人CD81胞外大环在大肠杆菌中的克隆表达及活性研究

目的：构建人CD81分子胞外大环（ED2）的原核表达质粒,并研究胞外大环同HCV E2蛋白的结合性能。方法：从人外周血淋巴细胞中经RT－PCR克隆出CD81胸外大环序列,插入原核表达载体pBVILl中,构建表达质粒pBVILl-EC2并在大肠杆菌中表达。表达产物经纯化后用间接ELISA法测定同E2蛋白的结合能力。结果：经序列测定证明,CD81分子胞外大环正确插入载体。融合蛋白得到高效表达,以包涵体形式存在,经Q－Sepharose FF阴离子交换柱得到有效纯化。初步结果表明,重组CD81胞外大环能同原核表达的截短的HCV E2（384－661）蛋白结合。结论：本研究为进一步研究CD81同E2及HCV的相互作用和制备抗EC2单克隆抗体奠定了基础。     

CD44 mRNA在伴有静脉侵袭的结直肠癌中的表达及其与肝转移的关系

目的 :研究伴有静脉侵袭的结直肠癌组织中CD4 4mRNA的表达及其与肝转移的关系。方法 :采用反转录 -聚合酶链式反应 (RT -PCR)方法检测 31例伴有静脉侵袭的结直肠癌组织中CD4 4mRNA的表达状况。结果 :CD4 4mRNA在伴有静脉侵袭的结直肠癌组织中阳性表达率为 6 4 .5 %。同时伴有肝转移者 ,CD4 4mRNA的强阳性表达率为 70 .6 % ,表达强度明显高于无肝转移者 (2 8.6 % ) ,P <0 .0 1。结论 :结直肠癌组织中CD4 4mRNA具有较高的阳性表达率 ,且表达强度与癌细胞的肝转移密切相关     

人白血病抑制因子的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

白血病抑制因子（ＬＩＦ）是一种多功能的细胞因子，正常生理条件下，人体各组织细胞并不产生ＬＩＦ，只有在一定条件刺激下，一些细胞如淋巴细胞、单核细胞、成纤维细胞才产生ＬＩＦ，此外，一些白血病细胞系如Ｕ９３７、ＨＬ－６０在一定条件刺激下亦产生ＬＩＦ。该实验根据Ｍｏｒｅａｕ报道的ＬＩＦｃＤＮＡ序列，通过激活ＬＩＦ基因、逆转录ＰＣＲ等步骤成功地克隆了ＬＩＦｃＤＮＡ后，将ＬＩＦｃＤＮＡ亚克隆至表达载体ｐＢＶ２２０形成重组表达质粒ｐＢＶ２２０／ＬＩＦｌ，该重组质粒转化ＤＨ５α大肠杆菌，经过诱导后ＬＩＦ在ＤＨ５α中的表达量达１０％。     

内毒素结合肽表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

应用PCR技术,从含人NH@LBP cDNA的质粒中扩增出93bp的内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)基因片段,插入原核融合蛋白表达质粒Pinpoint Xa3的多克隆位点构建成表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组子Pinpoint Xa3-EBP并进行酶切鉴定及序列分析.异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,经SDS-PAGE及Westen blot鉴定得到分子量约为16.5kD的生物素化EBP融合蛋白,为进一步研究其内毒素拮抗效应打下良好基础,并为内毒素结合肽的研究提供了一条新的途径.     

人CD34抗原胞外区cDNA的克隆、真核表达载体的构建及在基因免疫制备CD34单克隆抗体中的初步应用

目的 克隆含编码人CD34抗原胞外区的cDNA，并构建其真核表达载体，探讨基因免疫制备抗人CD34单克隆抗体的可行性。方法 从KG-1a细胞提取总RNA，RT-PCR扩增含编码人CD34抗原胞外区的cDNA并酶切测序鉴定。构建其真核表达载体pcDNA3.1-CD34。选取4～6周龄的BALB/c小鼠12只，随机分为3组，预先在股四头肌注射25％的蔗糖溶液50μl，然后在相同部位分别注射PBS空白对照、PBS稀释的空载体pcDNA3．1以及PBS稀释的pcDNA3．1-CD34，每2周1次共3次。免疫结束后定期FACS检测鼠尾静脉血抗人CD34抗体产生情况。结果 所扩增的人CD34抗原胞外区cDNA全长886bp，扩增片段大小与理论值相符，测序结果与文献报道完全一致，并且在5′端引入HindⅢ酶切位点，3′端引入EcoRI酶切位点及终止密码TGA。随后将其定向插入真核表达载体pCDNA3．1中，称之为pcDNA3．1-CD34，经阳性克隆筛选、酶切鉴定证实pcDNA3．1-CD34真核表达载体构建成功。FACS检测结果表明，用pcDNA3．1-CD34真核表达载体免疫的小鼠中仅1/4只在免疫结束后的第2～6周有较低滴度的CD34抗体产生，其余3只血清中均未检测到CD34抗体。结论 成功地构建了人CD34抗原胞外区cDNA的真核表达载体pcDNA3．1-CD34，初步证明用其进行基因免疫制备CD34单克隆抗体是可行性的。     

