人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的改进

目的：对人骨髓间充质干细胞(Mesenchvmal stem cells，MSCs)的体外分离纯化、培养扩增方法的改进，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础方法：抽取人骨髓细胞，采用密度梯度离心结合贴壁培养法进行分离纯化，并传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，流式细胞仪检测其表面抗原表达。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，MSCs在含胎牛血清的L—DMEM培养液中生长性状相对稳定，细胞基本呈成纤维细胞样生长，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，贴壁存活率高，表达CD29、CD44、CD105、CD166。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，在含胎牛血清的L-DMFM培养液中，细胞稳定扩增。     

不同分离及培养方法对大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖和生物学特性的影响

目的 探讨获得大量、高纯度、高活性骨髓间充质干细胞(BMSCs)的有效途径.方法 用密度梯度离心法和贴壁法分离纯化BMSCs,在无血清、含小牛或胎牛血清以及不同体积分数的胎牛血清的培养基中培养,传代扩增,观察各组细胞形态、生长特性,测定生长曲线,免疫细胞化学染色鉴定表面抗原,电镜观察细胞显微结构.结果 密度梯度离心法可获得较纯的原代细胞,但细胞增殖缓慢,容易老化;贴壁法分离的细胞生长增殖迅速,经传代换液,第4代细胞基本纯化;小牛和胎牛血清均能促进BMSCs生长增殖,但在体积分数为0.12的胎牛血清中集落形成率最高(46.50%);细胞表达CD44、CD90,而CD14、CD45阴性;电镜下BMSCs符合干细胞的一般特性.结论 经多次换液、严格控制传代消化时间(2～3 min)和酶浓度(2.5 g/L),采用贴壁纯化法在含体积分数为0.12的胎牛血清L-DMEM培养液中培养可获得大量、高纯度、高活性的BMSCs.     

全骨髓法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

目的建立一种体外纯化及培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（MsCs）的简便有效方法。方法全骨髓法分离培养SD大鼠MSCs,通过体外培养和连续传代达到纯化和扩增MSCs目的。倒置显微镜下观察细胞形态变化情况：利用四唑盐比色（MTT）法测定MSCs的生长曲线：流式细胞仪（FCM）鉴定MSCs膜抗原。结果SD大鼠胫骨全骨髓细胞在分离后与含10％优质胎牛血清DMEM培养基混合,约5-10min后即可见大量有核细胞贴壁,细胞形态为圆形,24-48h后可见贴壁细胞转变为椭圆形、多角形及短梭形,7-12d时细胞呈长梭形并达到90％单层融合。通过传代细胞进一步纯化及扩增。细胞传代后2d内处于潜伏期,3d后进入生长期,5d后进入平台期。FCM检测第4代MSCs膜表面抗原CD45、CD90、CD29阳性率分别为1．50％、99．18％、97．70％。结论SD大鼠全骨髓贴壁法能有效得到分离纯化的MSCs,用此方法培养的SD大鼠MSCs生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,可以为组织工程提供理想的种子细胞。为本实验研究打下基础。     

不同周龄大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的对比研究

目的：寻求大鼠周龄对骨髓间充质干细胞体外培养的影响,并进行细胞形态学观察和表面分子鉴定.方法：分别对1,4,8周龄SD大鼠采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记物.结果：全骨髓贴壁法能有效的获得大鼠骨髓间充质干细胞,以梭形细胞为主,细胞集落呈鱼群状或放射状排列.传代至第3代以后能获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,表面分子鉴定CD44、CD90呈阳性表达,CD34、CD45呈阴性表达.原代及传代细胞的融合时间相比较,小周龄BMSCs较大周龄BMSCs明显缩短.细胞培养达80％融合时间：原代细胞依次为（5±0.7）,（7.8±0.8）,（10.2±1.1）d,第3代细胞依次为（3.8±0.4）,（5.2±0.5）,（6±0.7）d,结果均有明显差异（P＜0.05）.结论：1,4,8周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞经多代传代培养后,1周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞较4周龄和8周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞能维持更好的细胞状态和细胞活性.应用1周龄SD大鼠进行全骨髓贴壁法分离体外培养骨髓间充质干细胞,能更经济、更快捷、更高效地为组织工程研究提供数量充足、状态良好的种子细胞.     

