家蝇抗真菌肽MAF-1原核表达条件优化及活性验证

目的 优化家蝇抗真菌肽(MAF-1)原核表达条件及重组蛋白的活性验证。方法 利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Quantity One凝胶电泳图像分析系统研究不同的诱导温度、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响;融合蛋白用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行蛋白纯化,切除His标签后进行活性验证。结果 在加入浓度为25μmol/L的IPTG,34℃诱导18 h,融合蛋白的表达量最高;融合蛋白纯化后浓度为0.706 mg/mL,其最低抑杀白色念珠菌的浓度为70μg/mL。结论 成功获得重组融合蛋白的最佳表达条件,并纯化目的蛋白,切除His标签后的目的蛋白具有抗真菌活性。     

丙型肝炎病毒核心区多肽的抗原表位分析和原核表达

目的 分析HCV核心区多肽的抗原表位,选择具有优势抗原表位的多肽用原核表达载体表达,并获得该表达载体的稳定表达菌株. 方法 根据软件分析选取带有优势抗原表位的HCV核心区多肽,找出对应DNA序列,逆转录PCR扩增目的基因,克隆到原核表达载体中进行诱导表达.表达的目的蛋白用His Bind Columns纯化,用ELISA法检测其免疫活性. 结果 获得了序列正确的HCV-core基因和表达良好的该基因原核表达载体pET-28a-core,该表达载体表达的目的蛋白可被很好地纯化并具有良好的HCV抗原活性. 结论 成功地重组了HCV核心区蛋白,获得了HCV抗原性良好的HCV核心区抗原.     

SARS冠状病毒多抗原表位融合蛋白的表达及其诊断应用

目的 制备SARS冠状病毒(SARS-CoV)多抗原表位融合蛋白,建立一种可特异性诊断SARS的血清学方法,用于SARS的明确诊断和流行病学调查研究.方法 设计含有SARS冠状病毒S、M和N蛋白优势抗原表位区的多表位融合蛋白SMN,利用大肠杆菌表达SMN蛋白,并作为包被抗原建立ELISA方法,用于SARS患者血清检测.结果 设计出包含S603-635 M2-31、N362-412表位区的多表位融合蛋白SMN,并在大肠杆菌中成功表达.以SMN蛋白为包被抗原,ELISA检测74份SARS患者血清全部为阳性,另44份非SARS-CoV感染的发热病人血清和62份健康人血清均为阴性.结论 SARS-CoV多抗原表位融合蛋白SMN在大肠杆菌中成功表达,以SMN为检测抗原建立的ELISA方法为SARS血清学诊断奠定了基础.     

发展含B-和T-细胞表位嵌合肽疫苗的新趋势

在免疫学和疫苗学界最近发展形成了嵌合肽疫苗策略,即作为理想的免疫原,合成分子将一并包含目的抗原B细胞表位和自身或外源非选择性T细胞表位。它不仅继承原单一表位合成肽的全部长处,而且具有不必再与大分子载体偶联,尤其可克服MHC遗传限制,在基因背景各异人群中产生广泛有效免疫应答等显著优点,从而为各类疫苗的研制以及推广应用展现出新的途径和前景。本文概述了嵌合肽的基本原理、它的设计要点和包括抗生育疫苗在内的相关研究实例。     

人ZP3融合蛋白的原核表达

目的:在原核中表达人卵透明带蛋白3(zone pelluc ida,ZP3)。方法:将人ZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21,并经丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-ZP3融合蛋白。结果:重组菌株明显诱导表达出预期分子质量为63 000 D的融合蛋白。结论:成功地构建GST-ZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达GST-ZP3融合蛋白,为进一步开展免疫避孕与生殖免疫的研究奠定基础。     