在大肠杆菌中以非融合蛋白形式高效表达丙型肝炎核心蛋白

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增出完整的丙型肝炎病毒核心蛋白基因，将其克隆于表达载体ｐＢＶ２２０ ＰＲＰＬ启动子的下游，构建了重组质粒ｐＢＶ－ＨＣＶ；转化大肠杆菌后，以非融合蛋白方式表达了丙型肝炎病毒核心蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示，此蛋白的分子量约为２０ｋＤａ，表达量约占菌体蛋白的１１％；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验证明，此蛋白能与慢性丙型肝炎患者血清发生特异反应。序列分析结果表明，克隆于ｐＢＶ     

丙型肝炎病毒T细胞表位的筛选及其在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)不同变异株中，筛选高保守的能涵盖多种MHC限制类型的T细胞表位，并构建重组表位抗原的原核表达质粒。方法：检索文献并结合MHC限制型，从中遴选出功能明确的T细胞表位；利用Goldkey软件，建立HCV全长蛋白序列数据库；从中分别截取各个表位所在区段，对所选取的表位进行同源性比较；从中选取保守性强的部分表位，用化学法合成表位基因，插入原核表达载体pBVIL1中，构建多个融合表达质粒并在E．coli表达。结果：从文献中获得HCV免疫优势性T细胞表位18个，在由55条全长HCV序列组成的数据库中进行比较，获得了大量有关表位保守性的信息，并进行了统计分析，所构建的5个表达质粒pBVIL1—T1—T5经鉴定后，在大肠杆菌中均获得了高效表达。结论：本研究有助于深入认识HCV T细胞表位的特性，为表位的筛选提供了方法学依据，所选取的表位及原核表达的重组蛋白，为HCV治疗性疫苗的实验研究提供了候选抗原。     

人CD40分子基因的克隆及其在COS—7细胞中的表达

目的：克隆编码人ＣＤ４０分子基因的全长ｃＤＮＡ,在ＣＯＳ－７细胞中获得高表达。方法：提取人Ｂ淋巴细胞看Ｄａｕｄｉ总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆了编码人ＣＤ４０基因全长ｃＤＮＡ,序列测定证实其正确性。将测序正确的ＣＤ４０基因克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１构建重组表达载体。采用脂质体转染试剂脂染胺（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）杂ＣＯＳ－７细胞,用流式细胞仪,免疫细胞化学和免疫荧光法检测ＣＤ４０基     

两步法聚合酶链反应克隆编码CD34蛋白质胞外区的基因片段

两步法聚合酶链反应克隆编码ＣＤ３４蛋白质胞外区的基因片段刘明东马恩普韩颍刘秀珍北京放射医学研究所北京１００８５０ＣＤ３４抗原局限表达于造血干／祖细胞，在正常骨髓单个核细胞中仅有１％～３％的细胞表达ＣＤ３４，本研究通过逆转录后采用两次聚合酶链反应（ＰＣ...     

人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定

为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70（HSP70）的基因，以质粒为模板，采用PCR方法进行扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小约1.96kb的片段；回收片段经T－A克隆法克隆到pUCm-T载体上，并进行DNA测序；将目的基因片段从pUCm-T载体上酶切后，亚克隆到表达载体pET-21a( )上，将重组质粒pET-21a( )/HSP转化大肠杆菌，经IPTG诱导后，收集细菌，菌体裂解后进行SDS－PAGE及Western blot检测。结果表明，应用PCR方法扩增出约1.96kb的目的片段，序列测定结果证实，扩增的HSP70基因序列与GeneBank中HSP70 cDNA序列一致；经EcoR I Xho I酶切及PCR鉴定证实，HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-21a( )上，转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，进行SDS－PAGE，发现在分子量为72000处有表达量明显增多的蛋白条带，Western blot证实其为目的的条带。表明在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70基因。     

重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆和表达

目的：克隆人KGF-2基因，并在大肠杆菌中进行表达。方法：通过PCR扩增，从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2的cDNA，并将其分别克隆入pBV220，pLEX和pGEX4T-1质粒中，研究其在不同表达质粒和大肠杆菌中的表达情况。结果：克隆得到的KGF-2cDNA经测序证明与文献报道的序列一致。将其克隆于pBV220质粒中，在E．coli JM109中表达量相对最高，约占茵体总蛋白的4％；克隆于pLEX质粒中，在E．coli G1724中的表达量约占全茵总蛋白的5％；克隆于pGEX4T-1中，在E．coli JM109中的表达量可占到全茵总蛋白的20％。结论：采用GST融合蛋白表达质粒pGEX4T-1对KGF-2进行表达，较pBV220和pLEX具有明显优势，能实现对KGF-2的高效表达，为进一步的功能研究奠定了基础。     