骨髓间充质干细胞培养条件的改良及其定向分化

目的：探讨建立大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs）快速、有效的体外分离纯化方法。方法全骨髓离心贴壁法分离大鼠BMSCs;分别采用同种异体血清培养基（同种异体血清组）、胎牛血清培养基（胎牛血清组）、无血清培养基（无血清组）培养BMSCs,传代后换用胎牛血清培养;12、24、48、72 h和5 d首次换液;绘制P3代BM-SCs生长曲线;免疫荧光鉴定BMSCs CD44和vimentin的表达;诱导BMSCs的骨向、内皮向分化;茜素红检测钙结节表达;免疫荧光鉴定血管内皮样细胞CD31和vWF的表达。结果（1）同种异体血清组及胎牛血清组细胞形态均一,生长速率相似。（2）P3代BMSCs生长曲线显示：同种异体血清组与胎牛血清组倍增速率相似,均快于无血清组。（3）P3代BMSCs免疫荧光染色显示：同种异体血清组与胎牛血清组CD44、vimentin表达均高于无血清组。（4）成骨诱导14 d后,茜素红染色可见大量橘红色钙化结节形成。（5）内皮诱导14 d后,内皮样细胞表面标志物CD31、vWF阳性。结论改良培养条件后所获得的骨髓细胞具有间充质干细胞的表型和功能特点。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养方法的研究

目的研究在体外培养和纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。方法采用改良全骨髓贴壁方法,分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs,镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD45和CD29的表达情况。结果原代培养的细胞呈圆形和梭形等,24 h后大部分细胞均贴壁。8～10 d可达80%～90%融合,纯化后传代周期为6～8 d。流式细胞术鉴定表明CD45阴性,CD29阳性。结论改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法。     

小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离扩增及鉴定

目的:探讨一种简单易行的的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)体外分离培养方法。方法:通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增小鼠BMSCs。观察原代及传代小鼠BMSCs形态变化,对第3代小鼠BMSCs表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106进行流式细胞仪检测。结果:小鼠BMSCs的原代接种培养24h后可见大量悬浮细胞,少许贴壁细胞,呈小圆形;72h后贴壁细胞逐渐增多,培养至第7天细胞伸展成长梭形,呈集落生长。BMSCs在培养的2～6d细胞增殖较慢,7～10d细胞增殖较快。传代后的小鼠BMSCs 24h基本全部贴壁,呈均匀性梭行细胞样生长。流式细胞仪检测结果显示:CD105、CD106表达阳性,表达率分别为92.2%、90.4%;CD34、CD45表达阴性,表达率分别为8.8%、13.1%。结论:采用全骨髓贴壁分离法操作简便,是培养小鼠BMSCs的理想方案。流式细胞术可以鉴定体外分离培养的小鼠BMSCs。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法。方法采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,进行形态学观察,绘制生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期、检测细胞表面抗原标志物,并进行成脂、成骨分化诱导。结果获取的BMSCs形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长。生长曲线呈S形,细胞周期显示86.02%P3代细胞为G0/G1期,保持活跃的扩增能力。BMSCs高表达CD44、CD90、低表达CD34、CD45。成脂诱导21 d后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成。结论全骨髓贴壁培养法可成功有效地分离培养BMSCs。     

骨髓间充质干细胞的培养及生物学特性

目的：分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,探讨其生物学特性,为组织工程和基因工程提供优势靶细胞。方法：全骨髓细胞贴壁法进行BMSCs的原代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测BMSCs表面抗原,MTT法检测BMSCs增殖能力,并绘制生长曲线。结果：原代培养24h后看见少量贴壁细胞,初起为小圆形,3d后可见梭形类似成纤维细胞,呈漩涡样生长,传3~6代细胞均一性良好,10代以后细胞逐渐有宽大梭形样变,增殖减慢,偶有细胞漂浮、死亡。流式细胞仪检测传3代细胞CD29表达率为92%,CD34几乎无表达。生长曲线显示,传3、6代BMSCs有较强的增殖能力,其中传6代细胞更为明显,传10代细胞的增殖能力较前有所减弱。结论：成功从大鼠骨髓组织分离、培养BMSCs,纯度高,生物学特性符合正常干细胞生长规律,是组织工程和基因工程理想的靶细胞。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的 建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,研究BMSCs的生物学特性,为后续细胞移植和基因治疗提供理想的种子细胞.方法 全骨髓贴壁培养法分离大鼠BMSCs,体外培养和连续传代,在倒置相差显微镜下连续观察细胞的形态变化,利用MTT法测定其生长曲线,流式细胞仪鉴定其表面抗原,成...     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与原代培养

