黄疸出血群钩端螺旋体LAMP-LFB快速检测方法的建立与应用

  目的   基于环介导恒温扩增（LAMP）结合纳米生物传感条（LFB）技术,建立并评价黄疸出血群钩端螺旋体（钩体）的LAMP-LFB快速检测方法。  方法   以黄疸出血群钩体O抗原基因簇中的糖基转移酶基因（gtf）为检测靶标并设计特异性LAMP引物。 通过对LAMP引物的特定标记（FIP-FAM和LF-Biotin）和优化试验,建立LAMP-LFB快速检测方法,并分析其灵敏度和特异性。 应用建立的LAMP-LFB、普通PCR方法和显微凝集试验（MAT）,分别对53株钩体分离菌株进行鉴定,比较分析鉴定结果并评价LAMP-LFB方法的实用性。   结果   灵敏度和特异性试验显示,LAMP-LFB方法可检出黄疸出血群赖型56601基因组DNA的最低浓度为100 fg/μL,检测特异性为100%,与其余血清群和非钩体菌株核酸无交叉反应。 菌株鉴定结果显示,LAMP-LFB与MAT鉴定结果完全一致,符合率为100%,其敏感性高于PCR方法。 此外,LAMP扩增产物经LFB验证,可直接通过观察检测线（TL）和质控线（CL）进行结果判定。  结论   基于gtf基因建立的LAMP-LFB检测技术方便、快捷且重复性好,可快速、灵敏、特异地鉴定黄疸出血群钩体菌株,能够作为有价值的黄疸出血群钩体菌株快速鉴别或诊断方法。     

霍乱弧菌的PCR方法检测及耐药性分析

目的建立PCR检测霍乱弧菌的快速方法,应用于水源、海产品霍乱弧菌快速检测;了解霍乱弧菌的耐药性。方法根据霍乱弧菌的肠毒素基因A亚单位(ctxA)的保守序列,设计引物,以副溶血弧菌和沙门菌为对照,建立PCR检测霍乱弧菌的快速方法,用于霍乱弧菌的快速检测;应用美国德灵公司生产的Walkway40微生物鉴定和药敏分析系统对70株霍乱弧菌进行耐药性检测。结果70株霍乱弧菌出现特异性荧光,其他菌不出现荧光,灵敏度高、特异性强,可在8h内作出诊断。霍乱弧菌对大部分抗生素敏感,对复方新诺明耐药率较高。结论PCR检测霍乱弧菌灵敏度高特异性强可用于水源、海产品霍乱弧菌快速检测;霍乱弧菌对大部分抗生素敏感。     

一起引起食物中毒的非O1群霍乱弧菌实验室鉴定

目的 查明引发浙江省宁波市某服饰公司食物中毒事件的病原菌.方法 对采集到可疑食品和肛拭等标本参照GB/T4789-2003标准进行细菌的分离、鉴定及血清学分型;参照霍乱防治手册检测菌株的CT毒力基因.结果 6份患者大便标本与14份轻微腹泻患者或腹部不适者大便标本中检出非O1群霍乱弧菌O29血清型9株,其中腹泻患者标本检出6株,轻微腹泻患者中检出3株,检出率为45.0%.未检出志贺菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌、O1群和O139霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌,剩余食物未检出志贺菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌、O1群和O139霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌.结论 此次食物中毒为非O1群霍乱弧菌O29血清型所致.     

山西省从粪便中分离到产霍乱毒素的拟态弧菌

目的从山西省霍乱样粪便中分离到拟态弧菌,并检测其是否携带霍乱毒素基因。方法采集患者粪便、患者家用自来水、金鱼和鱼缸水标本,按照WS289-2008和《霍乱防治手册》(第5版)方法 ,对标本进行增菌和选择性培养基的分离培养,疑似菌落以霍乱弧菌血清凝集试验检测,并用API20E系统鉴定菌种。同时,疑似菌落用PCR检测O1、O139群特异性和是否携带霍乱毒素基因。结果粪便标本经增菌后接种选择性培养基,在庆大琼脂和碱性琼脂上均有霍乱弧菌疑似菌落,但在TCBS琼脂上为绿色、透明、中等大小、光滑、湿润的菌落;血平板上可见灰白色、湿润菌落,有透明溶血环;染色镜检湿片暗视野下未见流星状运动细菌。氧化酶和粘丝实验阳性,霍乱弧菌O1、O139群血清凝集试验阴性。菌株经API20E鉴定为拟态弧菌(93.5%可能性)。环境标本中未分离和检测到拟态弧菌。PCR检测该拟态弧菌中携带霍乱毒素基因,而O1、O139群特异性为阴性。结论从急性霍乱样腹泻粪便中分离到1株拟态弧菌,对于临床类似霍乱样症状的病例标本,当病原的霍乱弧菌血清凝集为阴性时,应进一步做霍乱毒素的检测。     

