食品中空肠弯曲杆菌快速检测及计数方法

空肠弯曲杆菌是世界范围内引起人类急性腹泻的最常见的致病菌。传统的用于空肠弯曲杆菌检测及定量的培养法缓慢、需时长。因此 ,需要特异、敏感和快速的空肠弯曲杆菌检测方法 ,以收集足够的资料数据进行危险性评估及食品安全政策的制定。本文介绍了几种以PCR、DNA杂交、疏水栅滤膜筛选 (HGMFs)和酶免疫 (EIAs)为基础的快速方法。PCR方法检测目的菌为空肠弯曲杆菌 (C .jejuni) ,结合简单的样品制备过程 ,经 2 0～ 2 4h增菌培养 ,可从自然污染的鸡肉冲洗水中检测空肠弯曲杆菌少至每ml 0 3最大可能数 (MPN)。HGMF EIA方法采用市售空肠弯曲杆菌多克隆抗体 ,从加样的鸡肉冲洗水、牛奶及自然污染的鸡肉冲洗水中检测并计数嗜热性空肠弯曲杆菌。在HGMF DNA杂交方法中 ,利用一种C .jejuni特异性探针检测和定量食品中空肠弯曲杆菌。难以通过HGMF滤过的样品中的嗜热性空肠弯曲杆菌 ,可应用斑点EIA结合MPN ,进行定量检测     

应用多重PCR快速检测空肠弯曲菌

目的:建立能快速、特异检测空肠弯曲菌的多重PCR技术。方法:选用针对空肠弯曲菌外膜蛋白A(mapA)基因和马尿酸酶(hipO)基因的2对引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了鸡肉模拟样品检测。结果:该方法扩增目的基因片段分别为589 bp和323 bp,特异性和灵敏度均高。细菌纯培养物的检测灵敏度为105 cfu/ml,鸡肉模拟样品42℃预增菌36 h后检测灵敏度能达到101 cfu/ml。结论:初步建立能快速、灵敏、特异地测定空肠弯曲菌的多重PCR检测技术。     

应用PCR方法对生鸡肉中分离到的空肠弯曲菌进行鉴定

目的：对北京市市场销售的肉制品的空肠弯曲菌污染的状况进行调查,并建立快速的弯曲菌PCR鉴定的方法。方法：采用中国疾病预防控制中心下发的监测方法对北京市超市和集贸市场销售的鸡肉采集100件并进行检测,生化鉴定采用API Campy系统进行鉴定,同时采用针对空肠弯曲菌h ipO设计的引物对分离的弯曲菌进行鉴定。结果：共有4件检出空肠弯曲菌,采用PCR方法进行鉴定的结果与生化方法鉴定的结果一致。结论：在北京销售的鸡肉中存在空肠弯曲菌的污染,带菌率为4%,针对h ipO设计的引物可以对空肠弯曲菌进行快速鉴定。     

沈阳市零售肉类中弯曲杆菌污染状况调查

目的了解大都市不同类型市场零售肉类弯曲杆菌污染状况。方法2003年1月~12月每月从沈阳市超级市场、农贸市场、街边市场采集零售生肉类样品,包括鸡肉、鸭肉、兔肉、猪肉和牛肉,分离检测弯曲杆菌(Campylobacterspp),分析不同肉类、不同市场类型、不同季节污染状况,应用PCR方法鉴定弯曲杆菌种类及其血清型。结果123份鸡肉样品中94%检出弯曲杆菌,85份鸭肉样品受污染的占96%,65份兔肉样品占97%,猪肉和牛肉样品中的污染相对较少,138份猪肉样品中占31%,89份牛肉样品中占35%。200份肉类样品共分离到弯曲杆菌525株,其中55%是空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni),41%是大肠弯曲杆菌(Campylobactercoli),4%是其他类型的弯曲杆菌。结论超市样品弯曲杆菌污染率最低,街边市场销售的肉类污染率最高;零售肉类弯曲杆菌污染水平高于国外相关报道,应引起重视。     

