人脐带动脉旁、静脉旁与华通氏胶间充质干细胞的血管生成能力比较及移植安全性评价

目的探讨人脐带动脉旁、静脉旁与华通氏胶间充质干细胞的血管生成能力及其生物安全性。方法分离培养人脐带动脉旁、静脉旁与华通氏胶间充质干细胞,流式细胞仪鉴定表面标记物,体外分化实验检测其多向分化潜能,免疫荧光法检测血管旁细胞标记物,体外成环检测三种干细胞的血管生成能力差异;三种干细胞移植入NOD-SCID小鼠检测其生物安全性。结果三种干细胞表达间充质干细胞标记物,具有多向分化潜能,脐带动脉旁干细胞表达丰度更高的血管旁细胞标记物,且体外血管生成能力更强;三种干细胞移植后3月,小鼠主要器官无明显形态学损伤与异常。结论人脐带动脉旁干细胞血管生成能力更强;三种干细胞移植NOD-SCID小鼠无显著成瘤性,安全可行。     

大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究

 目的 分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）,并行多向分化潜能的鉴定。方法 经Percoll梯度分离法获得大鼠骨髓单个核细胞。贴壁培养后,通过倒置显微镜进行细胞形态学观察,并采用流式细胞术进行分析。传至第3代后,分别进行成脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞的诱导,并行免疫组织化学鉴定。结果 骨髓间充质干细胞大小较为均匀,基本上呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积增大,成纤维样细胞逐渐增多。经反复传代纯化的MSCs检测CD71、CD29呈阳性表达并证实骨髓间充质干细胞经诱导后分化为脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞。结论 在体外,大鼠骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

脐带间充质干细胞在阿尔茨海默病及促神经分化中的研究进展

<正>阿尔茨海默病(AD)早在临床症状出现前就已发生神经病理改变，最终发展为严重的痴呆。间充质干细胞(MSCs)移植治疗技术是近年来新兴的细胞修复治疗技术。脐带间充质干细胞(UC-MSCs)具有多向分化潜能，移植后可改善AD导致的认知功能障碍。可靠的体外诱导方式可以促进MSCs靶向神经元分化，提高生物利用率。本文着重对UC-MSCs的特性和优势、治疗AD可能的机制、体外诱导靶向分化的方式展开综述，旨在为UC-MSCs治疗AD的实验和临床研究提供理论依据，为治疗AD寻找新思路。     

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏

目的：探讨从人脐带华通氏胶（Wharton’s jelly,WJ）中分离、培养、鉴定间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）及其冻存、复苏的方法。方法：采用植块法分离、培养间充质干细胞,流式细胞仪检测P3代细胞免疫表型,鉴定其向成骨、成脂方向诱导分化的能力;将P1细胞冻存6个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果：植块法容易从人脐带华通氏胶中获得间充质干细胞;组织块贴壁后6 d可见组织块周围细胞爬出,原代培养14~18 d细胞融合70%~80%;P3代细胞强烈表达CD73、CD90、CD105,不表达CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR;成骨诱导分化后10 d,可见明显钙结节;成脂诱导14 d,有明显的脂滴出现,油红O染色阳性。冻存再复苏细胞活力达80%,细胞免疫表型及成骨、成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性。结论：组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离、培养出纯度较高间充质干细胞,冻存、复苏不改变其特性。     

脐带华通胶间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的 探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养方法 ,并通过成脂成骨诱导及表面标记物的检测进行鉴定.方法 剔除脐带动脉、静脉和外膜,取遗留的华通胶组织,将其剪成细小的碎块,用浓度为0.2%的Ⅱ型胶原酶消化,提取脐带华通胶间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44、CD90、CD105、CD73、HLA-ABC、CD34、CD45及HLA-DR,成骨细胞、成脂细胞分化诱导.结果 脐带华通胶经胶原酶消化后,可提取大量间充质干细胞,流式细胞仪检测脐带华通胶干细胞不表达造血干细胞的表面特征,而表达间充质干细胞的标志,例如CD44、CD90、CD105及CD73,并且干细胞HLA-ABC阳性表达,CD34、CD45及HLA-DR呈阴性.组织化学染色显示茜素红、碱性磷酸酶及油红染色强阳性.结论 该方法 可较好地分离脐带华通胶间充质干细胞.将为实验研究和临床应用提供一种新的干细胞来源.     