2007-2009年浙江省磐安县钩端螺旋体病宿主动物监测分析

目的 了解浙江省磐安县野鼠、牛、猪、鸭和青蛙钩端螺旋体带菌情况.方法 对野鼠鼠肾、牛中段尿、猪肾、鸭肾和青蛙肾等进行钩端螺旋体菌株的分离培养.结果 2007-2009年磐安县共分离培养到钩端螺旋体菌8株,经鉴定均为黄疸出血群.野鼠分离培养到7株,带菌率为2.13%;青蛙分离到1株,带菌率为0.33%;牛中段尿、猪肾和鸭...     

2株与霍乱弧菌O139诊断血清发生凝集的麦氏弧菌鉴定

目的对2株疑似O139群霍乱弧菌进一步鉴定,以排除或确诊霍乱。方法以试管凝集和交叉吸收实验复核玻片凝集结果,用生化实验和BIOFOSUN 微生物鉴定系统进行生化鉴定,PCR技术检测O139霍乱弧菌特异性脂多糖基因（LPS）。结果玻片凝集阳性,试管凝集1株菌可达原诊断血清效价的1/4,1株菌达1/2,交叉吸收后均证实为非特异性凝集;未检出LPS基因;系统生化鉴定判定为麦氏弧菌。结论2株菌不是O139霍乱弧菌,而是麦氏弧菌。     

布鲁菌PCR快速检测方法的建立及应用

目的建立布鲁菌聚合酶链反应(PCR)方法,对其进行应用评价。方法针对布鲁菌外膜蛋白编码基因(omp-2)设计PCR引物,建立PCR方法,利用19种常见细菌和布鲁菌株DNA分别对其进行特异性和敏感度评价,对3株疑似布鲁菌株进行核酸检测,并与分离培养法进行结果比对。结果本研究建立的布鲁菌PCR检测方法仅能检出布鲁菌阳性菌株,对照菌DNA未出现目的条带;敏感度为100拷贝/反应;PCR方法对3株疑似布鲁菌株检出omp-2基因条带,鉴定结果为布鲁菌,与分离培养法结果相同。结论本研究建立了一种布鲁菌PCR检测方法,与分离培养法相比,布鲁菌PCR方法准确、快速,适合布鲁菌病疫情的快速检测。     

API 20E和20NE对弧菌属细菌的鉴定分析

我们在实际工作中发现 ,API2 0E和 2 0NE对弧菌属某些细菌的鉴定易产生错误结果。为此 ,我们以非O1群霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和河弧菌分别接种API 2 0E和2 0NE试条 ,分析其鉴定结果 ,寻找鉴定失败的原因及处理方法 ,并根据各菌生化反应 ,建立一套API鉴定系统与常规方法相结合的鉴定方法。1　材料和方法1 .1　菌株来源　非O1群霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和河弧菌各 1株系卫生部和浙江省临床检验中心的室间质评菌株。1 .2　培养基　克氏双糖铁琼脂、4号琼脂、蔗糖和水杨苷微量发酵管、0和 6 0g/L氯化钠胨水均购自杭州天…     

福氏志贺菌Xv血清型聚合酶链反应鉴定方法的建立及应用

目的建立福氏志贺菌Xv血清型聚合酶链反应(PCR)鉴定方法。方法根据福氏志贺菌Xv血清型O抗结构,针对O抗合成基因wzx、7;8群抗原决定基因gtr X和MASF IV-1抗原决定基因opt,建立PCR扩增鉴定方法。并应用该方法对139株福氏志贺菌临床分离株进行血清型检测。结果建立一种福氏志贺菌Xv血清型PCR鉴定方法,该体系在一个反应中包括3对引物,Xv血清型PCR扩增全部为阳性,可将Xv血清型与目前已知的其他18种福氏志贺菌血清型完全区分。非福氏志贺菌菌属及腹泻相关菌属菌株检测结果发现无任何PCR扩增产物。对139株不同血清型福氏志贺菌临床分离株的鉴定结果显示,该方法可将Xv血清型鉴定,与血清凝集结果一致。结论本研究建立的福氏志贺菌Xv血清型PCR鉴定方法具有快速、特异的优点,可以用于检测和监测。     

浙江省非O1、非O139群霍乱弧菌快速检测与毒力基因研究

目的 建立一种快速检测非O1、非O139群霍乱弧菌方法,并对浙江省部分地区海水产品中非O1、非O139 群霍乱弧菌及其携带毒力基因开展快速检测.方法 采用三糖斜面、氧化酶实验、粘丝实验、无盐胨水等简单生化进行初筛,对全部结果阳性的菌株用聚合酶链反应(PCR)方法检测霍乱弧菌外膜蛋白OmpW以及毒力基因ctxA、hl...     

