间隔区寡核苷酸分型和多位点可变数量串联重复序列分析在结核分枝杆菌基因分型中的应用

目的评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)方法在结核分枝杆菌基因分型研究中的应用。方法收集224株结核分枝杆菌临床分离株,分别采用Spoligotyping及MLVA方法进行基因分型,比较两种方法的分型效果,评价两种方法在结核分枝杆菌基因分型中的应用。结果使用Spoligotyping方法,224株结核分枝杆菌呈现出55种基因型,39株具有独特的基因型,其余185株菌呈现出16种基因型;使用MLVA方法时,224株结核分枝杆菌呈现出160种基因型,132株具有独特的基因型,余下的92株菌呈现出28种基因型;当两种方法联合使用时,224株结核分枝杆菌呈现出179种基因型,159株结核分枝杆菌具有独特的基因型,余下的65株菌表现为20种基因型。湖南省和安徽省的菌株中北京家族菌株所占的比例差异有统计学意义(P<0.001),安徽省北京家族菌株所占的比例明显高于湖南省。结论MLVA在结核分枝杆菌株水平的鉴定方面,其分辨能力高于Spoligotyping,但是Spoligotyping在鉴定北京家族菌株和M.bovis方面有一定的优势。将Spoligotyping方法作为一线分型技术,MLVA作为二线分型技术联合应用时,将提高结核病的流行病学调查和病原学监测效果。不同地区的菌株有不同的特点。     

聚合酶链反应和地高辛标记的核酸杂交技术用于钩端螺旋体的检测

目的为钩端螺旋体快速诊断和流行病学调查建立一种比较理想的方法.方法根据钩端螺旋体赖株DNA合成一对flaB引物,用PCR技术对钩端螺旋体菌株、疫区现场动物标本等进行flaB基因扩增,用地高辛（DIG）标记flaB基因探针,用琼脂糖凝胶电泳和斑点杂交技术进行检测.结果纯化钩端螺旋体DNA 5pg经flaB-PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳可以目测.用DIG标记的flaB探针可以检测到5fg及以下的DNA扩增产物.疫区70份蛙肾标本,分离细菌8株,阳性率11.43%.flaB扩增阳性14份,阳性率20%;DIG标记探针斑点杂交检测,阳性19份,阳性率为27.14%.结论PCR-斑点杂交是一种灵敏、特异、快速的钩端螺旋体检测方法,既可用于快速检测和早期诊断,也可用于疫情监测和流行病学调查.     

Leptospira alstoni致病性钩端螺旋体的多位点序列分析研究

目的 探讨分析Leptospira alstoni致病性钩端螺旋体的基因型。方法 应用多位点序列分析(multilocus sequence typing,MLST)技术研究仅在我国分离发现的三株Leptospira alstoni致病性钩端螺旋体的基因型,并与MLST数据库收录的当前中国流行血清群进行聚类分析。结果 成功将三株菌株7个管家基因扩增出来,基因测序结果通过与MLST数据库比对,发现这三株菌株MLST结果并不能匹配数据库中已有MLST基因型,表明这三株菌株具有三种不同的MLST基因型。聚类分析结果显示这三株致病性钩端螺旋体形成一个独立的进化分析,与当前在中国流行的七种致病性钩端螺旋体血清群明显不同。结论 发现三种不同致病性钩端螺旋体MLST基因型,这些结果为未来致病性钩端螺旋体分子分型、溯源奠定一定理论基础。     

麻风分枝杆菌基因分型及其多个患者家庭内传播的研究

目的探讨在特定地区和时期内采用多位点可变串联重复序列（VNTR）分析（MLVA）对麻风菌基因分型，以评价麻风病传播链。方法从云南省丘北县2002～2006年收集的患者皮损中提取麻风菌DNA，采用AC9、6-7，GTA9，AT17，AC8a，AT15，AT18七个VNTR位点的MLVA基因分型，观察不同基因型与地理分布的关系；与现场流行病学调查结合，开展传播链的研究。结果（1）系统发育树分析揭示：依据GTA9等位基因型的变化，可分为GTA9位点为9，11-13，15—26，〉26的A、B、C、D和E菌株。A菌株的GTA9等位基因型均为9，命名为A株。A株聚集分布在该县的北部，B株聚集分布在西北部，但C、D和E菌株基因型多变，散在分布。（2）该县北、西北部的5个高发家庭内的菌株为相同的A株。同一高发家庭内的患者，其菌株VNTR基因型一致或相似，但其他高发家庭之间的菌株基因型不相同。（3）在总菌株中，A菌株占有较高比例，且地理分布聚集，近期仍在传播。结论无论从家庭内或较小区域内收集菌株的分型结果显示，VNTR基因分型适合麻风菌分型和短传播链的研究。优势菌株或聚集株均为高发家系中发现的，因此推测高发家系可能作为乡村中的麻风菌的疫源和传染源。但需要较长时期证实A菌株是否为优势株。     