空肠弯曲菌多重PCR快速检测方法建立的研究

[目的]建立一种能够快速检测鉴别样品中的空肠弯曲菌的多重PCR方法。[方法]根据空肠弯曲菌hipO、mapA、23S等基因序列,利用Primer Premier 5.0和Oligo 6软件设计了多对特异性引物,经过优化筛选出最佳引物组合,再对引物的浓度、Mg2 浓度、退火温度等条件进行优化后,建立了从样品中快速检测鉴别空肠弯曲菌的多重PCR方法。[结果]实验结果显示本方法的特异性较强,灵敏度高,达到15 cfu/ml。[结论]多重PCR方法对于样品中空肠弯曲菌的检测实验周期短,灵敏度高,操作简便,适宜推广应用于各卫生单位日常对样品中空肠弯曲菌污染的快速检测。     

PCR技术快速检测空肠弯曲菌方法的建立

目的建立空肠弯曲菌的快速检测方法。方法用PCR法扩增标本菌株中弯曲菌属16SrRNA片段、空肠弯曲菌M apA片段和结肠弯曲菌CeuE片段,通过电泳后对产物进行分析。结果11份标本中有7份检出弯曲菌属16SrRNA片段,其中3份样品中检测到空肠弯曲菌M apA片段,4份样品中检测到结肠弯曲菌CeuE片段。结论PCR技术可用于空肠弯曲菌的快速检测。     

辽宁省首次在分割禽肉中分离出2株空肠弯曲菌

目的 2018年辽宁省食品污染和有害因素风险监测项目中首次在分割禽肉中分离出2株空肠弯曲菌。方法对6份分割禽肉进行选择性增菌后,采用直接滤膜法进行分离培养。对滤过的可疑菌落进行纯培养后,采用VITEK全自动生化鉴定系统及弯曲菌特异性微量生化补充试验联合多重PCR技术进行鉴定。结果从6份分割禽肉中(4份鸡肉、2份鸭肉)分离出2株空肠弯曲菌,并通过弯曲菌多重PCR技术进行鉴定,2株菌均证实为空肠弯曲菌。结论通过选择性增菌后直接滤膜法联合多重PCR技术,可以精准快速检测食源性弯曲菌污染,有助于从根本上预防控制弯曲菌引发的疾病。     

宿迁市肉鸡沙门菌和空肠弯曲菌污染状况调查

目的了解宿迁市肉鸡在屠宰和配送分销过程中沙门菌和空肠弯曲菌污染状况。方法采集肉鸡屠宰厂和配送分销过程中宰杀前活体、褪毛后整禽、预冷池等9类样品,检测沙门菌;其中对配送分销过程中采集的新鲜鸡肉样品检测空肠弯曲菌。结果沙门菌检出率为29.27%,以肠炎沙门菌和印地安纳沙门菌为主。空肠弯曲菌检出率为73.3%。结论肉鸡屠宰和配送分销过程中存在一定程度沙门菌和空肠弯曲菌污染,其中配送分销环节污染比较严重,应加强卫生监督管理。     

拟杆菌作为粪便污染指示微生物的初探

目的 通过外环境中拟杆菌属菌量与大肠菌群存活菌量之间的相关性分析,探讨拟杆菌作为粪便污染指示微生物,并采用实时荧光定量PCR实现快速检测的可能性.方法 用大肠菌群最大或然数(most probable number,MPN)计数法和实时荧光定量PCR法分别定时检测模拟水样中大肠菌群的存活菌量及拟杆菌属菌量,探讨二者的污染检出时限和相关性.同时分别检测在3个时间点采集4个位点的12份河流水样,比较二者的检出情况.结果 MPN计数法检测大肠菌群需要72 h,而实时荧光定量PCR法检测拟杆菌不超过3 h;室内外模拟水样大肠菌群污染检出时限分别为＞40 d和9 d,而拟杆菌的污染检出时限分别为13 d和5 d;室外模拟水样拟杆菌属菌量(从第1天的8.3×106拷贝/ml下降到第5天的小于检出限104拷贝/ml)和大肠菌群存活菌量(从第1天的大于4.3×106MPN/100 ml下降到第5天的2.4×103 MPN/100 ml)之间呈正相关;12份河水水样两种方法检出均为阳性,符合率为100%,均说明二者对粪便污染的检测结果具有很好的一致性.结论 拟杆菌有可能作为粪便污染的指示微生物,并通过实时荧光定量PCR实现快速检测.

