抗类风湿人源单链抗体库的制备及筛选

目的 通过噬菌体展示技术构建抗类风湿人源单链抗体库,为其进一步的临床应用研究奠定基础。方法提取患者外周淋巴细胞总RNA,逆转录合成cDNA,以人源免疫球蛋白H链和L链可变区的扩增引物,分别扩增出H链和L链可变区基因。采用SOE—PCR法将VH和比片段随机拼接成scFv片段,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中,构建噬菌体单链抗体库。结果初级库库容量为3×10^6,在大肠杆菌TG1中重组后得到1．2×10^6的次级抗体库。结论本研究成功构建类风湿人源单链抗体库,拟为类风湿病的预防、诊断、治疗奠定基础。     

鼠源抗烟曲霉单链抗体库制备及鉴定

目的 构建鼠源抗曲霉菌单链抗体（scFv）噬菌体展示文库并进行初步鉴定,为制备用于侵袭性曲霉感染实验室诊断的特异性抗体提供新的方法。方法 利用噬菌体展示技术构建鼠源抗烟曲霉半乳甘露聚糖（GM）ScFv库,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”淘选富集,随机挑选克隆进行可变区基因测序确定文库多样性,并用phage-ELISA筛选烟曲霉特异性结合的克隆。结果 构建的scFv噬菌体表达文库,库容量约为1.8×10⁷;经4轮富集筛选,洗脱的表达scFv噬菌体滴度渐增;随机挑选出4轮筛选后的20个克隆,其可变区基因序列不同;随机挑选出4轮筛选后的90个克隆,其中6个克隆与烟曲霉GM特异性结合,而与对照的白假丝酵母菌无结合。结论 构建并初步鉴定了抗曲霉菌单链抗体库,库容量大,VH和VL区具备多样性;筛选的scFv与曲霉菌GM特异性结合,提供了快速制备、筛选GM高特异性抗体分子的新方法。     

人源抗胃癌单链抗体的构建及初步鉴定

目的构建库容大、多样性好的噬菌体展示人源抗胃癌单链抗体。方法收集胃癌患者外周血分离淋巴细胞,利用噬菌体展示技术,构建人源单链抗体库并初步筛选抗胃癌单链抗体,用ELISA方法检验该抗体与胃癌细胞结合活性。结果成功构建了次级库容达4.0×109pfu/ml的噬菌体展示人源单链抗体库,并初步筛选到与胃癌细胞特异性结合的单链抗体。结论成功构建和筛选人源抗胃癌单链抗体,为进一步表达和应用特异性抗胃癌单链抗体奠定基础。     

人源化抗CD3单链抗体的构建、序列分析和表达研究

目的构建和表达抗CD₃单链抗体,并对其构象进行模拟分析.方法应用重叠延伸拼接法连接抗CD₃抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因,构建抗CD₃单链抗体基因(ScFv),并将其克隆于原核表达载体中表达.结果拼接后的抗CD₃ScFv基因全长732bp,构象模拟分析表明其三维结构稳定,兼容性分数S>0,表达的目的蛋白约26.5kD.结论抗CD₃ScFv基因的成功构建,为进一步研究抗CD₃/抗乙肝病毒的双特异性抗体奠定了基础.     

恶性疟原虫抗氯喹株分离和培养建立虫库的实验研究

１９８３～１９９２年我们在位于北纬２１°～２４°．东径９８°～１０２°间的云南及相邻的缅甸等地的恶性疟病人中成功分离和培养恶性疟原虫株１２株。体外抗药性测定，原再被抑制的氯喹浓度为８～６４ｐｍｏｌ。１９９２年１１月～１９９３年３月复测．结果有５株原虫被抑制，氯喹浓度有自然降低现象，仍属抗氯喹恶性疟原虫株．为国内首次建立了抗氯喹恶性疟虫库．     

抗氯霉素单链抗体的高效生产

[目的]建立抗氯霉素单链抗体(scFvCAP)的大肠杆菌高效生产体系。[方法]采用重叠延伸PCR法组装scFvCAP,并通过优化5’端序列实现高效表达,采用β-环糊精人工伴侣系统实现SDS变性蛋白的复性。[结果]成功组装scFvCAP基因(Genebank ID:GU258048)。在强启动子T7驱动下,scFvCAP基因独立表达时未见显著表达,而通过同义突变所得突变基因scFvCAP mut(Genebank ID:GU258048)即可高效表达。高效表达所形成的包涵体蛋白可溶于1%SDS-8mol/L尿素溶液,经β-环糊精人工伴侣系统复性后所获scFvCAP具有与母本单克隆抗体相似的亲和力。[结论]成功建立了基于大肠杆菌基因工程系统的scFvCAP高效生产体系。     

