腺病毒介导的HSV—tk基因治疗大鼠脑胶质瘤实验研究

目的：带有ＨＳＶ－ｔｋ基因的重组腺病毒（ＡｄＨＣＭＶ－ｔｋ）结合核苷类似物（ＮＡ）治疗大鼠Ｃ６脑胶质瘤。方法：用Ｘ－ｇａｌ染色测定ＡｄＨＣＭＶ－ｌａｃＺ转染大鼠Ｃ６胶质瘤细胞的效率。用ＡｄＨＣＭＶ－ｔｋ／ＡＣＶ、ＧＣＶ离体及活体治疗大鼠Ｃ６胶质瘤。结果：ＡｄＨＣＭＶ－ｌａｃＺ感染Ｃ６细胞效率达１００％，ＡｄＨＣＭＶ－ｔｋ感染Ｃ６细胞，在病毒感染复数为１０００时，ＧＣＶ和ＡＣＶ半致死剂量分别为３μｇ／ｍｌ和２０μｇ／ｍｌ，Ａｄ－ＨＣＭＶ－ｔｋ／ＡＣＶ治疗大鼠Ｃ６胶质瘤模型，大鼠生存期超过９０天，而对照组分别为１７．０±１．６天（生理盐水组）、１４．５±１．３天（ＡｄＨＣＭＶ－ｌａｃＺ组），Ｐ＜０．００１。结论：重组腺病毒对靶细胞感染效率可达１００％，ＡｄＨＣＭＶ－ｔｋ用ＧＣＶ的杀伤Ｃ６胶质瘤细胞比ＡＣＶ强，而ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ用腺病毒介导治疗大鼠脑肿瘤疗效显著。     

脑胶质瘤的基因治疗与病毒治疗研究进展

由于脑胶质瘤肿瘤干细胞亚群的耐药性及药物难以通过血-脑屏障和脑组织免疫抑制等特点,目前的常规治疗手段并未明显提升患者的生存时间及生活质量.因此,在分子生物学进步的支持下,对脑胶质瘤新疗法的探索仍在继续.基因治疗包括将治疗用的遗传物质传送到肿瘤细胞中,从而产生特定的抗肿瘤效应.此外,因病毒具有强烈的细胞毒性作用和易于修饰...     

人原代胶质瘤细胞自杀基因治疗体外研究

目的：应用原代培养的胶质瘤细胞作不研究对象,观察ＡＣＶ对转染了ＨＳＶ－ｔｋ基因的肿瘤细胞的杀伤作用。方法：表达单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－ｔｋ）重组逆转录病毒载体ＳＴＫ,经包装细胞ＰＡ３１７包装成重组逆转录病毒,ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度,用此病毒感染原代培养的人胶质瘤细胞,以Ｇ４１８选择后获得ＴＫ＋肿瘤细胞。ＭＴＴ法及活细胞动态观察ＡＣＶ对转基因细胞的毒性作用。结果：ＡＣＶ对ｔｋ＋胶质瘤细胞     

重组腺病毒载体介导血管抑素基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究

目的 研究以重组缺陷型腺病毒为载体的血管抑素基因治疗脑胶质瘤。方法 RTPCR法克隆angiostatin基因,构建携带血管抑素（angiostatin）基因的重组腺病毒载体,体外检测angiostatin的重组腺病毒载体对内皮细胞生长的抑制作用。建立皮下及脑胶质瘤大鼠模型,给予体内基因治疗。结果 克隆得到约1.1kb的angiostatin基因。构建重组腺病毒载体AdhCMV-AGS,体外试验表明,可以强烈抑制内皮细胞的生长。体内试验表明重组腺病毒可以在体内有效表达Angiostatin,并且有效抑制胶质瘤的生长,使荷脑胶质瘤大鼠存活90天以上。结论 以重组腺病毒为载体的血管抑素基因治疗脑胶质瘤效果显著,将是一种基因治疗的新策略。     

