HBV—前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染2.2.15细胞转？…

目的：探索最佳ＨＢＶ－前Ｃ区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染２．２．１５细胞的转化条件。方法：构建含ＨＢＶ－前Ｃ区反义基因真核表达重组质粒后,通过控制质粒ＤＮＡ浓度、电压、电容、时间、温度等实验条件进行电转染观察转染细胞生长情况。结果：在电压２１０Ｖ、电容９７５ｕＦ、温度４℃、ＤＮＡ终浓度在０．１２５μｇ／μｌ至０．７５μｇ／μｌ之间时,细胞转染生长情况最佳。结论：上述优化实验条件,可明显提高Ｈ     

质粒电穿孔转染条件的选择

电穿孔转染,作为物理方法的一种,出现于20世纪80年代中期~([1]).这种方法不仅能够将DNA、RNA,还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞.它是一种高效、简便的基因转移系统,具有其它转移方法无可比拟的优越性,如操作简便、快捷,可重复性强,转染率高,适用谱广等.     

乙型肝炎病毒C区反义基因载体质粒的构建

我们以 PEcob_6含双拷贝乙型肝炎病毒 DNA 的质粒为模板,进行聚合酶连反应,获取乙型肝炎病毒 C 区基因后,平端连接到 PBKS~ 载体中,筛选出反向连接的重组质粒,即为含乙型肝炎病毒 C区反义基因质粒。为乙肝病毒的反义基因制备提供了新的、有经济价值的方法。     

乙型肝炎病毒全基因重组真核表达质粒的构建

目的 构建乙型肝炎病毒（HBV）全基因重组真核表达质粒,旨在转染肝细胞,建立HBV复制状态模型。方法 体外连接HBV（ayw亚型）DNA获得6.4kb的双拷贝DNA片段。然后将其插入pcDNA3载体的EcoRV位点。结果 通过聚合酶链反应（PCR）和酶切筛选和验证获得头尾串联双拷贝HBV全基因重组真核表达质粒。结论 成功构建了HBV全基因重组真核表达质粒。     

乙型肝炎病毒C区反义基因真核表达载体的构建

我们以PEcob6含双拷贝乙型肝炎病毒的质粒为模板，进行聚合酶连反应，获取C区基因．平端连结克隆到PBKS 质粒中，选译出C区反义基因。再将C区反义基因亚克隆到PREP8质粒．构建成了乙型肝炎病毒C区反义基因的真核表达载体。     

电穿孔转染悬浮细胞条件的优化

目的以RNA依赖性腺嘌呤脱氨酶(ADAR1)为靶基因优化悬浮培养的小鼠原代淋巴细胞的电穿孔转染条件。方法通过控制电压、温度、细胞状态等转染条件,采用不同条件组合将靶向ADAR1的siRNA导入悬浮培养的小鼠原代淋巴细胞,用倒置显微镜观察、细胞计数、台盼蓝拒染试验来计算siRNA序列转染率和细胞存活率。结果小鼠原代淋巴细胞在400V,40μs条件下可获得最大转染率,约为30.6%;良好的细胞状态以及低温条件可获得更好的转染效果。结论电穿孔转染法是一种高效的基因转染方法,通过优化其转染条件,可以提高其对悬浮细胞的转染率。     

VEGF-C真核表达质粒的构建及其真核表达

目的　研究人血管内皮生长因子 C(VEGF- C)基因功能片段的表达功能及表达活性。方法　以前期从人舌癌克隆得到的 VEGF- C功能片段 c DNA和真核表达质粒 pc DNA3.1( )构建重组质粒 ,以阳离子脂质体转染法将其导入舌鳞癌细胞 Tca8113,并检测其表达、分泌功能及体外激活能力。结果　通过将长度约为 110 0 bp的VEGF- C功能片段插入 pc DNA3.1( )的 Eco R 和 Xho 酶切位点之间 ,成功构建出 pc DNA3.1( ) - VEGF- C重组质粒 ,该质粒转染 Tca8113细胞后得到 VEGF- C高表达的舌癌细胞 Vc Tca,转染后的细胞可表达相对分子质量为 5 3× 10 3和 2 9× 10 3的 VEGF- C分子 ,在细胞培养液中可检测到相对分子质量为 2 9× 10 3的 VEGF- C片断。结论　构建的 VEGF- C重组质粒可在真核细胞实现表达 ,并能被分泌和激活     

电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化

目的:通过电穿孔法将带有增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorscent proteinEGFP)的真核表达载体pIRES2-EGFP(IRES2 internal ribosome entrysite 2 内部核糖体进入位点2)质粒导入未成熟树突状细胞(Immature Dendritic Cell,imDC),探讨不同电穿孔条件对imDC电转染率和存活率的影响.方法:通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,采用细胞因子体外培养诱导其成为imDC.在大肠杆菌中扩增pIRES2-EGFP质粒,选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量等.应用电穿孔仪将pIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞,荧光显微镜下和光镜下分别计算绿色荧光阳性细胞数和总细胞数.0.4%锥虫蓝(trypan blue)染色,计数电转染后细胞存活率.结果:当imDC浓度为5×10<'6>/mL与6/μg DNA质粒混合,设定电转染仪电压为300 V、脉冲时间为500 μs时,其电转染率到最高,细胞存活率最高,转染后24 h明显表达,48 h后表达最强.结论:在适当的电压、脉冲时间下,选择适当的细胞浓度、DNA剂量,在转染后的一定时间范围内,电穿孔法转染imDC可使目的基因获得较高的转染率,且细胞死亡最少.电转染提供了外源基因转染imDC的可行技术.     

慢性乙型肝炎HBV前C区基因突变的临床研究

采用聚合酶链反应（PCR）及单链构象多态分析（SSCP）银染技术检测了32例HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者及乙肝病毒携带者的前C区基因变异。结果表明有前C区基因突变株感染者8例，突变株感染者检出率为25．0％；突变株的检出率以慢性乙肝重度最高，其次是慢性乙肝中度、轻度患者，乙肝病毒携带者最低；抗－HBe阳性患者前C区突变株检出率高于HBeAg阳性患者。提示HBV前C区突变与病情轻重及e系统血清标志有关。     

人膜联蛋白A5重组质粒的构建及其在宫颈癌细胞系SiHa细胞中的转染与表达

目的：构建膜联蛋A5（ANXA5）的重组表达质粒,转染宫颈癌细胞并检测其表达。方法：自行设计引物,引入BamHI和XhoI的酶切位点,PCR法从pJLA503-ANXA5中获得ANXA5基因;将pcDNA3．1质粒用BamHI和XhoI双酶切后,用T4连接酶将其与ANXA5基因连接,并经测序证实基因序列正确后,用磷酸钙共沉淀法转染宫颈癌细胞系SiHa细胞,并用Western blot方法检测细胞中ANXA5蛋白的过表达。结果：重组质粒中ANXA5基因序列正确,转染重组质粒后的SiHa细胞过表达ANXA5蛋白。结论：成功构建了pcDNA3．1-ANXA5重组质粒,转染肿瘤细胞后可过表达ANXA5蛋白,为研究ANXA5在肿瘤细胞中的作用奠定了基础。