Application of real-time PCR and RT-PCR assays for the detection and quantitation of VT 1 and VT 2 toxin genes in E. coli O157:H7

Real-time PCR assays, based on hybridisation probes and LightCycler technology, were developed for VT 1 and VT 2 genes and applied to the detection and quantitation of DNA and mRNA of Escherichia coli O157:H7. The qualitative consensus PCR assay for the detection of VT 1 and/or VT 2 genes had a detection limit of 100 fg of E. coli O157:H7 genomic DNA and did not detect DNA from 13 non-VTEC isolates. When E. coli O157:H7 was inoculated into minced beef, enriched and recovered by immunomagnetic separation, the real-time consensus PCR assay had a detection limit of log(10)3.5 ml(-1) E. coli O157:H7 cells. Nineteen E. coli O157:H7 isolates, derived from food, bovine samples and human faeces, were analysed and compared for mRNA expression of three genes, VT 1, VT 2 and gapA (housekeeping gene), using quantitative real-time PCR assays. While there was no statistically significant difference for the expression of the VT 1 (p=0.134) or VT 2 (p=0.52) mRNA in the E. coli O157:H7 isolates from food, bovine and human sources, three clinical isolates did show lower expression of VT 2 compared to other isolates in the study. The study indicates that the consensus qualitative real-time PCR assay for VT 1 and VT 2 is rapid and sensitive and that the quantitative assays reported here have the potential to be used as an alternative method to more conventional methods for studying VT 1 and VT 2 virulence gene expression in E. coli O157:H7 with potential application in other pathogenic E. coli species.     

聚合酶链反应检测出血性大肠埃希菌

为建立一种针对出血性大肠埃希菌的特异性聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法，根据Ｏ１５７：Ｈ７血清型大肠埃希菌ｈｌｙＡＢ基因的ＤＮＡ序列，设计８个引物，使用３２株Ｏ１５７：Ｈ７血清型。结果表明，引物ＲＨ２８－ＲＨ３０和ＲＨ２６－ＲＨ３１敏感性和特异性好，达１００％。ＲＨ２６－ＲＨ３１产物的分子量较大，为２ｋｂ。ＲＨ２８－ＲＨ３０的产物为３３８ｂｐ，比较适合检验使用。研究还发现，使用煮沸法制备ＰＣＲ模板，方法简便、快速、实用，且对ＰＣＲ反应的特异性和敏感性无影响。ｈｌｙＡＢ基因片段作为出血性大肠埃希菌ＤＮＡ探针的特异性和敏感性是明显的，且实用性好。根据出血性大肠埃希菌独特的ｈｌｙＡＢ基因序列设计的ＰＣＲ引物，在理论和实际应用方面均有其优越性。     

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立

目的 建立一种Taqman荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法。方法 以副溶血弧菌标准株(ATCC-VPJS421)和其它常见致病菌标准株为研究对象,通过Gene Bank获取toxR基因的序列,采用生物信息学软件设计特异性PCR引物及Taqman探针,在SLAN 96P荧光定量PCR仪进行扩增检测,评价该检测方法的特异度和灵敏度。结果 ①设计的引物能够扩增出特异性条带; ②扩增体系中0.5 μl探针的扩增效果优于1.0 μl探针; ③Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10^-1 mg/L; ④在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、梅氏弧菌和弗尼斯弧菌等10种常见致病菌时未出现阳性扩增,特异度为100%。结论 成功建立Taqman探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法,该方法特异度、灵敏度均较好,适用于副溶血弧菌的快速检测,具有良好的应用价值。     

2018-2020年浙江省湖州市食源性疾病监测结果分析

  目的   了解浙江省湖州市食源性疾病的感染状况和流行病学特征。  方法   收集湖州市2018 — 2020年6家食源性疾病监测哨点医院（重点监测点和常规监测点各3家）上送的沙门菌、副溶血弧菌、致泻性大肠埃希菌、志贺菌分离菌株,再对分离菌株进行血清分型和毒力基因检测;采用real-time PCR方法进行诺如病毒核酸检测。  结果   共检测6783 例腹泻病例标本,检出病原体1373份,检出率为20.24%。 致泻性大肠埃希菌检出率为6.49%,主要以肠聚集性大肠埃希菌和产肠毒素大肠埃希菌为主;副溶血弧菌检出率5.31%,血清分型以 O3∶K6 为主,毒力基因以tdh 为主;沙门菌检出率为2.85%,以鼠伤寒沙门菌为主;诺如病毒阳性率为11.65%,基因型别以GⅡ.2［P16］为主。 致病菌引起的发病高峰在夏季,诺如病毒引起的发病高峰在冬春季, 20～39岁为主要感染人群。  结论   2018 — 2020年引起湖州市感染性腹泻的病原体为诺如病毒、致泻性大肠埃希菌、副溶血弧菌和沙门菌,发病呈现明显的季节性和年龄分布。 应加强对食源性病原体的监测,有效控制食源性疾病的发生。     