胸苷激酶基因治疗脑胶质瘤25例报告

目的 报告25例脑胶质细胞瘤用含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的逆转录病毒载体生产细胞（pLTKcSN/VPC）注入和羟甲基无环鸟苷（GCV）全身给药治疗脑胶质瘤2～5年随访观察（失访1例）的结果,并拟申请Ⅱ期临床试验。方法 选择大脑半球侧脑室外区确诊为脑胶质瘤的病例,在直视或显微镜下行全切除或大部分切除术,残腔周围脑组织内每隔1cm、深1.5cm用微量注射泵注入预制的基因工程细胞,10～14d后开始每天2次静脉内滴入GCV5mg·kg-1·12h-1,共14d,术后4～5周按常规给予化疗药物氯乙环已亚硝脲（CCNU）和（或）表鬼臼毒噻吩糖苷（VM26）。同时,与我院以往病情相近的经常规治疗的30例恶性胶质瘤（间变型29例,多形性胶质母细胞瘤1例）的生存率相比较。结果25例均安全渡过围手术期。在22个月以前,基因治疗组的情况均优于手术加化疗（ACCNU和VM26）的常规治疗组。基因组的中位生存时间为（470±93.17）d,12个月的生存率为0.6,18个月为0.35;常规治疗组的中位生存时间为（395±93.15）d,12个月的生存率为0.5,18个月为0.33。1例间变型少突胶质瘤患者至今已正常生活60.3个月;1例间变型星形细胞瘤患者已正常生活25个月,尚未见再发征象;另有1例多形性胶质母细胞瘤在2年时MRI才见有肿瘤扩增（47.9个月后失访）;4例星形细胞瘤术     

HSV-tk基因/GCV系统治疗鼠脑胶质瘤实验研究

探索ＨＳＶ－ｔｋ基因／ＧＣＶ系统对大鼠脑胶质瘤的体内外治疗效果。方法：用ＰＡ３１７细胞包装ＳＴＫ质粒,形成产病毒细胞ＰＡ３１７ｔｋ,产生假逆转录病毒颗粒,ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度。９６孔培养板接种２４孔Ｃ６细胞,２４孔Ｃ６ｔｋ＾＋细胞,４８小时后换入含ＧＣＶ的培养液,ＧＣＶ浓度按０、０．２５ｕｇ／ｍｌ、０．５ｕｇ／ｍｌ、０．７５ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌ、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｇ     

恶性脑胶质瘤的基因治疗

恶性胶质瘤是最常见的颅内肿瘤 ,传统的治疗方法主要有外科手术、放疗、化疗 ,但是疗效均不甚理想。 1 992年Ｏｌｄｆｉｅｌｄ首次采用基因治疗恶性脑胶质瘤患者并取得一定疗效后 ,得到众多学者的认同和参与 ,并在全球得以深入开展。目前恶性脑胶质瘤基因治疗主要采用自杀基因 (ＴＫ、ＣＤ) ,抑癌基因 (Ｐ53、Ｐ1 6、Ｐ2 1 ) ,细胞因子免疫基因 (ＩＬ2、ＩＬ4、ＩＦＮａ)、反义基因 (ＶＥＧＦ、ＴＧＦ ａ、ＥＧＦＲ)等方法。在治疗中涉及的技术因素主要有基因的转移 ,基因治疗的策略等。现将有关内容综述如下。1　基因的转移　基因指编码蛋…     

慢病毒在大鼠胶质瘤细胞基因转导中的应用

目的应用慢病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因转导大鼠9L胶质瘤细胞。方法构建慢病毒表达质粒pLenti6/V5-TK并以PCR、酶切及测序等方法鉴定。利用ViraPowerTM慢病毒表达系统,将重组质粒与包装混合物（Packaging Mix）共同转染293T细胞生产假病毒颗粒,转染48 h后收集培养上清,用其感染大鼠9L胶质瘤细胞,以抗稻瘟菌素（BSD）筛选出9L-TK细胞。RT-PCR、Western blot方法检测TK基因在9L-TK细胞中的表达。用MTT方法测试更昔洛韦（GCV）对体外培养的9L-TK细胞杀伤效果。结果构建的重组质粒pLenti6/V5-TK经PCR、酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达2.7×10^5转导单位（TU）/ml。经BDS筛选获得的9L-TK细胞RT-PCR及Western blot结果显示TK基因表达阳性,且GCV对该细胞作用敏感。结论成功利用慢病毒实现了TK基因转导大鼠9L胶质瘤细胞。     

γ-干扰素基因治疗大鼠胶质瘤的实验研究

目的 研究逆转录病毒载体包装细胞介导的细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)基因治疗大鼠胶质瘤。方法 应用逆转录病毒载体将鼠IFN-γ基因转入逆转录病毒包装细胞PA317，通过G418抗性筛选，得到高滴度产毒PA317IFN-γ细胞株。将PA317IFN-γ细胞注射到脑内荷瘤大鼠的肿瘤组织内，观察其治疗作用。结果 成功获得高滴度产毒PA317IFN-γ细胞，PA317IFN-γ细胞瘤内注射能够诱导大鼠产生抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤细胞生长。结论 携带IFN-γ基因的逆转录病毒包装细胞瘤内注射是一种有效的胶质瘤基因治疗方法。     

