荧光RT-PCR同步检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型方法的建立及应用

目的建立快速、灵敏、特异的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的荧光PCR检测及分型方法。方法针对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的特异性保守基因vp1基因分别设计一对引物和对应的探针,对荧光RT-PCR反应体系进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和重复性,并对临床样品进行检测分析。结果该方法对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的检测有高度特异性,与甲肝、腮腺炎、风疹、乙型脑炎等病毒均无交叉反应,检测灵敏度可达10拷贝/μl;43例患儿肛拭子标本中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型检测率分别为37.21%(16/43)和13.95%(6/43)。结论荧光RT-PCR法分型检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的方法具有快速、便捷、特异、灵敏等特点,适用于肠道病毒的早期诊断。     

EV71-CA16肠道病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒的研制

目的研制一种能同时检测EV71,CA16肠道病毒的二联实时荧光定量PCR检测试剂盒,主要用于EV71,CA16肠道病毒的快速检测和流行病学监测。方法设计特异度的EV71型、CA16型基因的引物和探针,优化实时荧光定量PCR检测体系,并研究产品的灵敏度、精密度、稳定性和检测线性范围;同时对2014年5月份收集的26份样品进行检测。结果试验得到了阳性重组质粒,线性范围在5*102 copies/μl～105 copies/μl,该范围内检测结果良好;优化后肠道病毒CA16上下游引物和探针浓度分别为0.48,0.24μmol/L,EV71上下游引物和探针浓度分别为0．40,0.20 μmol/L。敏感度达到500 copies/μl,重复性变异系数CV≤5％;该荧光定量PCR检测试剂盒稳定性强,在-20℃下可以保存一年,对EV71,CA16肠道病毒具有良好的特异度。用该方法检测20份临床阳性样品和6份阴性样品,阳性检出率为100％(20/20),阴性检出率为100％(6/6)。结论试验建立的EV71,CA16肠道病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于EV71,CA16肠道病毒的临床诊断。     

荧光定量RT—PCR检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型

手足口病及相关临床综合征是危害儿童健康的重要疾病。自20世纪60年代逐渐明确其病原体以来,手足口病已在全世界范围内引起多次暴发或流行,累及地域广泛、人口众多。Cox．A4、A5、A9、A10、A16,Cox．B5和EV71型等多种肠道病毒均可引起手足口病,但EV71和Cox．A16是引起手足口病的主要的病原体,常相伴造成手足口病的暴发或流行。及时检测EV71和Cox．A16,为临床医生提供必要的实验诊断依据。用荧光定量RT-PCR进行检测了我院收治的儿童手足口病患者标本中EV71和Cox．A16。     

检测EV71和EV-U的TaqMan-LNA探针多重荧光RT-PCR的建立

目的 建立一种针对手足口病病原体的快速准确检测方法。 方法 利用TaqMan-LNA探针建立多重荧光定量RT-PCR方法,同时检测肠道病毒71型(EV71)和肠道病毒通用型(EV-U),用含有目的序列RNA的标准品制备标准曲线,对病毒进行准确定量,同时对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评估。结果 用TaqMan-LNA探针多重荧光RT-PCR法检测CoxA16、CoxB2、EV71病毒和其他人类病毒RNA,证实其特异性为100%;对EV71和EV-U的检测灵敏度均达到10^{2拷贝/μl;将EV71和EV-U的RNA标准品进行重复性实验,其批内、批间变异系数分别为0.97%～2.02%和0.89%～2.13%。 结论 本方法灵敏度较高,特异性强,重复性好,适用于手足口病的临床检测。}     

手足口病肠道病毒EV71和CoxA16感染的检测分析

手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病,以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微,以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。引起手足口病的病原体主要为肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CoxA16),其中EV71不仅引起HFMD,而     

检测柯萨奇病毒A组6、10、16型的多重荧光RT-PCR建立及应用

目的建立检测手足口病(HFMD)肠道病毒的多重荧光RT-PCR方法。方法用多重荧光RT-PCR技术对引起HFMD的3种常见人肠道病毒[柯萨奇病毒A组(CVA)6、10、16型]进行检测,用基因测序法进行验证,并以灭活的CVA6、CVA10、CVA16病毒标准株以及引起临床相似症状的病原体样本进行特异性和灵敏度分析。结果 322例临床疑似HFMD标本,经本多重荧光RT-PCR法检测出CVA16、CVA10和CVA6型阳性样本分别为81、16和9份(总阳性率32.9%),且与基因测序法结果完全符合。将多重PCR体系中c-MMLV逆转录酶的量增至5 U,Hot-Taq酶的量增至8.5 U,可使其扩增效率提升至单重PCR扩增水平。优化后的体系可扩增出CVA6、CVA10和CVA16型阳性病毒标准RNA的检测下限分别是10,5和1 TCID50/mL。结论建立了一种灵敏、特异、高效和高通量的检测HFMD肠道病毒的多重荧光RT-PCR法,为其快速诊断提供了新的实验方法。     