抗盐酸克伦特罗人源ScFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选盐酸克伦特罗(CLB)人源单链可变区(ScFv)抗体,为研究快速检测试剂(盒)提供基础依据.方法 采用噬菌体表面展示技术,以CLB作为抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选抗CLB的60个克隆,利用酶联免疫吸附法(ELISA)、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与CLB结合活性较强的ScFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定SfiⅠ/NotⅠ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XLI-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;并对CLB ScFv的编码基因序列分析.结果 经过筛选60个克隆中有15株克隆ELISA的吸光度(A490nm)值较高,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白(BSA)进行交叉反应,确定有7株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XL1-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;DNA为750 bp;经BLAST分析,此片段属于新抗体基因序列,GenBank注册号为:EU681272.结论 本实验用噬菌体抗体库技术能够初步获得抗CLB的ScFv抗体,为下一步其特异性亲和力的研究创造了条件.     

抗乙肝表面抗原单链抗体的基因克隆与序列分析

目的：为乙型肝炎病毒基因工程双特性抗体的研制奠定基础。方法：提取抗乙型肝炎病毒杂交瘤细胞总RNA,利用鼠源性抗体可变区通用引物,经逆转录PCR扩增轻链可变芡和重链可变区,用连接肽（Gly4Ser)3连接轻、重链可变区基因,构建单链抗体基因,并克隆pGEM-TEasy质粒,进行核苷酸序列分析。结果：分别得到了414 辽的轻链可变芡基因片段和393bp的重链可变区基因片段,序列分析表明轻链可变区属于小鼠kappa链第XX家族,重链可变区属于小鼠Ig链第Ⅸ家族。结论：克隆到序列正的抗乙型肝炎病毒表面抗原单链抗体基因。     

A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体体外表达鉴定

目的　从构建的A型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein)噬菌体单链抗体库中筛选阳性克隆,在大肠杆菌HB2 15 1中表达流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体,为研究A型流感病毒免疫渗漏试剂盒建立基础。方法　经过连续三轮固相“亲和-洗脱-富集”筛选,丰富噬菌体抗体库中阳性克隆的比例,采用ELISA、SDS PAGE和Western blot方法对大肠杆菌培养上清液和细菌周质腔蛋白进行分析目的产物。采用亲和层析方法对细菌周质腔蛋白进行分离纯化并进行单链抗体滴度分析。结果　从96个克隆中筛选到10个阳性克隆,其中三个阳性信号较强,分别为A1、E1和G3。其A4 50 分别达到0 . 4 6 9、0 . 5 82和0 . 5 0 7。A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体主要表达于细菌周质腔中,亲和纯化产物稀释4 0 .96倍,ELISA结果仍为阳性。结论　利用噬菌体抗体库技术,初步在大肠杆菌中表达了A型流感病毒噬菌体单链抗体。     

大劣按蚊人工感染恶性疟原虫的实验研究

作者采用改进的人胎盘膜饲血法，以3例恶性疟患者离体肝素防凝血感染4批大劣按蚊，结果均感染成功，子孢子感染率1.7～64.0%，子孢子进腺时间为10～12天，高峰期在15～16天。     

天然人源性单链抗体文库的构建及鉴定

目的构建天然人源性单链抗体(scFv)文库,并对文库质量进行鉴定。方法采集220份未经主动免疫健康人外周血,分离单个核细胞后提取总RNA,逆转录成cDNA,混匀,以此为模板PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL,包括Vκ和Vλ),再经过overlap-PCR法,将VH基因和VL基因随机拼接成人scFv基因文库后,插入噬菌体载体pComb3XSS中,电转化大肠杆菌XL1-Blue制备scFv文库。通过菌落数量计算库容,并随机挑选100个单菌落验证scFv基因阳性克隆率,基因测序分析scFv文库基因的多样性。结果经过1次电转化得到容量为1.8×108的scFv文库,scFv基因阳性克隆率为96%,其中78%为正确插入,其scFv基因序列均不相同。结论成功构建了一种大容量、多样性高的天然人源性scFv文库,为进一步筛选特异性中和抗体提供了基础材料。     

恶性疟原虫环子孢子蛋白DNA疫苗诱导的小鼠T淋巴细胞的增殖

目的 为了探讨恶性疟原虫FCC－1／HN株环子孢子蛋白（CSP）DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法 将重组真核表达质粒pBK/CSP经骨骼肌注射BALB／c小鼠,小鼠经DNA疫苗免疫8wk后,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化,并体外培养脾脏细胞,用夹心ELISA法测定IFN－γ和IL－2的产生。结果 与对照组相比,疫苗组CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞有显著性的增高,体外培养的脾脏细胞IFN－γ有一个高浓度的分泌。结论 恶性疟原虫FCC－1／HN株环子孢子蛋白（CSP）DNA疫苗诱导了一个TH1的免疫应答类型。     

Immunogenicity and efficacy of a DNA vaccine encoding a human anti-idiotype single chain antibody against nasopharyngeal carcinoma

G22, an anti-idiotype single chain antibody screened from human nasopharyngeal carcinoma phage anti-idiotype antibody library, has been already identified by He et al.     

