快速方法检测耐利福平结核分枝杆菌基因突变的研究

目的建立快速诊断结核杆菌利福平（RFP）耐药的方法，探讨其临床应用价值。方法设计5条覆盖rpoB基因热点突变区域的MGB探针，结合实时PCR方法检测结核杆菌rpoB基因的点突变。结果50株临床分离结核杆菌菌株中，12株RFP耐药株，38株敏感株。双探针实时PCR方法检测结核杆菌13株检出rpoB基因突变，突变率占26％。531位点单突变11株，526位点单突变1株，531、526双位点联合突变1株。12株耐药株均检出rpoB基因突变。结论双探针实时PCR技术能快速、准确地检测结核杆菌rpoB基因位点的突变，可用于临床对结核杆菌RFP耐药的快速诊断。     

焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒多个基因型耐药突变方法的建立及初步评价

目的建立焦磷酸测序(Pyrosequencing,PyroS)法检测HBV反转录酶基因区(rt区)与核苷(酸)类似物(NAs)耐药相关基因突变的检测方法。方法针对HBVDNArt区10个已知常见耐药突变位点的12种突变形式,分别构建野生型和突变型质粒作为标准品;设计通用PCR扩增引物和针对不同突变位点的焦磷酸测序引物,建立基于PyroS技术的HBV耐药突变检测方法。分别采用传统的双脱氧测序法和我们构建的PyroS法对接受/未接受NAs治疗的慢性乙型肝炎患者95份血清标本进行检测比较,并采用克隆测序法进行结果验证。结果 1.构建了HBVrt区常见耐药突变的野生株和变异株标准质粒,并建立了能对12种常见NAs耐药突变同时进行检测的PyroS方法;证实当标准质粒浓度≥1000拷贝/mL时,PyroS法对耐药突变位点的检出率、特异性和重复率均可达100%;2.对95份临床血清标本共检测了950个耐药相关氨基酸置换位点,PyroS法检测结果与直接测序法相符位点939个(符合率98.84%),PyroS法较直接测序法多检出8份标本中共11个变异位点,克隆测序法证实了焦磷酸测序法结果。结论成功建立了能同时定量检测10个已知NAs相关耐药基因突变的PyroS技术,可用于临床抗病毒疗效的监测、及早发现基因型耐药突变,并指导治疗方案的及时调整。     

青少年发病的成人糖尿病7型新突变的可能位点

目的通过对一个高度怀疑为青少年发病的成人糖尿病7型(MODY7)家系进行信息收集及基因检测,寻找其基因突变位点,并探讨其临床特点。方法对1例病程20年、长期胰岛素治疗但血糖控制不佳、无酮症倾向、有3代糖尿病家族史的28岁女性患者进行基因检测,发现其携带KLF11基因变异,遂对其家系进行调查,收集家庭成员相关临床资料,并进行致病基因检测。基因检测方法为:首先对先证者采用芯片捕获高通量测序方法寻找致病基因,然后使用Sanger测序技术验证基因突变位点,并对其他家系成员使用Sanger测序技术筛查有无相同基因突变位点。结果该家系共检出2例成员存在KLF11基因杂合突变c.920C>T(编码区第920号核苷酸由胞嘧啶变异为胸腺嘧啶),导致氨基酸改变p.P307L(第307号氨基酸由脯氨酸变异为亮氨酸),为错义突变。这与其临床被诊断为糖尿病相符合。结论本研究的家系为KLF11基因c.920C>T(p.P307L)错义突变导致糖尿病家系,该突变位点可能是MODY7新突变位点。     

临床分离耐氟喹诺酮金黄色区区球菌的耐药机制研究

为了解临床分离金黄色葡萄球菌（金葡萄）对氟喹诺酮类药物的耐药机制。应用聚合酶链反应－限制性片段长度多生（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）分析和ＰＣＲ－边构象多太分析（ＳＳＣＰ）技术及利血平逆转实验，分别检测３１株临床分离耐环丙沙星金谋略 株ｇｙｒＡ基因的突变及ｎｏｒＡ基因的表达。结果表明，３１菌中２２株检出ｇｒｙＡ基因８４位点突变，有２８株在得血平逆转实验中对环丙沙星和诺氟沙星的ＭＩＣ同时降低，表明存在 ｏｒＡ     

658例乙型肝炎患者HBV多位点耐药基因检测结果分析

目的分析乙型肝炎患者HBV核苷(酸)类似物耐药相关的10个位点的突变情况及其临床意义。方法采用焦磷酸测序法对658例各型乙型肝炎患者行核苷类似物抗乙肝病毒多位点耐药基因检测并分析不同核苷(酸)类似物耐药的突变形式,对常见突变模式者ALT和HBV-DNA水平进行比较。结果 300例发生不同位点变异,变异率为45.59%,其中有明确用药史者202例。拉米夫定耐药突变中以M204V和M204I最常见,前者通常伴随L180M突变,后者常单独出现;阿德福韦酯耐药中以N236T和A181位碱基替换为主;恩替卡韦耐药均伴随拉米夫定和阿德福韦酯耐药变异,以T184位点的碱基替换最为常见;主要变异模式间ALT及HBV-DNA水平均无明显差异。90例未接受过核苷(酸)类似物治疗者亦检出耐药相关突变。结论检测HBV多位点耐药基因相关突变有助于临床及时发现和确认乙型肝炎患者HBV耐药并指导抗病毒治疗。     