人乳头瘤病毒重组质粒的构建及蛋白表达

目的 构建重组原核表达质粒获得人乳头瘤病毒18型L1片段(HPVl8LI)活性蛋白。为进一步研制人乳头瘤病毒18型(HPV18)基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒(pBR322-HPV18)为模板，利用PCR方法扩增HPV18L1DNA片段。将HPV18L1DNA与质粒(pUC19)重组构建重组质粒(pUC19-HPV18L1)。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用质粒(pQE32)做表达载体构建重组质粒(pQE32-HPV18L1)，并用酶切电泳验证。将重组质粒pQE32-HPV18L1转入工程菌(M15)。用酶切电泳验证重组工程菌(pQE32-HPV18L1／M15)正确性。利用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测HPV18L1目的蛋白。采用不同浓度异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)、不同诱导时间来优化HPV18L1目的蛋白表达条件。利用Western印迹检测蛋白质(Western blot)鉴定HPV18L1目的蛋白的特异性。结果PCR扩增DNA片段约为1．7Kb。与预期结果相同。克隆重组质粒pUC19-HPV18L1酶切后显示的酶切图谱与预期相同。而且测序验证插入片段全序列无改变。表达重组质粒pQE32-HPVl8L1酶切图谱亦与预期相同。蛋白表达条件优化结果为1mmol／LIPTG诱导4h后，获得HPV18L1最佳蛋白表达量：SDS-PAGE显示，约63KD处可见目的蛋白带，与预期结果一致。Westem blot鉴定，在约63KD处可见目的条带，与预期结果一致。结论 成功构建表达重组质粒pQE32-HPV18L1并能表达HPV18L1目的蛋白。     

除透明带糖蛋白-C外杆状病毒表达的重组人ZP糖蛋白-B也能诱导获能精子顶体胞吐作用

现有资料表明不同物种的透明带（ZP）主要由3种糖蛋白组成。其或依据SDS-PAGE中迁移率被分别命名为ZP-1、ZP-2和ZP-3。或按mRNA转录物大小命名为ZPA、ZPB和ZPC。就人类而言．有实验表明重组糖基化或非糖基化人ZPC（hZPC）与获能人精子共孵育都能诱导顶体胞吐作用。鉴于不可能从天然源获得高纯度各ZP蛋白的事实。因此为了进一步了解人类受精过程中ZP糖蛋白的作用。本研究尝试用大肠杆菌和真核杆状病毒表达系统获得3种重组人ZP蛋白。进而开展相关功能研究。     

重组表达HIV不同亚型gp41蛋白的抗原表位暴露情况分析

目的通过化学发光法检测原核重组HIV I型4种不同亚型gp41膜外区蛋白对阴阳性标本的反应性,间接反映重组表达gp41膜外区蛋白的抗原表位暴露情况,为科研、临床异常标本分析提供分析方法。方法选取HIV I型4个国内主流基因型(BC、AE、B、C)膜外区序列,克隆至pGEX4T-3载体中,优化目标蛋白的纯化工艺,制备出HIV I型gp41膜外区相应蛋白作为包被抗原,与商品化gp41-HRP酶结合物配对后,夹心法进行HIV I型阴阳性标本反应性的测试,从而判断相应蛋白抗原表位暴露情况。结果HIV I型4个亚型的gp41膜外区相同区段在pGEX4T-3原核载体中均能表达出符合预期大小的目的蛋白;纯化后分别作为包被抗原,按相同浓度包被后进行HIV I型阴阳性标本的测试,结果显示不同亚型的gp41表达蛋白与商品化gp41-HRP酶反应性存在较大差异。结论通过原核表达系统高效表达了HIV I型主流亚型gp41膜外区蛋白,化学发光法组建夹心法进行阴阳性标本测试,其反应性不一致,间接反映出不同基因型选取同一表达区域进行体外重组表达其结构折叠方式有区别,此研究为HIV科研、临床标本验证等提供了基础。     