手足口病139例分析

目的:探讨EV71、COXAl6手足口病发病的临床特征、并发症、免疫功能,为临床治疗手足口病提供参考.方法:回顾性分析2010年7月至2011年6月苏州大学附属儿童医院139例EV71、COXA16手足口病患儿的临床特点、生化指标、免疫功能、WBC、CRP.结果:两组病例发病年龄、呼吸道症状、血糖、WBC、肝功能、心酶谱、IgA、IgG、CD3+CD8+、CD4+/CD8+T细胞百分比、NK差异无统计学意义(P>0.05);口腔损害、并发脑炎、皮疹数量、CRP、IgM、CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD19+,CD19+CD23+、CD4+CD25+T细胞百分比差异有统计学意义(P<0.05).结论:EV71手足口病重症率较高,细胞免疫功能紊乱更明显.     

手足口病患儿血清肠道EV71病毒抗体快速检测及临床意义

通过分析我院接收的100例患儿,经过几种不同的检验方法确诊是否患有手足口病,通过研究检验结果,分析快速检验对临床治疗的实用意义。使用胶体金卡片法快速检验手足口病,为及时隔离治疗提供了依据,打下了基础,为及时治疗赢得了时间。手足口病可以威胁到儿童健康,传染性、流行性强而且发病较快,病情变化复杂,选用快速易行的检测方式,快速筛查确诊,对临床意义重大。     

西安地区儿童手足口病病原学分析

目的 对西安地区手足口病病原学进行分析调查,为手足口病防治提供科学依据.方法 采集2010年5月～6月432例临床诊断为手足口病患儿咽拭子标本,采用实时荧光RT-PCR方法检测肠道病毒通用型（EV）、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）.结果 EV阳性率82.87%（358/432）,EV71阳性率25.93%（112/432）,CA16阳性率21.06% （91/432）,EV71阳性率与CA16阳性率比较差异无统计学显著性意义（χ2=2.84,P〉0.05）.22例重症患者11例由EV71引起,2例由CA16引起.结论 西安地区手足口病病原以EV71和CA16多见,高发于4岁以下儿童,重症患者主要由EV71引起.     

西安地区2011年儿童手足口病病原学分析

目的 对西安地区2011年手足口病病原学进行分析,为手足口病的临床诊断、治疗及防治提供科学依据.方法 采集2011年1月～6月555例(其中男性347例,女性208例,年龄范围8个月～6岁,平均年龄2.6岁)西安市儿童医院临床诊断为手足口病患儿咽拭子标本,采用实时荧光RT-PCR方法检测肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16).结果 56例重症患者其中45例由肠道病毒71型(EV71)引起,占重症病例的80.4％(45/56),4例由柯萨奇病毒A组16型(CA16)引起,占重症病例的7.1％(4/56).肠道病毒71型(EV71)阳性率与柯萨奇病毒A组16型(CA16)阳性率差异有统计学显著性意义(x2=273.4,P＜0.0001).结论 西安地区2011年手足口病病原学以肠道病毒71型(EV71)为主,与2010年相比肠道病毒71型(EV71)感染有上升趋势,且高发于3岁以下儿童组,重症患者与2010年相同,主要由肠道病毒71型(EV71)引起.     