大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及分化潜能研究

目的建立一种体外分离、培养和扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性,为利用MSCs进行多种疾病的细胞治疗提供实验基础. 方法分离6～8周龄的大鼠胫骨、股骨,用DMEM/F12培养基冲出骨髓,采用Percoll淋巴细胞分离液获得骨髓中的单个核细胞,并结合MSCs的贴壁特性,获得大鼠MSCs,体外扩增.体外进行多向诱导分化鉴定分离的细胞,并测定传代细胞的生长曲线、观察其接种贴壁率、检测细胞周期和超微结构.结果体外培养的MSCs生长状况良好,并能迅速扩增,具有分化形成成骨和成脂肪细胞的能力;MSCs倍增时间约为28.8h;传代后10h贴壁达95.5% 以上;细胞周期显示有92%细胞处于G0/G1期;电镜显示的结果进一步证实MSCs具备了干细胞的结构特点.结论在本实验条件下,体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定,传代后的细胞适应性强,增殖较快,超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点.使干细胞用于移植治疗、基因治疗成为可能.     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。     

骨髓间充质干细胞的生物学特性及在骨软骨组织工程中的作用

骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells MSCs)是一类具有自我更新与多向分化能力的成体干细胞，存在于骨髓基质系统中，因其能分化为骨、软骨、脂肪、纤维组织祖细胞和骨髓支持基质等多种间充质组织而得名。MSCs在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。正常情况下，MSCs可以分化为与其组织来源一致的细胞，但有时也不遵守该规律，表现出横向分化能力。MSCs在体外培养亦表现出多向分化潜能，在不同的诱导条件下可以向成骨、成软骨、成肌肉、成脂肪、分化及中胚层以外的细胞，如神经元等。     

人脐带间充质干细胞的培养鉴定及其向神经元细胞分化的研究

目的研究脐带间充质干细胞（UC-MSCs）在体外分离、培养、扩增和鉴定以及向神经元分化的方法.方法 30例符合入选标准的脐带采用贴壁法分离得到UC-MSCs,选用20%FBS血清培养液进行原代培养,再选用10%FBS扩增培养液进行一般传代.用神经分化培养基诱导UC-MSCs向神经细胞分化,在荧光显微镜下观察细胞形态,透射电镜观察UC-MSCs超微结构,用流式细胞仪分析其表面特性,采用直接和间接免疫荧光法检测细胞悬浮液的表型特征,用抗人神经纤维M、突触素、微管蛋白、半乳糖神经酰胺的单克隆抗体检测各代之间神经诱导形成率.结果 12 h后细胞开始贴壁生长,超微结构观察表现出未分化细胞的特征,CD123、CD49、CD29、CD73和CD166均为阳性,免疫荧光检测人UC-MSCs分化成神经细胞.结论 UC-MSCs长期传代培养,生物学特性稳定,具有向神经细胞分化的潜能.     

人胚胎关节软骨来源的间充质干细胞

目的: 研究从人胚胎关节软骨中分离的细胞的特性、对其表面标志进行鉴定,探讨其多向分化潜能.方法: 从12～20周人胚胎关节软骨中分离细胞,观察细胞的形态、生长状态,采用流式分析的方法对其表面标志进行鉴定并探讨其成骨、成脂、成软骨以及成神经元样细胞的多向分化的潜能.结果:(1)从人胚胎关节软骨中分离的细胞,细胞形态均一,以梭形为主,生长旺盛,可传20代.(2)对不同代的细胞进行流式鉴定,发现其表面标志CD 44、CD 147、CD 90为阳性,CD 34、CD 45、HLA-DR为阴性,与骨髓来源的间充质干细胞的表面标志相似.(3)对其进行成骨、成脂、成软骨、成神经元样细胞的诱导,发现软骨来源的细胞具有多向分化的能力.结论: 从人胚胎关节软骨中可获得间充质干细胞.     