多位点可变数目串联重复序列分析对致病性钩端螺旋体分型的研究

钩端螺旋体(钩体)病是一种自然疫源性疾病.近年来以可变数目串联重复序列(variable number of tandemrepeats,VNTR)为基础的分型方法,逐渐被应用于分子流行病学研究中.本研究选取我国致病性钩端螺旋体15群15型参考菌株,初步探讨多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)在钩体病分子流行病学研究中的应用价值.     

甘肃省228株临床分离结核分枝杆菌DNA分型初步研究

目的了解目前甘肃结核分枝杆菌流行株的基因型特征,并评价两种基因分型方法的应用价值。方法收集甘肃省结核分枝杆菌临床分离菌株,分别采用多位点数目可变串联重复序列分析(multiple-locus variable number tandem repeat analysis,MLVA)和间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing,Spoligotyping)技术进行基因分型,用BioNumerics软件进行聚类分析后,进行结果综合分析、比对。结果利用MLVA分型方法,228株结核分枝杆菌被分为4大基因群,7个主要基因型;Spoligotyping可将228株结核分枝杆菌分为4个基因群,8个主要基因型,其中最大的基因型为北京家族基因型。两种方法在基因型分型方面经卡方检验差异无统计学意义(χ2=0.06,P0.05)。结论两种方法对结核分枝杆菌的分型效果良好,重复性高,操作简便,可试用于大规模分子流行病学调查。北京家族是甘肃最主要的流行基因群。     

可变数目串联重复序列分析与多位点序列分析在伯氏疏螺旋体分型研究中的应用

目的 评价多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)和多位点序列分析(MLSA)两种方法在伯氏疏螺旋体分型研究中的应用.方法 采用MLVA和MLSA两种方法对31株伯氏疏螺旋体分型结果进行比较分析.结果 31株伯氏疏螺旋体用MLVA方法分成4簇,24个基因型,其中21个独立基因型,成簇率达24/31,MLVA的分辨率达到0.969;MLSA可将31株伯氏疏螺旋体分成4簇,每株都可独立分析,但有3个节点步长值(Bootstrap value) ＜50％.结论 MLVA和MLSA两种方法均适合于伯氏疏螺旋体的分型研究,对于部分分型有异议的菌株,将MLVA与MLSA联合可有效进行伯氏疏螺旋体的分型鉴定.     

flaB-PCR在钩端螺旋体病检测中应用

目的 探讨flaB-PCR对组织标本中钩端螺旋体检测的可行性，为钩端螺旋体流行病学调查提供一种快速、有效的技术手段。方法 根据黄疸出血型钩体赖株高度保守序列flaB设计一对引物，用PCR方法对实验动物标本及疫区动物标本中的钩端螺旋体DNA进行flaB基因片断扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果 该引物可特异性扩增钩端螺旋体DNA，而对本实验所用其它细菌均不扩增。肾组织中含10条钩端螺旋体经flaB-PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳可以目测到扩增产物。26份人工感染钩端螺旋体的动物脏器标本，flaB-PCR扩增阳性10份，阳性率38．46％；细菌分离阳性2份，阳性率7．69％。2种方法比较差异有统计学意义（X^2=6．93，P〈0．01）。疫区70份蛙肾标本。分离细菌8株，阳性检出率11．43％；flaB-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳阳性14份，阳性检出率20％。细菌分离阳性的标本flaB-PCR均为阳性。结论 flaB-PCR灵敏、特异、快速，是钩端螺旋体检测的有效方法，可用于钩体病疫情监测和流行病学调查。     