胸苷激酶基因治疗人脑胶质瘤SHG44的研究

构建了含有ｐｇｋ启动子驱动的ＨＳＶ－ｔｋ基因的反转录病毒载体ｐＬＮＴＫ，并成功地转移至人脑胶质瘤ＳＨＧ４４细胞。体内实验证实，ＡＣＶ可抑制ＳＨＧＬＮＴＫ的肿瘤形成，并可抑制ＳＨＧＬＮＴＫ肿瘤的生长。原位基因转移治疗ＳＨＧ４４肿瘤效果明显。提示其可作为脑肿瘤治疗的一种新方法。     

腺病毒介导HSV-tk和反义IGF-1联合基因治疗鼠脑胶质瘤

目的　研究腺病毒介导 Ｈ Ｓ Ｖｔｋ／ Ｇ Ｃ Ｖ 系统和反义 Ｉ Ｇ Ｆ１ 联合基因治疗大鼠脑胶质瘤,并对其机制作初步分析。方法　利用腺病毒为载体观察联合 Ｈ Ｓ Ｖｔｋ／ Ｇ Ｃ Ｖ 和反义 Ｉ Ｇ Ｆ１ 离体杀伤 Ｃ６细胞的效果, 并在大鼠脑内接种 Ｃ６ 细胞第８ 天进行 Ｈ Ｓ Ｖｔｋ／ Ｇ Ｃ Ｖ 和反义 Ｉ Ｇ Ｆ１ 的原位治疗, 观察大鼠生存期变化。结果　 Ｇ Ｃ Ｖ 对转染反义 Ｉ Ｇ Ｆ１ 基因和ｔｋ 基因的 Ｃ６ 细胞较转染ｔｋ 基因的 Ｃ６ 细胞敏感。联合应用 Ｈ Ｓ Ｖｔｋ／ Ｇ Ｃ Ｖ 系统和反义 Ｉ Ｇ Ｆ１ 原位治疗脑肿瘤比单用任何一种治疗方法效果明显, 免疫组化发现联合基因治疗组肿瘤有大量 Ｃ Ｄ＋４ 、 Ｃ Ｄ＋８ 淋巴细胞浸润。结论　反义 Ｉ Ｇ Ｆ１ 基因可增强 Ｈ Ｓ Ｖｔｋ／ Ｇ Ｃ Ｖ 杀伤肿瘤的作用。     

HSV—tk基因／GCV系统治疗脑胶质瘤时的免疫反应

目的 探讨tk基因治疗脑胶质瘤时的免疫反应与旁观者效应的关系。方法 将C6tk^ 与C6tk^-按0％tk^ ,10%tk^ ,30^tk^ 、50%tk^ 、100%tk^ 五种比例混合,接种于SD鼠右侧顶叶,7天后腹腔注射GCV（更昔洛韦）,剂量为30mg/kg/day,共10天。细胞接种3周后,处死动物,计算成瘤率,作病理检查,并作CD4^ 、CD8^ 的免疫组化染色。结果 50％及100％C6tk^ 组的在瘤率明显小于其余3组（P＜0．05）,病理检查发现50％及100％tk%^ 组有淋巴细胞及浆细胞浸润。免疫组化显示每一组之间均有差异,提示有免疫反应存在。结论 tk基因治疗脑胶质瘤时,可激起机体内的免疫反应,增强抗肿瘤作用,它是旁观者效应作用机制之一。     

hTERT Promoter/HSV-tk靶向性胶质瘤基因治疗系统的构建

目的　构建hTERTPromoter/HSV tk靶向性胶质瘤基因治疗系统。方法　采用TSS法在大肠杆菌JM 10 9中扩增 pGL2 hTERTPromoter和STK质粒。DNA提取纯化试剂盒提取细菌中生长的质粒 ,经电泳 ,紫外分光光度计检验后用HindⅢ ,ClaⅠ核酸内切酶对这两个质粒同时进行双酶酶切。琼脂糖电泳凝胶分离酶切片段 ,切取其中 8.5 ,1.7kbp两个片段长度的凝胶。凝胶DNA提取试剂盒提取其中所含DNA片断 ,T4DNA连接酶连接这两个片段 ,琼脂糖凝胶电泳检测连续结果。结果　通过连接反应获得 10 .2kbp的重组DNA片段。结论　成功构建hTERTPromoter/HSV tk重组表达单位。     