合肥市输入性恶性疟原虫Pfcrt基因K76T位点突变研究

目的探讨合肥市输入性恶性疟原虫Pfcrt基因K76T位点的突变情况。方法采集2010年从非洲疟疾高流行区,务工回国输入性恶性疟病人血样11份,采用恶性疟原虫Pfcrt基因序列特异引物,以滤纸血片中的恶性疟原虫DNA为模板,进行巢氏PCR扩增基因,扩增产物经限制性内切酶酶切后鉴定。结果收集到11例滤纸血样,成功扩增6例,其中2例被酶切,为Pfcrt等位基因野生型;4例未被酶切,为Pfcrt等位基因突变型。结论合肥市输入性恶性疟中Pfcrt等位基因发生突变,应该加强输入性恶性疟的药物抗性监测。     

Artesunate Misuse and Plasmodium falciparum Malaria in Traveler Returning from Africa

Plasmodium falciparum malaria developed in an African-born traveler who returned to Canada after visiting Nigeria. While there, she took artesunate prophylactically. Isolates had an elevated 50% inhibitory concentration to artemisinin, artesunate, and artemether, compared with that of other African isolates. Inappropriate use of artemisinin derivatives can reduce P. falciparum susceptibility.     

胸腺肽α1单克隆抗体的制备及其鉴定

目的:研制胸腺肽α1(Tα1)单克隆抗体，为Tα1作用机制的阐明奠定基础。方法:用戊二醛将Tα1和牛血清白蛋白进行交联，以其交联物为抗原，按常规淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，并采用间接酶联免疫吸附(ELISA)法和Western免疫印迹来鉴定单克隆抗体的特异性。结果:建立了分泌抗Tα1抗体的杂交瘤细胞株，能特异性地与Tα1结合，但与单纯牛血清白蛋白、酵母抽提物和转染Tα1酵母未诱导表达产物无反应。其抗体效价为1：10240，Ig亚类为IgG2b。结论：本研究建立了针对Tα1高效价、高特异性单克隆抗体细胞株。     

Antibodies against a Plasmodium falciparum antigen PfMSPDBL1 inhibit merozoite invasion into human erythrocytes

One approach to develop a malaria blood-stage vaccine is to target proteins that play critical roles in the erythrocyte invasion of merozoites. The merozoite surface proteins (MSPs) and the erythrocyte-binding antigens (EBAs) are considered promising vaccine candidates, for they are known to play important roles in erythrocyte invasion and are exposed to host immune system. Here we focused on a Plasmodium falciparum antigen, PfMSPDBL1 (encoded by PF10_0348 gene) that is a member of the MSP3 family and has both Duffy binding-like (DBL) domain and secreted polymorphic antigen associated with merozoites (SPAM) domain. Therefore, we aimed to characterize PfMSPDBL1 as a vaccine candidate. Recombinant full-length protein (rFL) of PfMSPDBL1 was synthesized by a wheat germ cell-free system, and rabbit antiserum was raised against rFL. We show that rabbit anti-PfMSPDBL1 antibodies inhibited erythrocyte invasion of wild type parasites in vitro in a dose dependent manner, and the specificity of inhibitory activity was confirmed using PfMSPDBL1 knockout parasites. Pre-incubation of the anti-PfMSPDBL1 antibodies with the recombinant SPAM domain had no effect on the inhibitory activity suggesting that antibodies to this region were not involved. In addition, antibodies to rFL were elicited by P. falciparum infection in malaria endemic area, suggesting the PfMSLDBL1 is immunogenic to humans. Our results suggest that PfMSPDBL1 is a novel blood-stage malaria vaccine candidate.     

Multidrug-resistant genotypes of Plasmodium falciparum, Myanmar

We performed a molecular epidemiologic survey of mutations associated with drug-resistance genes in Plasmodium falciparum in northeastern Myanmar. In this region, 3 highly mutated drug-resistance haplotypes and 1 associated with decreased quinine susceptibility were prevalent, which suggests that parasites may be resistant to multiple commonly used antimalarial drugs.     

抗重组SARS病毒N蛋白单克隆抗体制备及性质初步研究

目的：制备抗重组SARS病毒N蛋白单克隆抗体。方法：重组SARS病毒N蛋白免疫BALB／c雌性小鼠获得免疫脾细胞，利用杂交瘤技术将免疫脾细胞同骨髓瘤Sp2／0细胞融合，间接ELISA方法筛选阳性克隆并扩增。结果：获得了能稳定分泌抗重组SARS病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株，经鉴定分泌的抗体IgG亚类为IgM。结论：制备了鼠源性单克隆抗体并初步研究了该抗体性质。