脐带间充质干细胞研究进展

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞,广泛存在于全身多种组织中,可在体外培养扩增,并能在特定条件控制下分化为神经细胞、成骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等[1],在细胞替代治疗及组织工程方面有极大的应用价值.目前,MSCs主要来源于骨髓,但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能,且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势,故寻找一种能替代骨髓并可弥补其缺陷的间充质干细胞来源,已越来越受到各国学者的关注.脐带间充质干细胞作为一种多潜能干细胞,成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多限制,成为干细胞领域的研究热点.本文就近年来国内外在脐带间充质干细胞方面的相关研究进行总结和分析,对脐带间充质干细胞的分离培养、生物学特性以及分化能力等问题作简要综述.     

SD大鼠皮质骨来源间充质干细胞的培养与鉴定

【目的】研究大鼠皮质骨来源间充质干细胞(MSCs)的分离培养及鉴定的方法。【方法】取SPF级体质量60~80 g的SD大鼠3只,运用骨髓贴壁法及胶原酶消化皮质骨法培养间充质干细胞,进行形态学观察、体外增殖能力考察、细胞周期分析、细胞表面抗原免疫荧光鉴定,并采用茜素红染色和油红O染色鉴定所培养细胞的成骨与成脂分化潜能。【结果】胶原酶消化皮质骨法及骨髓贴壁法均能有效分离纯化大鼠MSCs,经形态学、细胞表面抗原免疫荧光鉴定、成骨及成脂分化能力检测证实为间充质干细胞。【结论】自骨髓及皮质骨均能实现间充质干细胞的分离纯化,但皮质骨间充质干细胞来源广泛,原代不受血细胞干扰,是骨髓来源间充质干细胞的很好补充。     

人脐带间充质干细胞原代培养方法的改良

目的: 探讨体外组织块培养原代人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的改良方法,并观察其形态,免疫表型,成脂成骨分化等生物学特性。方法: 从健康足月儿获得脐带,将血管剥离后,余下的结缔组织剪成小块,分别用传统植块法和改良植块法分离培养原代hUC MSCs。MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞免疫表型,成脂成骨诱导分化检测其分化潜能,化学染色鉴定诱导分化结果。结果： 改良植块法脐带组织贴壁培养3～4 d即可从组织块边缘长出长梭形成纤维样原代细胞,5～6 d后细胞可长满80%,比传统植块法原代细胞培养周期缩短了一半以上时间,细胞传代后流水状或漩涡状生长,MTT法显示细胞增殖能力强,流式细胞仪检测提示CD90, CD105,CD73,CD166,CD29,CD44均阳性表达,阳性率均在95%以上,CD45和HLA-DR均阴性表达,阳性率低于2%;诱导分化实验及化学染色结果证实, 该细胞具有成脂和成骨多向分化潜能。结论：应用与酶消化法相结合的改良植块法可以获得hUC-MSCs,比传统植块法缩短了原代培养周期,提高了细胞培养效率,所获得细胞贴壁生长,增殖能力强,表达间充质干细胞相关免疫表型,具有多向分化潜能,可在科研和临床应用中作为种子细胞来源。     

无动物源成分培养基用于人脐带间充质干细胞培养的研究

目的建立一种无动物源成份无血清的间充质干细胞培养基XF/SF-MSCM,并探讨其支持人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)体外增殖、维持分化潜能的效果。方法组织块贴壁法分离获得原代人脐带间充质干细胞,P1代起分别使用自制的XF/SF-MSCM培养基与含10%胎牛血清的传统培养基(SC-MSCM)对脐带间充质干细胞进行连续培养传代至P6代,观察比较两组P6代细胞的形态及增殖能力,以流式细胞术检测连续传代后细胞的免疫学表型,比较其成骨、成脂肪的分化潜能。结果分离获得的原代P0脐带间充质干细胞,分别在XF/SFMSCM与SC-MSCM两种培养基中连续培养传代,细胞增殖能力及形态无显著差别。两组P6代细胞的生长曲线相似,但XF/SF-MSCM组间充质干细胞贴壁的紧密程度稍低;流式细胞检测结果显示,XF/SF-MSCM组细胞保持了间充质干细胞的免疫学表型,高表达CD29、CD44、CD90,不表达CD31、CD34、CD45并维持了良好的成骨和脂肪细胞的分化能力。结论本室制备的无动物源成份无血清培养基XF/SF-MSCM可支持脐带间充质干细胞的体外扩增,维持其免疫学表型及分化潜能,提供数量充足的高质量间充质干细胞,满足临床治疗及生物医学研究的需要。     

人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.     