大肠埃希菌O157:H7分离株MLVA分子分型

目的了解国内大肠埃希菌O157:H7菌株的分子流行特征。方法采用多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)方法对1999-2002年江苏、河南、安徽、山东、云南等地的大肠埃希菌O157:H7分离株135株进行分子分型,选取7个可变数目串联重复序列(VNTR)位点,应用PCR技术及毛细管电泳方法,检测分离株DNA多态性,使用BioNumerics软件进行聚类分析。结果 135株大肠埃希菌O157:H7可分为3个群(A群、B群、C群)38个MLVA型别,其中A群占20.7%(28/135)、B群占23.7%(32/135)、C群占55.6%(75/135);MLVA型别存在一定地域性,同一暴发来源的菌株具有相同MLVA型别。结论大肠埃希菌O157:H7国内分离株存在丰富的基因多态性;MLVA方法具有较高分子分型能力,可以在溯源和流行病学调查中发挥重要作用。     

肠炎沙门菌可变数目串联重复序列位点用于多位点可变数目串联重复序列分型分析的评价

目的 评价不同肠炎沙门菌可变数目串联重复序列(VNTR)位点用于多位点可变数目串联重复序列(MLVA)分型的可行性.方法 选取已报道使用的肠炎沙门菌11个VNTR位点,对中国不同时间和地区分离的16株菌进行初步评价,选取具有单一扩增条带的位点进行104株肠炎沙门茵的MLVA分型分析.对这些菌株同时进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析,比较MLVA分型方法与PFGE分型方法对菌株分型能力的强弱.结果 初筛得到7个VNTR位点用于扩大菌株的分析,这些位点将104株菌分为16个MLVA型别,D值为0.7222,这些菌株同时被分为22个PFGE型别,D值为0.7974.对两种方法各自所分的最大组包含的菌株进行比较,发现PFGE具有更强的分辨能力;从频数分布看,PFGE方法分型结果比较分散,MLVA分型较为集中.结论 用于国际肠炎沙门菌分型具有扩增多态性的VNTR位点在国内分离株中并不都具有多态性结果,在MLVA方法学建立中应选择更多的VNTR位点进行广泛的筛选才有利于国际实验室间的方法的统一.     

多位点可变串联重复序列技术用于西藏地区结核分枝杆菌基因分型的初步研究

目的初步探讨多位点数目可变串联重复序列(MLVA)技术在西藏地区结核分枝杆菌基因分型中的应用和初步了解西藏地区结核分枝杆菌数目可变串联重复序列(VNTR)基因型种类及其分布。方法在拉萨、山南、林芝、日喀则、那曲、昌都6个地区结核病防治中心收集结核分枝杆菌临床分离菌株,设计引物,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分枝杆菌20个VNTR位点进行检测,并通过BioNumerics 4.5软件进行DNA指纹图谱多态性分析。结果共收集到217株结核分枝杆菌,分为19个不同的VNTR基因型,其中以Ⅺ型为主要基因型占87.6%(属于北京家族),其次Ⅵ型、ⅩⅤ型、ⅩⅥ型各占1.38%,Ⅰ型、Ⅶ型、ⅩⅢ型各占0.92%,12株结核分枝杆菌为单一的基因型。不同地区之间,以Ⅺ型为主要基因型,分别占各地区的86.8%、91.3%、78.95%、88.2%、95.05、89.3%。结论西藏地区的结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,主要流行型为VNTRⅪ型(即北京家族基因型),初步研究结果显示北京家族基因型与卡介苗接种和耐药性无相关性。MLVA分型方法简单、快速,可以有效地用于结核分枝杆菌的基因分型和病原监测。     

宁波市90株结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究

目的研究宁波市结核分枝杆菌的可变数目串联重复序列(VNTR)的分型及分布特征。方法随机选取宁波市结核分枝杆菌临床分离株,常规培养,提取菌体基因组DNA,通过聚合酶链反应(PCR)对15个VNTR位点进行检测,采用BioNumerics软件进行基因分型的聚类分析。结果 90株结核分枝杆菌临床分离株的VNTR位点检测结果显示出明显的基因多态性,基因分型经聚类分析,分为4个基因群(Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群),84个基因型。Ⅰ群占11.1%,含有10个基因型,Ⅱ群占17.8%,含15个基因型,Ⅲ群占65.6%,含54个基因型,Ⅳ群占5.6%,含5个基因型。结论宁波市结核分枝杆菌VNTRs基因存在明显多态性得到初步证实,至少存在4个VNTR型,主要流行型为Ⅲ型。     

