丙型肝炎病毒核心基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达

目的构建HCV C基因重组腺病毒，以期用于HCV C蛋白的功能研究。方法以含有丙肝病毒1b亚型核心基因的质粒pcDNA3.1／HCV-C为模板，PCR扩增HCV C基因，PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上，与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组，获得重组腺病毒质粒pAd-C，PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装，获得重组腺病毒Ad-C，继之在293细胞内扩增，利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率，Western blot检测HCV C蛋白的表达。结果PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒Ad-C构建成功。结论成功构建了重组腺病毒Ad-C，为进一步研究核心蛋白的生物学功能奠定了基础。     

小鼠GITRL基因腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建重组腺病毒pAdEasy-GFP-GITRL,并测定病毒滴度。方法:从PIRES-GITRL载体上用BglⅡ和SalⅠ双酶切,回收目的基因GITRL,插入同样用BglⅡ和SalⅠ双酶切的穿梭质粒pAdtrack-CMV中,将线性化穿梭质粒骨架质粒pAdEasy-1共转染BJ5183菌,鉴定正确后,将重组腺病毒载体pAdEasy-GFP-GITRL转染HEK293细胞,以包装出完整腺病毒。TCID50法测定重组腺病毒滴度,Western blot法检测GITRL蛋白表达。结果:成功构建小鼠GITRL基因的重组腺病毒载体(pAdEasy-GFP-GITRL),经包装后获得高滴度表达GITRL基因的重组腺病毒,病毒滴度为2.0×109pfu/mL。Western blot结果显示重组病毒载体能表达GITRL蛋白。结论:重组腺病毒表达载体(pAdEasy-GFP-GITRL)的成功构建及重组腺病毒的获得为GITRL基因干预治疗奠定了基础。     

人TH基因重组腺病毒的构建及生物学活性研究

将人酪氨酸羟化酶cDNA表达盒克隆于质粒型腺病毒载体p△Elsp1A，得到重组质粒pAd－TH。随后用脂质体法将重组质粒pAd－TH和拯救型腺病毒质粒pBHG11一起共转染293细胞，通过体内同源重组生成重组腺病毒AdCMVth，THcDNA重组进入腺病毒E1区并受CMV启动子控制。采用形态学、病毒核酸酶切和PCR／RT－PCR等方法进行鉴定正确。重组腺病毒滴度达到1010pfu／ml。初步结果表明，该重组腺病毒感染MN9D细胞后可使细胞内多巴胺水平增加1倍，显示出明显的TH生物学活性。提示TH重组腺病毒AdCMVth可作为高效的基因转移载体用于帕金森氏病基因治疗。     

人EPO基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:制备表达人促红细胞生成素基因(hEPO)的重组腺病毒。方法:将hEPO基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带hEPO基因的重组腺病毒载体。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装、扩增出重组腺病毒,氯化铯梯度离心法进行纯化,PCR和电镜负染鉴定重组腺病毒,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并检测重组腺病毒的滴度。继而用纯化的重组腺病毒感染HeLa细胞,测定转染效率,以Western blot检测hEPO蛋白的表达。结果:成功构建了携带hEPO基因的重组腺病毒载体pAd-hEPO,PCR、透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功,并且具有感染力,病毒的滴度可达1.8×1010pfu/mL。Western blot检测表明RAd-hEPO感染的HeLa细胞中hEPO基因能够有效表达。结论:制备的RAd-hEPO可成功表达hEPO基因,为后续开展RAd-hEPO治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。     

鼠A20基因的腺病毒载体构建及耳蜗毛细胞表达

目的 构建鼠锌指蛋白A20基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠耳蜗毛细胞的感染情况.方法 采用基因工程技术,经亚克隆后将A20基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染HEK293细胞包装、扩增,将重组腺病毒感染耳蜗毛细胞.PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因对病毒滴度和感染情况进行监测.结果 酶切鉴定及PCR结果表明A20基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5×109pfu/mL,并对耳蜗毛细胞有很强的感染能力.结论 应用细菌内同源重组法成功构建了含鼠A20基因的重组腺病毒载体.     

汉滩病毒G1S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G1片段与S基因0.7kb片段嵌合基因的重组腺病毒。方法构建含有汉滩病毒G1S0.7嵌合基因的转移载体pShuttle-G1S0.7,然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连,电转化E.coli JM109,获得重组腺病毒Adeno-G1S0.7 DNA,转染HFX293细胞得到重组腺病毒。进一步对重组腺病毒的滴度和表达产物进行鉴定。结果构建的含G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒,滴度可达10^13～10^15 PFU／L;该重组腺病毒感染Vero-E6细胞后,表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1的特异性单抗（mAb）所识别的融合蛋白。结论利用腺病毒表达系统,成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G1生物学活性的融合蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