Abstract：

Objective To explore the possibility of Bacteriodes spp. as fecal contamination indicator bacteria with real-time quantitative PCR (RT-PCR) assay through analyzing the correlation between Bacteriodes spp. and coliform group in external environment. Methods Quantity of coliform group and Bacteriodes in water samples were detected by most-probable-number method (MPN) and RT-PCR,respectively, and their detection correlation was evaluated with linear correlation analysis. Both methods were also applied to detect the contaminated time limits and river water samples collected at four sampling sites in three different times. Results Seventy two hours were needed for the numeration of coliform group with MPN method,while RT-PCR could detect Bacteriodes within 3 hours. The contaminated time limit of indoor and outdoor water samples of coliform group was more than 40 days and 9 days, and Bacteriodes 13 days and 5 days,respectively. Also,the positive correlation between the quantity of Bacteroides and coliform group in outdoor water samples was obtained,the quantity of Bacteroides was from 8. 3 × 106 copise/ml to less than 104 copise/ml during the first day to the fifth day,while coliform group was 4. 3 × 106 MPN/100 ml to 2.4 × 103 MPN/100 ml. A 100% coincidence rate of the detection results with both methods was also observed. These results indicated that the detection results of both methods had perfect consistency. Conclusion Bacteriodes spp. can be potentially used as fecal contamination indicator bacteria with RT-PCR rapid detection.     

空肠弯曲菌病与格林-巴利综合征

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)是弯曲菌属中主要引起人类感染的一个种,可定植于人的空肠、回肠和结肠,导致急性肠炎[1].C.jejuni的传染源主要是被污染的食物和水.未经消毒的井水或地面水、污染的牛奶、熟食通常是引起散发和暴发的主要原因.家畜、家禽是重要贮存宿主.粪-口是主要的传播途径;其感染率在欧美等发达国家居于细菌性食源性感染的首位.由于经济、气候、人口密度以及种族的差异,发展中国家的感染率明显高于发达国家,通常为发达国家的10～100倍,但患者的临床症状却要明显减轻.人类对C.jejuni普遍易感,感染者中男性约1.2～1.5倍于女性.从发病季节看,发达国家C.jejuni暴发多发生在春季和冬季,散发病例有夏季高峰,而发展中国家检出率夏秋季明显增高[2].本文对C.jejuni与空肠弯曲菌病导致格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)的病原学、致病机制、流行病学特征等研究情况及进展进行了综述.     

温州市禽肉中空肠弯曲菌检测结果及耐药性分析

目的了解温州市农贸市场禽肉中空肠弯曲菌污染现状及耐药情况,为禽肉类食品安全风险评估、弯曲菌病防控和临床用药提供依据。方法于2018年2月—2019年10月从温州市鹿城区、龙湾区、瓯海区、瑞安市、苍南县、平阳县和文成县7个县(市、区)的农贸市场采集禽肉样品。采用双孔滤膜法检测空肠弯曲菌,并进行药敏试验。结果共采集样品200份,检出空肠弯曲菌66份,检出率为33.00%。鸡肉中检出空肠弯曲菌45份,检出率为34.09%;鸭肉中检出空肠弯曲菌21份,检出率为30.88%,不同样品空肠弯曲菌检出率差异无统计学意义(P0.05)。鹿城区、平阳县和苍南县空肠弯曲菌检出率最高,均为35.00%,不同采样地区空肠弯曲菌检出率差异无统计学意义(P0.05)。多重耐药38株,多重耐药率为57.58%,以萘啶酸、四环素和环丙沙星耐药率较高,分别为84.85%、83.33%和80.30%。结论温州市农贸市场禽肉空肠弯曲菌污染较重,且对萘啶酸、四环素、环丙沙星等多种抗生素有显著耐药性。     