2015年杭州市手足口病肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型构成变化与联合检测方法分析

目的 采用肠道病毒核酸和抗体检测,分析2015年杭州市手足口病肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）构成变化及检测方法学评价。方法 收集2015年4-8月手足口病患儿663例,采用荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肠道病毒核酸,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清EV71-IgM、Cox A16-IgM。结果 663例手足口病患儿通用核酸阳性组58.52%（388/663）,EV71组19.16%（127/663）,与2014年比较,通用核酸阳性组比例（2=166.306,P=0.000）,EV71组比例（2=134.418,P=0.000）差异有统计学意义。手足口病患儿轻症487例,占73.45%,以通用核酸阳性组65.91%（321/487）为主;重症176例,占26.55%,EV71组43.75%（77/176）、通用核酸阳性组38.07%（67/176）位居前2位。不同组别出现重症的比例（2=98.395,P=0.000）差异有统计学意义,EV71出现重症比例最高,为60.63%（77/127）。病毒核酸检测和血清抗体检测阳性率比较差异有统计学意义（2=44.487,P=0.000）。其中,127例EV71阳性患儿,核酸和抗体检测双阳性率为59.85%（76/127）,单阳性率为40.15%（51/127）;64例Cox A16阳性患儿,核酸和抗体检测双阳性率为9.38%（6/64）;单阳性率为90.62%（58/64）。以核酸定量RT-PCR为标准,EV71/Cox A16-IgM抗体特异度86.61%,敏感度69.49%。结论 2015年与2014年比较,杭州市手足口病病原学流行特征有明显变化。采用病毒核酸和抗体联合检测,可提高实验室的检测阳性率,临床分型有助于辅助指导临床治疗;通用型重症病例增多,需寻找更适合的联合检测方法。     

双重荧光定量RT-PCR法检测柯萨奇病毒A2和A5型

目的建立同时检测柯萨奇病毒A2和A5型(CVA2、CVA5)的双重实时荧光定量RT-PCR法。方法用Primer Express3.0软件设计高度特异性引物和荧光标记探针。通过优化反应体系,建立标准曲线,并评价双重荧光定量RT-PCR法的特异性、灵敏度和重复性。用建立的方法检测367例疑似手足口病患儿的粪便标本,并对阳性结果测序验证。结果荧光定量RT-PCR结果表明本实验所选的引物和探针可特异性检测并区分出CVA2、CVA5亚型,与其他肠道病毒的阳性核酸未发生交叉反应。该方法最低检测限达到102copies/m L,批内变异系数(CV)均1.49%。367份临床标本中CVA2型阳性23份,阳性率6.3%;CVA5阳性11份,阳性率3%,检测阳性结果与测序结果一致。结论成功建立了在单管中同时检测并鉴别CVA2、CVA5型的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法具有较好的灵敏度、特异性、重复性,可用于CVA2、CVA5型引起的暴发疫情的快速筛查和手足口病的流行病学的研究。     

实时荧光定量PCR检测儿童手足口病肠道病毒EV71

手足口病(HFMD)是因某些不同血清学肠道病毒感染而引起的一种常见急性传染病,患者多为5岁以下的儿童.其传染性强,可致爆发性流行.HFMD本身是一种良性病,发病后临床经过顺利,数日后自愈,不致威胁生命,无后遗症[1-3].     

肠道病毒71型致重症手足口病的临床分析

手足口病（HFMD）具有传染性强、发病率高的特点。2008年,我国局部地区爆发HFMD疫情,重症患儿的致死致残率高,引起全社会的高度关注。流行病学调查显示病原体主要为肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇A16病毒,尤其是感染EV71后危害更重。     

胶体金免疫法对手足口病分型检测的研究

目的 建立胶体金免疫法(CGIA)对手足口病(HFMD)分型的检测方法.方法 用双抗体夹心检测原理建立CGIA对HFMD分型检测方法,分别检测136例HFMD患儿和30例健康儿童粪便中柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠病毒71型(EV71),以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)为金标准,评价CGIA检测性能.结果 CGIA 与RT-PCR检测136例HFMD患儿粪便EV71阳性率分别为27.2%和28.6%;CGIA与RT-PCR检测136例手足口病患儿粪便CA16阳性率分别为33.8%和35.3%;以RT-PCR为金标准,CGIA检测手足口病患儿粪便EV71的敏感性89.7%,特异性89.7%,阳性预测值94.5%,阴性预测值95.9%,准确度95.5%;CGIA检测手足口病患儿粪便CA16的敏感性85.4%,特异性94.3%,阳性预测值89.1%,阴性预测值92.2%,准确度91.1%.结论 CGIA法操作简单、方便、快速,特异性和敏感性好,为HFMD病原学早期分型诊断提供了一个有效的检测手段.     