人NR4A1基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的:克隆人NR4A1基因,构建其重组腺病毒载体。方法:用RT-PCR的方法从人卵巢组织中扩增NR4A1基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdtrack-NR4A1。PmeI酶切pAdtrack-NR4A1,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdtrack-NR4A1转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。PacI酶切线性化重组质粒AdCMV-NR4A1后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。通过GFP报告基因观察重组病毒的产生。PCR、Western blot检测NR4A1基因的表达。结果:用RT-PCR方法,从人卵巢组织中扩增出1797bp的cDNA,测序证实为人NR4A1基因。构建了NR4A1基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论:成功地克隆了人NR4A1基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究NR4A1基因在相关疾病中的作用奠定了基础。     

重组人肝细胞生长因子-NK4腺病毒的制备及初步鉴定

目的制备表达人肝细胞生长因子（HGF）-NK4蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法酶切pcDNA3-hNK4质粒获得NK4基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrack—CMV—NK4载体，线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183，通过同源重组得到重组pAd—NK4病毒载体。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒，用病毒悬液感染人肝癌细胞株HepG2。RT—PCR法检测感染肿瘤细胞中NK4mRNA表达。结果酶切鉴定得到阳性pAd—NK4重组腺病毒载体，该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装。在转染2d后能观察到绿色荧光蛋白（GFP）表达。制备的Ad—NK4在体外能有效感染HepG2细胞并获得NK4基因高水平表达。结论成功构建了NK4基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒，为进一步研究NK4基因的功能及应用NK4进行基因治疗提供实验依据。     

人NRAGE基因重组腺病毒载体的构建及其对293细胞细胞周期的影响

目的构建hNRAGE基因的重组腺病毒载体,并研究其对293细胞细胞周期的影响。方法采用PCR方法扩增hNRAGE基因片段,并亚克隆至腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdTrack-CMV/hNRAGE。经测序检测后,用PmeI酶切使pAdTrack-CMV/hNRAGE被线性化,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电穿孔法共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组。经PacI酶切鉴定后,用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组体腺病毒Ad-hNRAGE颗粒。利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中GFP报告基因的表达,观察重组腺病毒的产生,测定病毒颗粒的浓度。用Western blot检测目的基因的表达。采用MTT法检测293细胞的活力,用流式细胞术分析hNRAGE基因对293细胞周期的影响。结果成功地构建hNRAGE重组腺病毒载体。Western blot检测结果证实,hNRAGE基因可在293细胞中表达。收获病毒后,经测定病毒颗粒的浓度大约为6.5×109个/μL。转染了重组腺病毒Ad-hNRAGE的293细胞与正常细胞相比较,增殖率显著降低,G0-G1和G2-M期的细胞增多,S期的细胞明显减少。结论hNRAGE基因可能有抑制293细胞生长的作用。     

人IL-16基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定人白细胞介素16(IL-16)的重组腺病毒pAd-IL-16表达载体,为进一步研究IL-16功能奠定基础。方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),组胺刺激后提取总RNA,RT-PCR扩增IL-16基因,将其克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAd-IL-16,转染HEK293T细胞包装病毒。荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,RT-PCR和Western blot分别分析细胞内IL-16 mRNA和蛋白质的表达。结果:经双酶切及基因鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见约400bp插入片段,测序结果和GenBank中的基因序列一致;重组病毒效价为2.8×108pfu/mL;重组病毒感染后,HEK293T细胞中IL-16 mRNA和蛋白质均有表达。结论:成功构建IL-16重组腺病毒载体,并可在HEK293T细胞中表达,为进一步研究IL-16的功能奠定了基础。     

TR基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :构建含人硫氧还蛋白还原酶 (TR)基因的重组腺病毒载体 ,探讨TR的抗氧化功能与神经退行性疾病的相关性。方法 :从重组质粒pGEM TR上用内切酶切下编码 5 0 0个氨基酸的全长TRcDNA片段 ,并连接穿梭质粒pShuttle,再双酶切pShuttle TR。将带有CMV启动子的目的片段 ,插入E1、E3缺失的Adeno X病毒DNA中 ,以Adeno TRDNA通过脂质体转染HEK2 93细胞 ,获得重组腺病毒Adeno TR进行PCR鉴定及病毒滴度测定。用重组腺病毒感染CV1细胞 ,通过免疫荧光染色与Westernblot分别检测重组腺病毒感染的细胞上和裂解液中TR蛋白的表达。结果 :重组腺病毒Adeno TR的病毒滴度为 4 .4× 10 11pfu/L。PCR、荧光显微镜证实 ,以及Westernbolt分析 ,在相对分子质量 (Mr)约 5 5 0 0 0处均出现特异性条带。结论 :成功地构建了重组腺病毒载体 ,并能介导外源基因TR表达 ,为进一步研究TR的功能及其与疾病的相关性奠定了基础。     