71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究

目的初步探讨浙江省结核分枝杆菌的数目可变串联重复序列（VNTR）的分型及分布特征。方法随机选取浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株，常规培养，收集菌体，提取基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）分别对VNTR位点进行检测分析，基因分型聚类分析采用BioNumerics软件。结果对71株结核分枝杆菌临床分离株的15个VNTR位点进行检测。结果显示明显的基因多态性。经基因聚类分析，可分4个基因群（I群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群），58个基因型。分别为I群占8．5％，含5个基因型，Ⅱ群占18．3％，含13个基因型，Ⅲ群占70．4％，含38个基因型，Ⅳ群占2．8％，含2个基因型。结论初步证实浙江省结核分枝杆菌VNTRs基因存在明显的多态性，至少存在4个VNTR型，主要流行型为Ⅲ型。     

结核分枝杆菌临床分离株MLVA法分型分析

目的利用多位点数目可变串联重复序列技术,初步探索甘肃省结核分枝杆菌的基因型及其分布,为防治结核病提供科学依据。方法选择15个VNTR位点,设计引物,采用PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测,并利用BioNumerics 4.5软件进行DNA指纹图谱多态性分析。结果多位点数目可变串联重复序列(MLVA)检测显示,215株结核分枝杆菌呈现7个基因群127种基因型,分别为a、b、c、d、e、f和g基因群,其中e群74.88%(161/215)为主要流行型(spoligotyping鉴定为北京家族基因型);有抗结核治疗史患者菌株成簇率高于无抗结核治疗史患者,差异有统计学意义(χ2=3.91,P=0.046)。结论兰州地区结核分枝杆菌基因DNA指纹图谱呈现多态性,存在主要流行株,MLVA有助于为当地政府部门制定具体的结核病防治政策和公共卫生应急方案提供科学依据。     

2016-2018年陕西省炭疽监测及基因溯源分析

目的 调查了解2016-2018年陕西省炭疽流行情况、病原学特征及分子流行病学特征。方法 对2016-2018年报告炭疽病例开展个案调查,进行流行病学三间分布分析;采集病例生物样本及环境样本,进行炭疽杆菌分离培养、炭疽ELISA抗体检测及荧光定量PCR检测,对分离到的阳性标本以canSNP及MLVA15的方法进行分子分型,与陕西省历史菌株及国内部分省份菌株基因型进行聚类分析。结果 2016-2018年陕西省共炭疽病例14例,发病到诊断平均9天,地理分布以关中及陕北地区为主,8月份发病较多,人群分布性别比为6∶1(12/2),26~59岁占85.7%(12/14),农民占71.4%(10/14)。人体标本病原培养17份,分离到炭疽杆菌1株,阳性5.9%,环境标本培养77份均为阴性,ELISA检测阳性率83.3%(10/12),荧光定量PCR阳性率21.4%(3/14);陕西省炭疽菌株canSNP基因型为A.Br.001/002型,2015年、2018年及1953年菌株MLVA分型分别为MLVA15-38、31、CHN17基因型。结论 2016-2018年陕西省炭疽疫情属较低散发水平,主要分布在关中及陕北地区,8月为发病高峰,人群以青壮年男性农民为主。炭疽杆菌canSNP基因型为A.Br.001/002,与国内主要流行株相同。存在3种不同的MLVA15基因型。陕北地区MLVA15-38型,与北部内蒙古相近;关中地区MLVA15-31型,与甘肃省及新疆类似;历史上还曾有MLVA15-CHN17型。     

Genetic diversity and variation over time of Coxiella burnetii genotypes in dairy cattle and the farm environment

The genetic diversity of Coxiella burnetii from 36 dairy cattle herds was determined by Multiple-Locus Variable number tandem repeats Analysis (MLVA), and genotypes from different sources (bulk-tank milk – BTM and surface dust) and sampling time (2009/10 and 2011/12) were compared. A total of 15 different genotypes were identified from 60 BTM and seven dust samples, including seven genotypes reported here for the first time (BN, BO, BP, BQ, BR, BS, BT). The two most prevalent genotypes (J and I), detected both in BTM and dust, accounted for 44.5% of the C. burnetii typed and have been reported infecting cattle worldwide. In 52% of herds more than one genotype was found, and mixed infection with two genotypes was observed in seven BTM samples. Comparison of C. burnetii genotypes at different samplings within each herd detected a change in genotype in 32% of herds, while a persistent genotype was identified in the remaining 68%. In addition, the genotype obtained from dust samples was always identical to that present in the BTM sample. Often persistent genotypes were among the most prevalent types. Clustering of the MLVA genotypes from this and other studies using the minimum spanning tree method separated our C. burnetii strains into two clusters, 10 genotypes clustered within genomic group (GG) III, and the remaining five types (AE, BQ, BR, BS and BT) grouped with GG II, which includes strains implicated in human outbreaks. Although presence in cattle of genotypes closely related to those identified in humans does not seem to be common event, it cannot be neglected and surveillance of genotype distribution is needed to fully understand the epidemiology of Q fever.     