人类野生型p53基因对9L胶质肉瘤的抑制作用

目的：观察人类野生型ｐ５３基因对ｐ５３突变的大鼠胶质肉瘤细胞９Ｌ的抑制作用。方法：在体外用逆转录病毒载体转移人野生型ｐ５３基因到９Ｌ胶质肉瘤细胞中，经Ｇ４１８筛选后，体外培养和大鼠体内接种；观察瘤细胞形态和肿瘤重量变化，用免疫组化法检测人ｐ５３蛋白的过度表达。结果：人野生型ｐ５３基因在体内体外均可明显抑制９Ｌ瘤细胞的生长，皮下肿瘤抑制率６２．９３％，脑内肿瘤抑制率为８５．１８％。转ｐ５３基因后肿瘤分化程度提高，部分肿瘤有非肿瘤性纤维母细胞增生和大量浆细胞浸润，瘤细胞生长状态欠佳。结论：转移异源性ｐ５３基因可以重建ｐ５３的肿瘤抑制功能；并可能增强免疫系统对表达异源性ｐ５３蛋白的瘤细胞的识别，激发抗肿瘤免疫反应。因此产生双重的抗肿瘤作用，有潜在的临床应用价值。     

逆转录病毒载体介导中国单疱病毒TK基因转导脑胶质瘤细胞

目的：研究载中国单疱病毒胸苷激酶基因逆转录病毒重组体（ＲＶ－ＨＳＶ－ＴＫｃ）和羟甲基无环鸟苷（ＧＣＶ）体外转染和杀伤脑胶质瘤效果，探索应用该系统基因治疗脑胶质瘤。方法：ＲＶ－ＨＳＶ－ＴＫｃ重组体病毒感染胶质瘤细胞，Ｇ４１８筛选转染阳性胶质瘤细胞克隆。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测抗Ｇ４１８胶质瘤细胞中的ＴＫｃ基因表达。药物敏感实验观察ＴＫｃ胶质瘤细胞对ＧＣＶ的毒性反应。结果：１．０ｍｇ／ｍｌＧ４１８筛选１０～１４天获抗性胶质瘤细胞克隆；Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示抗Ｇ４１８细胞ＴＫｃ基因明显表达；ＴＫｃ胶质瘤细胞对ＧＣＶ高度敏感，其ＥＤ５０为：Ｃ６ＴＫｃ０．０２μｇ／ｍｌ，Ｕ２５１ＴＫｃ０．００６μｇ／ｍｌ，Ｕ８７ＴＫｃ０．００４μｇ／ｍｌ，ＴＫｃ胶质瘤细胞对ＧＣＶ的敏感性是非转基因胶质瘤细胞的５００倍以上。结论：载中国ＴＫｃ基因逆转录病毒重组体可有效转染脑胶质瘤细胞并使其对ＧＣＶ高度敏感，该系统可望用于脑胶质瘤的基因治疗。     

腺病毒介导反义IGF-1抑制鼠胶质瘤细胞增殖的实验研究

目的重组腺病毒反义ＩＧＦ－１基因（ＡｄＨＣＭＶ－ＩＧＦ－１Ａ）治疗大鼠Ｃ６胶质瘤。方法体外克隆反义ＩＧＦ－１３００ｂＰ基因片段重组入腺病毒,经扩增纯化,测定滴度,体外体内感染Ｃ６胶质瘤细胞,观察ＩＧＦ－１的表达及肿瘤大小、生存期变化。结果重组腺病毒反义ＩＧＦ－１滴度６．５×１０１０ｐｆｕ／ｍｌ,反义ＩＧＦ－１基因序列正确,体外Ｃ６－Ａｄ－ＩＧＦ－１Ａ的ＩＧＦ－１表达降低,Ａｄ－ＩＣＦ－１Ａ治疗皮下Ｃ６肿瘤细胞接种组,肿瘤完全消失。与对照组相比有显著性差异（Ｐ＜０．０１）,Ａｄ－ＩＧＦ－１Ａ治疗脑内Ｃ６肿瘤细胞接种组,大鼠生存期超过９０天,而对照组分别为１６．５±１．４天（Ａｄ－ｌａｃｚ组）、１５．７±１．６天（生理盐水组）,Ｐ＜０．００１。结论重组腺病毒反义ＩＧＦ－１可抑制Ｃ６细胞ＩＧＦ－１的表达,ＡｄＨＣＭＶ－ＩＧＦ－１Ａ治疗大鼠Ｃ６胶质瘤效果显著。