人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.     

3种人类间充质干细胞体外增殖能力和成脂能力的比较

目的: 从人足月胎儿的脐带组织和胎盘组织中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,观察人脐带组织MSCs（UC-MSCs）、胎盘组织MSCs（PL-MSCs）和胚胎组织MSCs（FT-MSCs）体外增殖能力和成脂分化潜能,为干细胞进一步应用于临床提供实验依据。方法: 无菌条件下获取人足月胎儿脐带组织和胎盘组织,通过Ⅰ型胶原酶酶解法分离出UC-MSCs和PL-MSCs,FT-MSCs由中科生物工程有限公司提供,取第3或4代MSCs进行检测。倒置显微镜观察细胞形态;活细胞计数法检测细胞增殖能力;流式细胞术测定UC-MSCs、PL-MSCs和FT-MSCs细胞周期并鉴定细胞表面标志物的表达阳性率。取3种组织来源的第3代MSCs进行成脂诱导,诱导18 d进行油红O染色,观察并比较3种不同组织来源MSCs的成脂能力。结果：从3种不同组织中均可获取梭形贴壁的MSCs,表面标记物CD44、CD73、CD90和CD105均呈阳性表达,CD14、CD34和CD45均为阴性表达;FT-MSCs增殖能力明显强于UC-MSCs和PL-MSCs（P<0.01）,FT-MSCs、UC-MSCs和PL-MSCs的增殖指数（PI）分别为(36.66±1.30)%、(18.23±1.10)%和(10.03±1.20)%,3种MSCs的PI比较差异均有统计学意义(P<0.01)。3种MSCs经过成脂诱导液诱导后,油红O染色结果均为阳性,但是UC-MSC s体外成脂能力(油红O染色阳性率)明显强于FT-MSCs和PL-MSCs(P<0.01)。结论：3种不同组织来源MSCs在形态和细胞表面标记物等方面相似,FT-MSCs具有更强的增殖能力和增殖活性,UC-MSCs具有更强的体外成脂潜能。     

人早期胚胎源性间充质干细胞的体外分离培养及其生物学特性

目的：建立人早期胚胎源性间充质干细胞（MSCs）的体外分离培养方法,并对其生物学特性加以鉴定。 方法：将胚龄5～6周的胚胎组织经0.25%胰蛋白酶消化7~10 min后获得分离细胞悬液,MSCs培养基纯化贴壁细胞,流式细胞术检测细胞表型特征,MTT法和碘化丙啶(PI)标记测定细胞增殖活性和细胞周期,条件培养液诱导法鉴定其多向分化潜能。 结果：采用组织消化法从人早期胚胎组织中分离获得MSCs,表面标志CD29、CD44、CD73、CD105、CD166呈阳性表达,CD34、CD45和HLA-DR为阴性表达;细胞倍增时间为23 h;细胞在成脂诱导条件下可见脂滴形成,成骨诱导2周后细胞碱性磷酸酶染色显示类骨结节区呈棕黑色(活性明显增强),茜素红染色可见钙盐沉积。结论：人早期胚胎源性MSCs与成体MSCs表型一致,具有成脂和成骨分化潜能。     

人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。方法收集健康足月新生儿脐带组织,采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面抗原,将细胞冻存3个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高;细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105,不表达造血干细胞表型CD34、CD45等;冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞,为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。     

筛选后的巢蛋白阳性细胞流式鉴定及诱导分化

目的观察胎儿胰腺来源的巢蛋白阳性细胞(符合医学伦理学)是否具有与间充质干细胞类似的表面标志以及多向分化的潜能.方法从胎儿胰腺中分离的巢蛋白阳性细胞筛选后进行扩增,用流式细胞仪分析表面标志,并探讨这类细胞的成脂和成骨的分化潜能.结果筛选纯化后的巢蛋白阳性细胞的表面标志与骨髓间充质干细胞表面标志相似:此类细胞可在体外诱导为脂肪细胞或骨细胞.结论筛选纯化的胎儿胰腺来源的巢蛋白阳性细胞具有一定间充质干细胞的特性.