河南省某养殖场猪源弯曲杆菌的分离鉴定及系统发育分析

目的探究某生猪养殖场中弯曲杆菌的污染状况,分析猪源弯曲杆菌分离株的种类,表型和基因型。方法采集生猪养殖场鼻拭子、粪便、污水、土壤、环境(地面和墙壁)涂抹物和饲料等83份样品,选择性增菌后采用滤膜法培养,根据菌落形态、生化表型和多重PCR检测进行弯曲杆菌的分离鉴定,扩增16srRNA后克隆测序,获得序列与Genbank数据库弯曲菌全基因组序列进行Blast分析,构建系统发育树,并确定弯曲菌种属。结果从猪粪便中分离9株弯曲杆菌,分离率10.84%,包括4株结肠弯曲菌(C.coli)、3株拉尼尔弯曲菌(C.lanienae)、2株豚肠弯曲菌亚种(C.hyointestinalis)。结论该生猪养殖场中的猪肠道内弯曲菌污染以结肠弯曲菌为主,种属和基因型具有多样性,分子系统发育树结果表明与国外猪源弯曲菌属具有较高同源性。     

鸡肉空肠弯曲菌标准制定过程中风险评估的应用

目的根据中国人群膳食鸡肉空肠弯曲菌风险评估结果,从标准管理角度,确定降低风险的可行措施。方法 Risk Ranger半定量风险评估。结果空肠弯曲菌一般不能在鸡肉加工环境或加工产品中繁殖,目前我国城市人群因进食鸡肉可能发生空肠弯曲菌病的风险大约是农村人群的6倍。结论没有必要在鸡肉的产品标准中设定空肠弯曲菌的限量指标,在鸡的饲养、加工及餐前制备等环节进行控制是降低鸡肉引发空肠弯曲菌感染的重要措施。     

鸡宰杀加工过程中肠道致病菌散布的调查

对人肠道致病的空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)和沙门氏菌(Salmonella spp)在许多动物的肠道中都曾有检出,特别是鸡的检出率较高,并有因鸡肉污染空肠弯曲菌或沙门氏菌引起食物中毒的报告。为了了解鸡宰杀加工过程中上述细菌的散布,我们曾对南京市某家禽加工厂所宰光鸡进行调查,现将调查结果报告如下。     

一项关于食品中空肠弯曲菌计数方法的研究简

目的 为了了解食品中空肠弯曲菌的数量,探寻一种实用的空肠弯曲菌计数方法.方法 通过不同浓度的染菌实验,对平板计数法、MPN法和Simplate方法进行比较分析.结果 当染菌量在10 CFU/g（mL）时,MPN法中至少有1管出现了阳性,simplate也可以检出且与设定值接近.因此这两种方法的检测限均为≥10 CFU/g（mL）.平板计数法的检测限应为≥30 CFU/g（mL）,在此范围内得到的结果与设定值相差0.9 ～2.4倍,小于10倍.结论 事实上,实验室可以选用不同的方法来评价食品中空肠弯曲菌的污染情况.如果检疫过程中要求结果准确,我们建议使用MPN和Simplate方法来计数加工过的食品.对于猪肉和家禽这类高污染的畜产品,选用平板计数法计数则更便捷.     