15个VNTR位点用于87株丽水市结核分枝杆菌分离株的基因分型研究

目的:选取2008年-2010年间丽水市结核分枝杆菌临床分离株,通过多位点可变数目串联重复序列分型,了解丽水市结核分枝杆菌流行菌株基因分型情况。方法:对临床分离株进行常规培养,收集菌体,提取基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)分别对15个VNTR位点进行检测分析,基因聚类分析采用BioN-umerics软件。结果:经聚类分析,87株结核分枝杆菌分为4个基因群(I群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群)69个基因型。其中Ⅳ群占74.7%,含49个基因型,I群占9.2%,含8个基因型,Ⅱ群占8%,含7个基因型,Ⅲ群占5.75%。含5个基因型。结论:丽水市的结核分枝杆菌存在基因多态性,其主要流行型为Ⅳ型。     

Molecular characterization of Salmonella Typhimurium highly successful outbreak strains

Three large clusters of Salmonella Typhimurium infections in Denmark in 2008 and 2009 were defined by multilocus variable number of tandem repeat analysis (MLVA). One of these proved to be the hereto largest Danish cluster of salmonellosis with 1446 cases. Two smaller clusters with a total of 197 and 89 cases, respectively, were seen concurrently. These clusters shared epidemiological characteristics such as age distribution, geography, and time. To investigate the possible genetic relationship between the cluster strains, these were further characterized by phage typing, pulsed-field gel electrophoresis, and Optical Mapping. Although the MLVA method proved robust and well-performing in detecting and defining clusters, the employment of a second typing method detected an additional fourth cluster among the isolates. The cluster strains were stable throughout the almost 2-year period, even though we detected changes in three of five MLVA loci in a small fraction of isolates. These changes were mainly due to the gain or loss of single repeats. Optical Mapping of the large cluster strain indicated no increased content of virulence genes; however, Optical Mapping did reveal a large insert, a probable prophage, in the main cluster. This probable prophage may give the cluster strain a competitive advantage. The molecular methods employed suggested that the four clusters represented four distinct strains, although they seemed to be epidemiologically linked and shared genotypic characteristics.     

江西省羊种布鲁氏菌分子流行病学特征分析

目的 掌握江西省羊种布鲁氏菌分子特征,了解分离菌株流行病学间相关性。方法 采用多位点可变数目串联重复序列分析方法（MLVA）对江西省17个县（区） 25株人分离羊种布鲁氏菌进行分析。结果 25株羊种布鲁氏菌聚类可分为24个独立基因型,相似度为67.00%～100.00%,辛普森指数在0.000～0.773之间,MLVA8型有3个基因型,60.00%（15/25）为42型,32.00%（8/25）为43型,8.00%（2/25）为63型。MLVA11型有7个基因型,116、125型为主要基因型,两型菌株占56.00%（14/25）。结论 25株人分离羊种布鲁氏菌基因具有高度遗传多样性,菌株基因型繁多,各菌株间无明显流行病学相关性,表明江西省羊种布鲁氏菌传染来源复杂。     

结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列分型方法标准化操作程序的建立

目的 建立结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)的标准化方法,评价该方法的分型能力、应用价值.方法 选取15个位点,采用核酸提取、PCR和琼脂糖凝胶电泳等技术,结合BioNumeries(Version 5.0)软件,对中国54株结核分枝杆菌临床分离株进行分型.结果确定标准化的MLVA方法,包括细菌分离培养、核酸提取、PCR、琼脂糖凝胶电泳等实验步骤及标化参数的相关数据分析软件的使用.VNTR位点确定为ETRA、ETRB、ETRC、ETRD、ETRE、MIRU10、MIRU16、MIRU23、MIRU26、MIRU27、MIRU39、MIRU40、Mtub21、Mtub30和Mtub39.结论建立MLVA标准化技术方案,该方法操作简便,分型鉴定能力及实验室间结果可比性强,便于网络化,有利于结核病流行中追溯传染源,分析流行趋势.