人巨细胞病毒UL82基因重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 pp71蛋白基因 ,构建高效表达 pp71蛋白的工程菌。 方法 :在传代培养的人包皮成纤维细胞中接种人巨细胞病毒 (HCMV) ,待绝大多数的细胞出现了细胞病变效应后 ,用冻融法收获细胞 ,用PCR技术扩增目的基因 ,将基因片段插入表达载体pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5 α,TPTG诱导其表达。结果 :获得的工程菌所表达的 pp71蛋白大小约为 710 0 0 ,约占菌体总蛋白的 3 0 0 %。结论 :成功的构建了 pGEX/ pp71重组表达质粒 ,并在DH5 α 中高效表达出pp71蛋白 ,为下一步pp71蛋白的大量表达和纯化奠定了基础。     

人线粒体核糖体蛋白S17 cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的克隆人MRPS17cDNA,并在大肠杆菌中表达纯化。方法从人原代培养毛乳头细胞中分离总RNA,采用RTPCR及序列测定等方法获得人MRPS17cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;C末端融合了6×His纯化标签的表达产物行Western印迹法分析并用Ni2 NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白行SDSPAGE纯度分析。结果获得了人MRPS17cDNA,与GenBank报道的序列一致,并成功构建了高效原核表达质粒pET28aMRPS17;Western印迹结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约13kD的目的蛋白;表达产物经Ni2 NTA离子交换树脂纯化,纯度>90%。结论克隆得到了人MRPS17cDNA,并在E.coli中成功表达和纯化了MRPS17蛋白,为后续研究奠定了基础。     

人源性角质细胞生长因子(KGF)的克隆及其表达分析

目的：克隆出正确的人源性角质细胞生长因子（KGF）并探讨影响其表达的因素。方法：应用RT－PCR技术克隆出KGF基因，并用pBV220表达质粒对其进行表达，然后用RNAdraw对其RNA进行分析。结果：带有信号肽的KGF基因在pBV220中表达量为10％左右，而去掉信号肽的KGF基因在pBV220中表达量估计只有1％－2％；利用RNAdraw分析的结果表明前者RNA前端没有形成茎环结构，而后者则形成了茎环结构，结论：KGF基因在细菌中表达量较低，信号肽是影响其表达量的重要因素。     

人白介素17基因的分离及其在大肠杆菌中的表达

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从活化的人外周淋巴细胞中分离了人白１７基因，序列分析结果表明与文献报道的完全相符，以质粒ｐＢＶ２２０为表达载体，在大肠杆菌中高效表达了ｈＩＬ－１７基因，重组蛋白以包涵体的形式存在，约占菌体总蛋白的量４０％。     

Mda7/IL-24基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达

目的 :克隆人黑素瘤分化相关基因 (melanomadifferentiationassociatedgene ,mda 7/IL 2 4 ) ,并在大肠杆菌中表达。方法 :从PHA刺激培养的人外周血淋巴细胞提取总RNA ,根据mda 7/IL 2 4基因序列设计引物 ,用PCR法扩增mda 7/IL 2 4基因。将mda 7/IL 2 4基因插入表达载体pET 2 8a(+)中 ,构建表达载体pET 2 8a mda 7/IL 2 4 ,用IPTG诱导目的蛋白在E .coli中表达。通过Western印迹分析对表达产物进行鉴定。结果 :经RT PCR从人外周血分离的淋巴细胞中扩增到mda 7/IL 2 4cDNA ,序列分析与文献报道一致 ;SDS PAGE分析表明 ,经 0 .5mmol/LIPTG 37℃诱导 4h后在E .coli中有大量mda 7/IL 2 4融合蛋白表达 ,相对分子质量约为 2 8× 10 3 ,融合蛋白约占诱导菌总蛋白的30 % ;Western印迹分析提示 ,诱导表达产物能与His单抗发生特异性反应。结论 :从人外周血淋巴细胞中获得了mda 7/IL 2 4的全长cDNA ,融合蛋白在E .coli中获得高效表达。     

人白细胞介素15基因的分离及其在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：分离编码人ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ并大肠杆菌中克隆与表达，方法：采用ＰＨＡ刺激人外周血白细胞提取ｍＲＮＡ，并利用ＲＴ－ＰＣＲ方法获得ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ将其定向插入ＰＵＣ１９载体中，ＤＮＡ序列分析表明分离的ｈＩＬ－１５的序列与文献报道一致，以ｐＢＶ２２０为表达载体构建并筛选出重组于ｐＢＶｈＩＬ－１５；重组子转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株，经４２℃诱导表达。结果：相对分子质量为１４０００的ｈＩＬ     

人内皮抑素基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的重组人内皮抑制素蛋白。方法：从人胎肝中分离总RNA,经反转录聚合酶链反应（RT－PCR）得到endostatin全基因。用原核细胞表达载体构建pBV220/endostatin重组质粒,经DNA测序确认后,将其转化大肠杆菌DH5a进行表达,初步纯化及活性测定。结果：经SDS－PAGE电泳分析表达产物分子量约20Kda,薄层扫描显示表达产物可达细菌总蛋白的30％。结论：经生物学活性测定,表达蛋白能够抑制bFGF(碱性成纤维细胞生长因子）对牛毛细血管内皮细胞（BCEC）的增殖作用。