弯曲杆菌肠炎

胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus)曾被称为胚胎弧菌(Vibrio fetus),在兽医学领域中向来作为牛和绵羊流产的病原菌而被重视。本菌所致人的感染,自Curtis氏(1913)报告以来,报道虽多,但主要是某些基础疾患病人的菌血症和髓膜炎等。最近,本菌的一亚种——胚胎弯曲杆菌空肠亚种(C.fetus subsp jejuni)引起的肠炎和腹泻在世界各地都有报告,并被作为“人类一种新的疾病”而引起注意。胚胎弯曲杆菌空肠亚种(以下简称空肠弯曲杆菌)最早是Jones等(1931)从牛腹泻物中分离到,其后在绵羊流产的胎儿以及正常猪、牛、绵羊、山羊、鸡、火鸡和野禽的肠内容物中也有检出。最早报告弯曲杆菌所致人的肠炎是1938     

一起空肠弯曲菌食源性疾病突发事件的流行病学和病原学研究

对空肠弯曲菌所致的食源性疾病事件进行病原学研究及溯源分析,为突发食源性疾病事件的应急处置提供依据.方法 采用现场流行病学调查方法对疫情实施调查,可疑样本先用多重巢式PCR快速筛查22种常见胃肠道病原,锁定目标病原后,将病原菌分离鉴定与实时荧光定量PCR同步检测.对检出的空肠弯曲菌进行PFGE分子分型,用BioNumeries软件进行同源性分析.结果 共有病例91例,采集样本49件.从27件病例样本中分离出15株空肠弯曲菌,PFGE分为2种带型,其中14株带型完全一致,另1株为另一带型,2种带型相似性为66.7%.结合流行病学调查、实验室病原学检测和PFGE分析,判定此次事件为一起空肠弯曲菌引起的食源性疾病暴发事件.结论 传统分离培养检测方法结合FilmArray多重PCR系统、实时荧光定量PCR、PFGE分型技术可快速、准确确定和追溯病原.     

环介导等温扩增法检测空肠弯曲菌

目的 空肠弯曲菌是重要的食源性疾病病例标本的病原菌检测项目,用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的方法,对食源性致病菌空肠弯曲菌进行快速检测。方法 以空肠弯曲菌 mapA 基因序列为检测靶基因,建立了空肠弯曲菌的LAMP 快速检测方法。空肠弯曲菌的LAMP反应由DNA扩增试剂盒提供的反应体系加入引物和模板进行。做了空肠弯曲菌DNA模板灵敏度的检测、菌液灵敏度的检测和特异性检测。结果 我们方法对空肠弯曲菌DNA 的检测灵敏度为84.5fg/反应管;对空肠弯曲菌菌液检测灵敏度为0.8 CFU/反应管;特异性100%。结论 对食源性疾病腹泻样本的空肠弯曲菌检测项目,可以采用mapA-LAMP方法进行等温扩增初筛,初筛阳性的样品再有针对性地进行后续的传统培养。     

冻鸡肉中的肠道致病菌

将市售各种商标的冻鸡肉,于4℃解冻后,取其一半置于灭菌的聚乙烯袋内与150 ml蛋白胨水摇动30秒种,然后将此蛋白胨水用琼脂平板作需氧菌计数,用紫红胆汁琼脂作大肠菌群计数,并用此蛋白胨水作胚胎弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和沙门氏菌检验。所得结果如下。在6种不同商标的82份冻鸡肉样品中,有18份样品(22.0%)检出胚胎弯曲杆菌空肠亚种,所有样品均未检出胚胎弯曲杆菌肠道亚种;有20份样品(24.5%)检出小肠结肠炎耶     

多重PCR与传统方法检测空肠弯曲菌的比较研究

目的应用多重PCR法和传统检测方法对禽类样品进行空肠弯曲菌的检测,比较两种方法在检测结果准确性、效率、实用性上的差异与优缺点。方法分别采用基于空肠弯曲菌hipO、mapA、23S基因多重PCR法和传统检测方法(GB/T4789.9-2003)对来自南京市5个大型农贸市场的290份禽类样品进行同步检测,并对两种方法的检出率、灵敏度、检测周期进行比较。结果传统检测方法的检出率为16.6%,灵敏度为45CFU;多重聚合酶链反应(PCR)的检出率为37.9%,灵敏度为15cfu。结论多重PCR方法在检出率、灵敏度与检测周期等指标上均优于传统空肠弯曲菌的监测方法。