耐草甘膦基因G6原核表达蛋白条件的优化及其免疫反应性分析

目的在大肠杆菌中表达耐草甘膦基因G6,并对其进行免疫反应性分析。方法将已构建好的携带G6基因的重组质粒pET28a-G6转化到大肠杆菌BL21中诱导表达,分别从诱导温度、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度及诱导时间进行了表达条件的探索。获得的重组蛋白在非变性条件下镍亲和层析纯化后,经质谱鉴定,对其免疫反应活性进行测定,分析该原核表达蛋白与转G6基因水稻中蛋白的等同性。结果利用原核表达系统成功实现了G6重组蛋白的高效表达,其最适条件为:0.5 mmol/L IPTG、30℃和160 r/min摇床转速诱导7 h。质谱鉴定为5-烯醇式丙酮酸-莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。Western blot鉴定后,表达的重组蛋白与转G6基因水稻中的G6蛋白有相同的免疫反应性。结论利用原核表达系统表达的G6重组蛋白可以替代植物外源蛋白进行转G6基因产品的食用安全性评价,也可用于转G6基因产品ELISA检测的抗体制备。     

B组轮状病毒WH-2株vp7基因的原核表达与抗体的制备

目的：在大肠杆菌中表达人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白并制备其兔抗血清。方法：根据B组轮状病毒（GBRV）WH-2株vp7基因的全序列设计引物,用PCR的方法扩增得到vp7基因的编码区。将其克隆到原核GST融合表达载体pGEX-KG内,转化大肠杆菌E.coliDH5α,IPTG诱导表达人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白,经SDS-PAGE分离纯化表达的蛋白免疫新西兰兔,制备人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白抗血清。结果：经鉴定确认,vp7基因以正确的方式插入到载体中,此重组表达载体经IPTG诱导后,可表达相对分子量为53.4 kDa的GST-VP7融合蛋白。制备的抗血清经同样诱导表达的表达载体pGEX-KG表达产物吸收后1：500倍稀释后用Western Blot分析,与53.4 kDa的GST-VP7融合蛋白获得特异性显色信号。结论：人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白成功在大肠杆菌中GST融合表达,所表达的蛋白和制备的抗体不但为研究结构与功能提供了物质基础,也为GBRV所引起的疾病预防、诊断和治疗等流行病学研究和临床诊断奠定了基础,具有重要实际应用价值。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡配体克隆、表达及纯化

目的应用基因工程技术克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子胞外区(TRAIL)114~281片段的cDNA,构建其原核表达载体,建立原核表达体系。方法采用RT-PCR方法从外周血单个核细胞的总RNA中扩增TRAIL分子的cDNA,克隆入T载体,阳性克隆经过RT-PCR、酶切和测序鉴定。将阳性克隆中TRAIL再亚克隆至原核表达载体pET28a,构建的表达载体用RT-PCR和酶切来验证,IPTG诱导表达。融合表达蛋白复性后,再用层析纯化表达产物。结果电泳显示RT-PCR产物约500bp,与预期值一致。TA克隆RT-PCR和酶切鉴定时的片段大小也为500bp。阳性克隆测序结果与GeneBank报道一致。构建的原核表达载体经RT-PCR和酶切鉴定后用IPTG诱导后,得到大量的融合表达蛋白,此蛋白是以包涵体形式存在的,对表达的蛋白复性和纯化后,电泳显示得到一条约20kD的蛋白条带。结论成功地构建了人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子原核表达载体。     

重组人脑利钠肽与硝普钠治疗难治性心力衰竭的临床效果观察

目的观察重组人脑利钠肽与硝普钠治疗难治性心力衰竭的临床疗效。方法将102例住院治疗的难治性心力衰竭患者随机分为观察组、对照组,各51例,并分别给予重组人脑利钠肽与硝普钠,连续治疗7天后观察其疗效。结果观察组总有效率（90.20%）明显优于对照组（74.51%）,2组差异有统计学意义（P〈0.05）。两组患者左室射血分数、每搏输出量、心输出量、心脏指数、血尿素氮、超级C反应蛋白（hs-CRP）均有改善,观察组均优于对照组（P〈0.05）。结论重组人脑利钠肽可改善难治性心力衰竭患者的心功能,提高患者生存质量,其疗效优于硝普钠,其使用安全性与硝普钠相当。     