弹性蛋白酶特异性抑制因子elafin基因重组腺病毒载体的构建、鉴定与表达

目的：构建elafin基因高效表达重组腺病毒载体Ad-elafin。方法：抽提人肺总RNA进行逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）扩增elafin基因，PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上；在BJ5183细菌内与pAdEasy-1同源重组，筛选阳性克隆，酶切、PCR及测序鉴定；PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装，获得腺病毒载体Ad-elafin；继之在293细胞内扩增，利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率，Western blot检测elafin蛋白的表达，ELISA鉴定elafin蛋白对弹性蛋白酶活性拮抗作用。结果：酶切、PCR、蛋白表达测定及拮抗弹性蛋白酶活性初步鉴定证实弹性蛋白酶特异性抑制因子elafin基因重组腺病毒载体Ad-elafin构建成功。结论：成功构建了重组腺病毒载体Ad-elafin，为进一步深入研究慢性阻塞性肺疾病的发病机制奠定了技术基础。     

诺如病毒衣壳蛋白重组人3型腺病毒的构建

目的 制备表达诺如病毒衣壳蛋白的重组人3型腺病毒.方法 将诺如病毒衣壳蛋白基因(Noro-orf2)克隆到腺病毒穿梭载体pBSE3CMV-egfp上,与线性化人3型腺病毒骨架质粒pBRAdv3共电转化感受态大肠杆菌BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,带Noro-orf2基因的表达框置换腺病毒E3区,PCR及酶切筛选得到重组腺病毒质粒,将重组腺病毒质粒转染Hep-2细胞进行包装,获得感染性的重组腺病毒粒子,免疫组化分析重组腺病毒中诺如病毒衣壳蛋白的表达.结果 同源重组后经酶切和PCR鉴定证明插入Noro-orf2基因的重组腺病毒质粒pBRAdv3E3dNor成功构建,并经转染包装得到高滴度的重组腺病毒Adv3E3dNor,免疫组化证明诺如病毒衣壳蛋白得到表达.结论 成功构建表达诺如病毒衣壳蛋白的重组3型腺病毒Adv3E3dNor,为研制人3型腺病毒-诺如病毒双价疫苗奠定了基础.     

1人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体.方法 以pUCm-TLR4质粒为模板,运用PCR技术扩增TLR4胞外区目的 基因片段,片段回收后经酶切连接穿梭质粒pAdTrack-CMV上,获得重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-TLR4.通过Kpn Ⅰ和HindⅢ双酶切,测序鉴定后,将鉴定正确的质粒经PmeⅠ酶切线性化后,转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态细菌BJ5183中,进行同源重组,卡那抗性筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR技术,Western blot等方法鉴定重组腺病毒,并进行病毒滴度测定.结果 人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体构建正确,病毒滴度为3.2×109pfu/mL.结论 成功构建了人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体,为下一步实验奠定基础.     

人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能。方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3. 1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共同转化大肠杆菌。以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒。采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Westernblot检测TSLP蛋白的表达。结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染 293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因,病毒的滴度可达 1×1011pfu/L。Westernblot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达。结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒。所制备的Ad -TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础。     

大鼠Toll样受体2基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建特异性抑制大鼠TLR2基因的重组腺病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中进行功能鉴定。方法:体外合成3对大鼠siTLR2的双链DNA序列,经退火定向克隆到穿梭质粒pSES-HUS中获得pSES-HUS-siTLR2质粒,Pme I线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒进行同源重组获得pAd-siTLR2质粒,脂质体转染HEK293细胞,包装获得Ad-siTLR2腺病毒颗粒,继而感染PC12细胞,通过Real-time PCR和Western blot方法检测3对siRNA对TLR2基因的抑制效率。结果:PCR凝胶电泳和测序结果均证实目的基因正确克隆到腺病毒载体中;Real-time PCR和Western blot结果显示:携带siTLR2的病毒颗粒能够在mRNA和蛋白水平有效抑制PC12细胞中TLR2的表达。结论:成功构建了Ad-siTLR2重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,转染PC12细胞后能有效抑制TLR2基因的表达,为进一步研究TLR2在不同疾病中的免疫调节机制奠定重要基础。     

腺病毒介导noggin基因修饰神经干细胞

目的:以重组腺病毒介导的noggin基因修饰小鼠海马源性神经干细胞,为基因修饰的神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病提供依据。方法:以重组腺病毒介导的noggin基因转染体外培养的神经干细胞,MTT法检测转染前、后神经干细胞的生长活性,应用免疫细胞化学及Western blot检测转染后Noggin蛋白在神经干细胞中的表达及noggin基因对神经干细胞定向分化的影响。结果:重组腺病毒pAdEasy-1-noggin转染神经干细胞后,神经干细胞中Noggin蛋白表达持续增加;转染后的NSCs在含血清的培养液中能定向分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,并且其分化为神经元的数量明显增加。结论:重组腺病毒介导的noggin基因在细胞中可持续稳定表达,noggin基因能够促进神经干细胞定向分化为神经元,抑制其向星形胶质细胞方向分化,为下一步进行神经干细胞体内移植治疗提供了实验依据。