [1‐¹³C]pyruvate MRI has shown promise in monitoring therapeutic efficacy in a number of cancers including glioma. In this study, we assessed the pyruvate response to the lentiviral suicide gene therapy of herpes simplex virus‐1 thymidine kinase with the prodrug ganciclovir (HSV‐TK/GCV) in C6 rat glioma and compared it with traditional MR therapy markers. Female Wistar rats were inoculated with 10⁶ C6 glioma cells. Treated animals received intratumoural lentiviral HSV‐TK gene transfers on days 7 and 8 followed by 2‐week GCV therapy starting on day 10. Animals were repeatedly imaged during therapy using volumetric MRI, diffusion and relaxation mapping, as well as metabolic [1‐¹³C]pyruvate MRS imaging. Survival (measured as time before animals reached a humane endpoint and were euthanised) was assessed up to day 30 posttherapy. HSV‐TK/GCV gene therapy lengthened the median survival time from 12 to 25 days. This was accompanied by an apparent tumour growth arrest, but no changes in diffusion or relaxation parameters in treated animals. The metabolic response was more evident in the case‐by‐case analysis than in the group‐level analysis. Treated animals also showed a 37 ± 15% decrease (P < 0.05, n = 5) in lactate‐to‐pyruvate ratio between therapy weeks, whereas a 44 ± 18% increase (P < 0.05, n = 6) was observed in control animals. Hyperpolarised [1‐¹³C]pyruvate MRI can offer complementary metabolic information to traditional MR methods to give a more comprehensive picture of the slowly developing gene therapy response. This may benefit the detection of the successful therapy response in patients.     

HSV_1tk/GCV基因治疗系统的旁观者效应观察

探讨逆转录病毒 (retrovirus ,RV )载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV1 tk )基因转染 ,联合抗病毒药物核苷类似物羟甲基无环鸟苷 (ganciclovir,GCV )对人卵巢上皮癌细胞系TYK细胞杀伤过程中所产生的旁观者效应。采用脂质体介导法将PLNTK5质粒转入包装细胞PA317后 ,以滴度最高的PA317病毒上清液感染TYK细胞 ,遗传霉素G418筛选后 ,得到带有HSV1 tk基因的TYK细胞。将细胞按不同比例混合培养后 ,给予 10 μg/mlGCV ,4d后用MTT法计算细胞存活率 ,观察旁观者效应。PLNTK5质粒成功转入PA317细胞 ,病毒滴度最高者为 6× 10 5cfu/ml。用病毒上清液感染TYK细胞 ,成功地得到了表达HSV1 tk的卵巢癌细胞株TYK/tk。混合培养结果显示 ,TYK/tk细胞占混合细胞 10 %时 ,低浓度的GCV就可使一半以上的细胞杀死 ,证明了HSV1 tk/GCV治疗方法存在着旁观者效应。逆转录病毒可介导HSV1 tk基因转入TYK细胞并获稳定表达 ,HSV tk/GCV系统存在旁观者效应。