细胞穿透肽CCL融合蛋白的构建与表达

目的评估细胞穿透肽CCL融合蛋白构建的可能性。方法将CCL6 PEP 6XHis构建至pABP质粒,然后提取pABP CCL6 PEP质粒进行人胚肾HEK293细胞转染表达,以及CCL6 PEP 6XHis 蛋白层析纯化和检测。结果成功构建并纯化细胞穿透肽CCL融合蛋白。将CCL6 PEP 6XHis Tag 基因经PCR扩增、接入T 载体、克隆、培养,并提取质粒进行测序鉴定,所得序列与目的基因一致。成功将CCL6 PEP 6XHis基因构建至哺乳动物细胞表达载体pABP 中,经质粒提取和酶切鉴定,电泳结果显示,HindⅢ + XbaⅠ切出约430 bp的条带,符合预期,酶切鉴定正确。蛋白质印迹法（Western Blot）检测结果阳性,表明纯化得到的目标蛋白带有hisx6标签。结论细胞穿透肽CCL融合蛋白能够人工构建,并通过真核细胞进行表达。     

重组人脑利钠肽辅助治疗老年急性心力衰竭的临床效果观察

目的探讨人脑利钠肽(rhBNP)辅助治疗老年急性心力衰竭(AHF)临床效果。方法收集95例临床确诊的AHF老年患者,按随机数字表法分为对照组(n=47)和观察组(n=48),对照组患者仅采用常规抗心力衰竭治疗,观察组患者在常规治疗基础上,辅助应用rhBNP。连续治疗7 d后,比较2组患者治疗前后血清BNP、炎性因子水平、心功能和肾功能变化。结果观察组患者临床疗效优于对照组(P<0.05),治疗前2组上述指标水平差异无统计学意义(P>0.05)。观察组治疗后血清BNP、高敏C-反应蛋白、白细胞介素-6、血肌酐和尿素氮水平均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);24 h尿量、左心室射血分数(LVEF)高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 rh BNP辅助治疗急性心力衰竭,可有效降低患者的血清BNP和炎性因子水平,对改善心功能、肾功能具有一定的临床价值。     

重组人生长激素体外干预人肝癌细胞生长及受体表达

24、9.40±0.51、8.33±0.31,明显多于空白对照组的7.51±0.54(P＜0.05).细胞株SMMC7721弱表达GHR,细胞株QGY-7701未表达GHR,与未处理组比,rhGH干预组生长率、CFSE荧光强度、下游蛋白IGF-1、GHR表达差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 体外环境下,rhGH可以促进GHR高表达人肝癌细胞株HepG-2增殖,提高其IGF-1的表达量和增加其胞膜GHR密度;但不促进人肝癌细胞株QGY-7701、SMMC7721增殖,不能使其GHR表达状态发生改变.     

Evaluation of three recombinant multi-antigenic vaccines composed of surface and secretory antigens of Toxoplasma gondii in murine models of experimental toxoplasmosis

The great clinical and economical impact of Toxoplasma gondii infections makes the development of an effective vaccine for controlling toxoplasmosis an extremely important aim. In the presented study, we evaluate the protective and immunogenic properties of three recombinant subunit vaccines composed of rROP2 + rGRA4 + rSAG1, rROP2 + rROP4 + rGRA4 and rROP2 + rROP4 + rSAG1 proteins of T. gondii in an experimental toxoplasmosis model in the C3H/HeJ and C57BL/6 mouse strains. All three recombinant vaccines induced partial protection as measured by the reduction of brain cyst burden following challenge with five tissue cysts of the low virulence DX T. gondii strain. The level of protection was dependent on the antigen composition of the vaccine and the genetic background of the laboratory animals. The strongest protection against chronic toxoplasmosis was induced in both C3H/HeJ and C57BL/6 mice by the mixture of rhoptry proteins rROP2 and rROP4 combined with tachyzoite major protein rSAG1. The average parasite burden in these groups of mice was reduced by 71% and 90%, respectively, compared to non-vaccinated mice. The observed protective effect was related to the vaccine-induced cellular and humoral immune responses, as measured by the antigen-induced release of the Th1 cytokines IFN-γ and IL-2, the antigen-stimulated proliferation of spleen cells of vaccinated animals in comparison to control animals and the development of systemic antigen-specific IgG1 and IgG2a (C3H/HeJ) or IgG2c (C57BL/6) antibodies. Our studies show that recombinant rROP2, rROP4, rGRA4 and rSAG1 antigens may be promising candidates for a subunit vaccine against toxoplasmosis. Additionally, we demonstrate that the ideal composition of vaccine antigens can be equally effective in mice with different genetic backgrounds and variable levels of innate resistance to toxoplasmosis, resulting in strong protection against T. gondii invasion.     