手足口病病原微生物EV71病毒株的分离与鉴定

目的：探讨手足口病病原体EV71病毒的分离方法。方法：取手足口病患儿的粪便,经磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后用0.22μm滤膜过滤,将悬液接种于Vero细胞。通过EV71病毒致细胞病变效应（CPE）分析、电镜分析、EV71病毒特异性核酸及蛋白的聚合酶链反应（PCR）及Western Blotting分析来鉴定病毒分离和致病效果。检测病毒悬液对于宿主细胞Vero增殖抑制的效果。结果：标本悬液接种Vero细胞48h后出现CPE。收集感染细胞的培养基上清液,连续感染2次,均出现同样的CPE。电镜检测发现在感染组Vero细胞的细胞质和细胞核周围均有大量聚集的病毒颗粒。EV71特异性核酸RT-PCR检测证实,感染组Vero细胞中可以扩增出EV71病毒特异性的核酸条带。Western Blotting检测发现,在感染组细胞中有高表达EV71特异性抗原蛋白,而未感染组细胞不表达该病毒抗原。MTT检测结果显示,EV71病毒显著抑制宿主细胞Vero的体外增殖和生长,并且呈时间依赖性。结论：成功分离出人手足口病致微生物EV71病毒株（该EV71病毒株编号为EV71-Tj-100623）。     

手足口病病原的荧光PCR法检测及其临床特点——附20例分析

目的：采用荧光PCR法对手足口病患儿进行病原学检测,同时分析手足口病常见的,临床表现特点。方法：收集20例临床确诊手足口病患儿的临床资料,留取其血液和粪便标本,采用3种荧光PCR核酸检测试剂盒分别进行肠道病毒筛选和柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirusA．16,CVA．16）与肠道病毒71型（enterovirus71,EV71）的鉴别,对2种病毒所致的临床表现进行归纳比较。结果：使用3种试剂盒检测20例患儿血液标本均未检出病毒。粪便标本使用通用型试剂盒检出10例（＋）,其中4例为CVA．16感染,5例为EV71感染,发病3d内采集标本（＋）占8／10;EV71与CVA-16感染病例的临床表现相似,主要为发热、口腔溃疡和皮疹,仅2例EV71感染患儿有肺部口罗音,但预后良好,并无心脏和神经系统的严重并发症。结论：发病早期采集粪便用荧光PCR法检测有助于及时作出手足口病的病原学诊断,EV71感染的轻症患者预后良好。     

粤东地区2011年手足口病病原学检测及临床分析

目的 了解粤东地区2011年婴幼儿手足口病的病原体分型情况及其与临床的关系.方法 采集2011年1月至12月汕头大学医学院第二附属医院儿科手足口病住院患儿的咽拭子标本,RT-PCR检测肠道病毒71型（EV71）,柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）,肠道病毒属,并对扩增产物测序鉴定.结果 301例患儿中有214例咽拭子中检测到肠道病毒,病毒阳性率为71.1%,其中EV71 60例,占28.0%,CoxA16 108例,占50.5%,除EV71、CoxA16外的其他型别肠道病毒为46例,占21.5%;91例患儿有明显神经系统损害,其中33例EV71检测阳性（33/60,55.0%）,35例CoxA16检测阳性（35/108,32.4%）,8例除EV71、CoxA16外其他型别肠道病毒检测阳性（8/46,17.4%）,15例肠道病毒检测阴性.除1例由EV71引起的的危重型手足口病死亡外其余300例均痊愈出院.结论 粤东地区2011年手足口病病原体主要为CoxA16、EV71,但CoxA16已经成为当年优势病原体,其他型肠道病毒也占有一定比率.而EV71最容易引起神经系统损害和导致重症及危重症,EV71、CoxA16及其他型肠道病毒均可引起神经系统损害.     

浅谈肠道病毒EV71感染

手足口病主要是由柯萨奇病毒A16和EV71型等肠道病毒引起，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡为主要临床特征的急性传染病，可在全球范围内流行。世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年新西兰首次报道该病。1981年我国发现该病，在今年的5月2日我国卫生部又将该病列入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。     

2014年昆明某三甲医院手足口病病原及流行特征分析

目的 对2014年昆明市延安医院就诊的手足口病(HFMD)病例进行回顾性分析总结,了解其病原分布及流行病学特点.方法 应用实时荧光定量PCR对130例手足口病临床诊断病例的粪便标本进行病毒核酸检测,并对其年龄分布特点、季节分布情况进行分析.结果 非重复性的130例临床诊断病例中,病原阳性检出79例,总阳性率为62.2％,其中EV71占检出病原的5.1％(4/79),CA16占检出病原的17.7％(14/79),其他型占77.2％(61/79).4个年龄组中,1～3岁组和3～6岁组高于0～1岁、＞6岁组,4年龄组间阳性率比较差异有统计学意义(P＜0.05).5～7月为HFMD发病高峰期,在全年发病例数及全年阳性检出例数的构成比中均为最高,8月开始发病例数有减少趋势,但12月又有所增加.结论 手足口病5～7月为发病高峰期,以6月为最高;发病率以幼儿及学龄前儿童(2～6岁)为最高.