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的体外分离与原代培养过程中应注意的问题。方法全骨髓贴壁培养筛选法分离和培养大鼠BMSCs,通过不断换液及传代纯化培养的细胞。结果大鼠BMSCs传至P3代后,形态为均匀分布的梭形成纤维样细胞。结论全骨髓贴壁培养筛选法操作简便,需要的骨髓量少,原代培养时更符合细胞生长的微环境,是培养大鼠BMSCs的理想方案。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定及BrdU标记的体外研究

目的：拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：密度梯度离心和贴壁培养相结合,台盼蓝染色观察离心后细胞活性,绘制BMSCs生长曲线,流式细胞仪检测BMSCs表面标记。诱导传代细胞向成软骨细胞分化,2周后免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达和阿尔新蓝染色检测蛋白多糖的表达。BrdU标记BMSCs,观察最佳标记率及标记时间,并予四甲基偶氮唑盐方法测定标记后细胞活性。结果：密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的BMSCs,分离后细胞活性均大于99%,BMSCs表面标记CD90、CD45、CD34阳性细胞表达分别为99.24%、0.03%、1.37%,BMSCs的生长曲线呈S形。成软骨诱导2周后Ⅱ型胶原免疫组化阳性,阿尔新蓝染色细胞基质被蓝染。BrdU标记后,MSCs标记率〉95%,BrdU细胞标记最佳时间为48 h,最佳浓度为10 mg/L,标记后细胞活性高。结论：采用密度梯度离心和贴壁培养相结合,可获得纯度较高BMSCs;BrdU是一种简单、有效的标记BMSCs的方法,BrdU对细胞标记率高。     

大鼠骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的：比较4种培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生长与增殖性差异。方法采用密度梯度离心法提取大鼠BMSCs ,分别在DMEM-LG培养基、DMEM/F12培养基、DMEM-LG＋10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF）与DMEM/F12＋10 ng/mL bFGF培养条件下贴壁培养,观察各代细胞的形态特征,绘制第4代细胞的生长曲线,利用流式细胞仪对各培养条件下的BMSCs进行细胞表面标志CD45、CD29和CD90的检测。结果不同培养条件下的 BMSCs 生长速度不同。加入 bFGF 培养条件下细胞增殖速度较单用 DMEM -LG 或DMEM/F12培养条件下更快（P＜0．05）。 DMEM-LG＋10 ng/mL bFGF的培养效果最佳,细胞密度高,生长状态良好。4种条件下培养的细胞均阳性表达CD29及CD90,阴性表达CD45。结论短期培养过程中加入bFGF不引起BMSCs分化,DMEM-LG＋10 ng/mL bFGF是较理想的BMSCs培养条件。     