耐多药结核分枝杆菌基因突变分析

目的对临床分离的耐多药结核分枝杆菌株进行基因突变分析。方法对耐多药结核分枝杆菌临床分离菌株进行耐药基因的PCR检测,利用基因序列测定方法分析耐药基因突变情况。结果从耐多药结核病（MDR-TB）患者临床分离菌株中快速检测到rpoB、katG、rpsL、embB基因及其突变。耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测rpoB基因点突变,突变位点主要为第516、526和531常见密码子,1例MDR-TB出现第479位和第531位密码子同时突变。耐多药菌、全耐菌及单耐异烟肼的菌株均检测有katG基因点突变,突变位点均为第2066位碱基C突变为Go全耐菌和对乙胺丁醇（EMB）耐药的耐多药菌株均检测有embB基因点突变,突变位点均为第306位密码子ATG突变为ACG。全耐菌和对链霉素（SM）耐药的MDR-TB菌株均检测有rpsL基因点突变,突变密码子为CCT突变为CTT,其中从1株对SM敏感的MDR-TB中也检测到突变。全敏感株、标准株及利福平（RIF）、异烟肼（INH）或EMB敏感的耐药株均无rpoB、katG或embB基因突变。结论PCR及基因序列测定可快速检测耐多药结核基因,结核分枝杆菌耐多药性与多个基因突变相关。     

等位基因特异扩增实时定量PCR检测HIV的V106I耐药突变位点的方法建立

目的建立等位基因特异扩增实时定量聚合酶链式反应(ASPCR)检测艾滋病病毒(HIV)V106I耐药突变位点的方法,用于快速检测低比例的V106I突变。方法针对HIV的V106I多态性位点设计引物,建立检测方法。构建野生型和突变型质粒标准品,检测野生型质粒、突变型质粒和临床样本,评价方法的准确性、灵敏度和特异性。结果 5份接受抗病毒治疗的HIV感染者本底血清标本(2份存在V106I耐药突变位点,3份不存在V106I耐药突变位点),特异性引物扩增105野生型质粒和突变型质粒的循环阈值(Ct值)之差(△Ct)为10.26,ASPCR法能正确区分野生型和突变型质粒,临界值为9.26;对100%～0.01%的突变型质粒和野生型质粒混合物的检测显示,突变比例高于1%时得到相应的ΔCt值均9.26,根据标准曲线计算出的突变比例与理论值具有较好的吻合度,ASPCR法检测V106I突变的灵敏度可达到1%突变比例。结论建立的ASPCR方法可用于检测临床样本V106I耐药突变位点。     

乙型肝炎抗病毒治疗中的耐药基因突变检测技术

中国是乙型肝炎(乙肝)的高发国家,抗病毒治疗药物耐药突变的早期发现对于接受抗病毒治疗的乙肝患者至关重要。理想的临床检测方法应具有灵敏度高、特异性高、重复性好、检测结果准确、操作简单、通量高、价格适中以及能定量检测等特点,并可检出样本中的多种混合突变。本文根据上述临床需求,就近年来出现的一些乙肝耐药突变检测技术进行讨论,并介绍一种基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法的新检测技术。     

进行性假性类风湿样骨发育不良四个家系WISP3基因突变筛查

目的观察进行性假性类风湿样骨发育不良(progressive pseudorheumatoid dysplasia,PPD)患者的临床特征及影像学表现,并筛查致病基因WISP3的突变类型。方法抽取所有受试对象的静脉血5 m L,抗凝保存于-80℃冰箱,利用常规方法抽提基因组DNA。使用Sanger测序技术对4个家系的先证者致病基因WISP3进行检测,再对其父母亲进行突变位点检测。结果 4个家系先证者中均发现WISP3基因纯合突变或复合杂合突变,其中家系1中的突变位点p.Cys209Metfs X21、家系2突变位点p.Tyr116X、家系3突变位点p.Cys114Trp和家系4的突变位点p.Cys223Gly均为首次报道的新发现位点。结论 PPD是一种少见的常染色体隐性遗传性疾病,临床特点及典型的影像学表现有助于诊断。首次发现了WISP3基因4个新突变位点,开展WISP3基因检测有助于PPD确诊。     

广西地区壮族正常听力人群线粒体基因12S rRNA的突变研究

目的 研究广西地区壮族正常听力人群线粒体基因12S rRNA的突变携带率以及突变特点,为临床防聋及治聋提供参考。方法 采用晶芯十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒(微阵列芯片法)对广西地区150例壮族正常听力的受试者进行线粒体基因12S rRNA的2个突变位点检测,对确诊的阳性结果进行Sanger测序分析。结果 150例受试者中,检出线粒体基因12S rRNA 1555 A>G突变者1例(携带率为0.67%),经Sanger测序证实为1555 A>G突变,未发现1494C>T位点突变。结论 在广西地区壮族人群中开展线粒体基因12S rRNA突变筛查具有重要意义,可以为突变携带者及其母系亲属提供合理的用药指导、遗传咨询,是预防药物性聋的有效措施。