Isolation of Escherichia coli O157 from human and bovine faeces in the Urbino area, Italy

We examined 476 faecal samples from subjects aged from 0 to >60 years, 283 with diarrhoea and 193 with illnesses involving other sites or clinically healthy, and 154 samples of faeces of healthy cattle, in order to define the diffusion of E. coli O157 in the Urbino area. The samples were seeded by both direct streaking onto cefixime tellurite sorbitol Mac Conkey agar (CT-SMAC) and previous enrichment in cefixime tellurite tryptone soya broth for human specimens and in cefixime vancomicin tryptone soya broth for bovine samples. The strains of E. coliO157 were characterized by verocytotoxin and adhesin eae genes detection. We isolated one strain of E. coli O157 (0.2%) from a man 68 year old who had bloody diarrhoea, and one strain (0.64%) from a weaned calf. Both isolates carried the adhesin eae gene, but only the bovine strain was VT2⁺. The study shows a low diffusion of E. coli O157 in the Urbino area, confirming the epidemiological data on the national territory.     

重组人生长激素体外干预人肝癌细胞生长及受体表达

目的研究体外环境下重组人生长激素（rhGH）对生长激素受体（GHR）不同表达状态的人肝癌细胞株增殖、凋亡及其细胞膜表面GHR密度的影响。方法体外培养人肝癌细胞株HepG-2、SMMC7721和QGY-7701,采用免疫细胞化学方法检测这3种肝癌细胞GHR的表达。每种肝癌细胞根据不同处理分为4组：未处理组、50ng／mlrhGH干预组、100ng／mlrhGH干预组、200ng／mlrhGH干预组。采用四甲基偶氮唑蓝比色法、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光染色法、酶联免疫吸附法分析不同浓度rhGH对人肝癌细胞系的细胞生长、增殖、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）分泌等的影响。流式、放射性受体分析方法检测rhGH处理后细胞膜表面GHR表达情况。结果细胞株HepG-2高表达GHR;与未处理组相比,50、100、200ng／mlrhGH干预24h后生长率明显增高为：107．705％、114．181％、107．406％（P〈0．05）,48h后生长率明显增高为：109．594％、114．156％、109．292％（P〈0．05）;CFSE荧光强度明显减弱（P〈0．05）;50、100、200ng／mlrhGH干预组24h后下游蛋白IGF-1分别为（236．94±19．07）、（247．16±14．56）、（217．94±33．61）pg／ml,明显高于未处理组的（173．86±27．46）pg/ml（P〈0．05）;50、100、200ng／mlrhGH干预后,流式细胞术检测胞膜表面GHR表达情况,荧光强度较未处理组明显增加（P〈0．05）;放射性受体分析法检测50、100、200ng／mlrhGH干预后胞膜表面GHR位点数（10^3／细胞）分别为：8．44±0．24、9．40±0．51、8．33±0．31,明显多于空白对照组的7．51±0．54（P〈0．05）。细胞株SMMC7721弱表达GHR,细胞株QGY-7701未表达GHR,与未处理组比,rhGH干预组生长率、CFSE荧光强度、下游蛋白IGF-1、GHR表达差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论体外环境下,rhGH可以促进GHR高表达人肝癌细胞株HepG-2增殖,提高其IGF-1的表达量和增加其胞膜GHR密度;但不促进人肝癌细胞株QGY-7701、SMMC7721增殖,不能使其GHR表达状态发生改变。