Detection by 5'-nuclease PCR of Shiga-toxin producing Escherichia coli O26, O55, O91, O103, O111, O113, O145 and O157:H7, associated with the world's most frequent clinical cases

This paper describes 5'-nuclease PCR assays for detecting eight O-serogroups, H7 flagellar antigen and stx genes from the Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) associated with the world's most frequent clinical cases. A single set of primers was used to detect the genes stx1 and stx2 in the same reaction by 5'-nuclease PCR. Serotyping by 5'-nuclease PCR of STEC was based on the selection of primers and probes targeting the O-antigen gene clusters of E. coli O26, O55, O91, O111, O113, O157, the eae gene of E. coli O103, the O-island 29 of E. coli O145, and the flagellar H7 antigen gene. Results obtained on a collection of 190 strains indicate that the 5'-nuclease PCR assays used here could serve as a basis for rapid specific stx, O and H7 typing of these major pathogenic serogroups of E. coli. This work provides sensitive and specific tests for the rapid, reliable detection of the main pathogenic E. coli O-serogroups of major public health concern.     

多重PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7

目的 建立一种快速、特异的检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7菌株的多重PCR方法。 方法 针对O157:H7菌株的O157、H7抗原特异基因rfbE O157、fliC H7以及stx1、stx2、eaeA和hlyA四种毒力基因设计相应引物,在同一扩增体系中进行PCR反应,通过优化多重PCR 反应条件和循环参数,建立检测O157:H7菌株的多重PCR方法,并测定其特异性和灵敏度。 结果 6 对特异性引物各自扩增相应的基因片段,检测结果与常规PCR 获得的结果一致。细菌纯培养物的检测灵敏度为1.33×10⁴ CFU。 结论 该多重PCR方法能在一次检测中同时反映待测菌株是否为肠出血性大肠埃希菌O157:H7及其携带毒力基因的情况,可为O157:H7大肠埃希菌感染的诊断及流行病学调查提供一种简便、快速的检测手段。     

甲鱼及养殖水中5株带毒力基因O1群霍乱弧菌的分离与鉴定

目的监测杭州市江干区水产品中O1群和O139群霍乱弧菌并对分离菌株进行病原学鉴定及分子分型。方法按《霍乱防治手册》第5版对51份样品进行霍乱弧菌分离与鉴定。运用改良Kirby-Bauer纸片法和PCR检测5株霍乱弧菌对14种临床常用抗生素的敏感性及是否携带ctxA和tcpA毒力基因,并用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型。结果从51份样品中检出O1群霍乱弧菌5株,其中小川型4株,稻叶型1株。5株霍乱弧菌的ctxA和tcpA毒力基因结果均为阳性。5株菌株对11种抗生素敏感,对红霉素和利福平中介,稻叶型菌株对氨苄西林敏感,小川型菌株对其耐药。PFGE分为两型,两型间仅有一条带的差异。结论本次分离的5株O1群霍乱弧菌均携带ctxA和tcpA毒力基因,故有必要加强对水产品尤其是甲鱼的监测及管理。     

艾伯特埃希菌快速鉴定方法比较研究

目的 评价目前用于快速鉴定艾伯特埃希菌方法的特异性。方法 利用51株艾伯特埃希菌及其他对照菌株，分别评价基于clpX、lysP和mdh基因的三重聚合酶链式反应（PCR）；基于EA 0134基因的单重PCR；基于EACBF 2103-EACBF2104基因的巢式PCR。结果 51株艾伯特埃希菌三重PCR均为阳性，鉴定吻合率为100%；巢式PCR两轮结果均为阳性，鉴定吻合率为100%，对照组第1轮PCR结果全部为阴性，但第2轮出现非特异条带。51株中49株EA 0134基因为阳性，鉴定吻合率为96.08%，对照菌株中伤寒沙门菌和肠出血性大肠埃希菌O157:H7扩增出大小类似的片段。结论 EA 0134基因在一些菌株中缺失，会造成漏判，同时在部分肠道菌株中存在非特异性扩增，会造成误判。三重PCR和巢式PCR的第1轮扩增均具有高特异性，可作为目前艾伯特埃希菌分离株的PCR快速鉴定方法，为艾伯特埃希菌相关的临床诊断和突发公共卫生事件处置，提供准确快速的诊断依据。