差速贴壁法纯化分离GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞

目的运用差速贴壁法分离纯化绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠骨髓问充质干细胞（BMSCs）。方法分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中,分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、9．4h和48h进行首次全量换液,培养3d后按细胞类型对贴壁细胞分别计数,并用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。另外,选4h、8h、9．4h后换液的细胞进行传代培养,传至第5代,计算扩增倍数,用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。结果随着首次换液时间的延长,贴壁细胞密度增多,BMSCs的比例减少。首次换液时间在接种后2h的细胞纯度高,但细胞密度低;24h后的细胞密度高而纯度低;8h后的细胞密度大具有较高的纯度。传代后的GFP转基因小鼠BMSCs能稳定表达GFP。结论差速贴壁法能有效分离纯化GFP转基因小鼠BMSCs,首次换液时间在接种后8～10h时的传代细胞纯度高,具有扩增能力,可作为组织工程和基因治疗研究的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的:培养符合实验要求的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并进行鉴定,为进一步的研究打基础.方法:分别采用全骨髓贴壁培养法和密度梯度离心法培养大鼠骨髓间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察,并应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD29、CD90以及CD11b进行表型鉴定.结果:两种方法培养的细胞均为成纤维样细胞,呈集落式生长,全骨髓培养法培养的BMSCs表达CD34-(95.4%),CD44+(94.2%),CD45-(91.6%),CD29+(93.8%),CD90+(98%),CD11b-(87.6%),梯度离心法培养的BMSCs表达CD34-(96.9%),CD44+(97.3%),CD45-(97.5%),CD29+(99.4%),CD90+(99.8%),CD11b-(96%).结论:两种方法均可分离培养出较纯化的BMSCs,但全骨髓贴壁培养法简单易行,原代培养周期较短.     

血清量及首次换液时间对荧光小鼠骨髓基质细胞体外增殖的影响

目的研究不同量的血清及首次换液时间对荧光小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)体外增殖的影响。方法转基因荧光小鼠BMSCs取材后种植于24孔培养板中,分别用含10%、20%、30%胎牛血清的DMEM/F12混合培养基常规培养。于4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h、72h首次全量换液,观察其生长情况,用CD44、CD54、CD45抗体对10%、20%胎牛血清传代培养至第5代的细胞进行免疫细胞化学染色。结果BMSCs在含10%、20%胎牛血清的DMEM/F12中生长较好,原代培养的细胞其贴壁细胞数随首次换液时间的延长而增多,但纯度下降。首次换液时间相同而培养液血清含量不同的两组细胞免疫组织化学染色的阳性率差别无显著性(P>0.05),CD44和CD54抗体反应的阳性率随着首次换液时间的延长而逐渐降低,CD45抗体反应的阳性率则随首次换液时间的延长而逐渐升高。结论贴壁分离纯化对转基因荧光小鼠的BMSCs体外培养有效,其体外培养适宜的血清体积分数为0.1～0.2,首次换液时间以8h时为佳。     

小分子化合物诱导骨髓间充质干细胞类神经分化的实验研究*

目的 探讨小分子化合物组合（Forskolin、SB431542、DMH1、CHIR99021）诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）类神经分化的可行性。方法 全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs,流式细胞仪鉴定细胞。培养细胞至第3代,以含有Forskolin的神经元培养基预诱导1?d,再以含有Forskolin、SB431542、DMH1、CHIR99021的神经元培养基正式诱导3?d。以神经元培养基为对照组。通过观察细胞形态、免疫荧光检测、Western blotting技术对类神经分化细胞进行鉴定。结果 大鼠BMSCs以梭形细胞为主,可见长短不一的突起;经流式细胞仪鉴定,CD90、CD105表达呈阳性,而CD34和CD45表达呈阴性。诱导后,细胞有神经样形态改变,免疫荧光检测到神经元特异性烯醇化酶（NSE）、巢蛋白（Nestin）阳性表达,诱导3?d后Western blotting显示实验诱导组与对照组比较,NSE、Nestin和SOX1表达增多（P?<0.05）。结论 小分子化合物组合（Forskolin、SB431542、DMH1、CHIR99021）可诱导BMSCs类神经分化。     

全骨髓贴壁培养兔骨髓间充质干细胞的初步研究

目的：探讨兔骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复骨缺损的可能性。方法：选取2月龄约2．5kg重健康新西兰兔8只,采用全骨髓贴壁培养法体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,通过倒置相差显微镜观察、MTT检测、细胞贴壁率检测观察细胞生物学特性。结果：全骨髓贴壁培养法培养出的原代骨髓间充质干细胞活力良好,细胞数量经传代后扩增,且细胞纯度提高,但细胞扩增速度较慢。结论：全骨髓贴壁培养法简便易行,能有效的在体外获得原代骨髓间充质干细胞。所提取的细胞活性良好、纯度较高,能用作组织工程种子细胞治疗骨缺损。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。