比较不同频率低频超声联合微泡促进脂质体介导的pEGFP质粒转染人前列腺癌细胞的实验研究

目的比较不同频率低频超声联合微泡促进脂质体介导的p EGFP质粒转染人前列腺癌PC3细胞。方法实验共分7组:空白对照组仅人前列腺癌PC3细胞株,不进行任何处理;质粒组每毫升细胞悬液中加入1μg质粒;脂质体组每毫升细胞悬液中加入100μl转染液;脂质体+微泡组每毫升细胞中悬液加入100μl转染液和200μl微泡,低频超声联合脂质体+微泡组每毫升细胞悬液中加入100μl转染液和200μl微泡,同时采用声功率为400 m W/cm2的脉冲超声波辐照模式,辐照时间240 s,占空比设为1∶1,依据辐照频率不同又分3个亚组,分别为20 k Hz超声组、500 k Hz超声组和1 MHz超声组。每组设6个复孔。各组经处理后继续培养24 h,荧光显微镜观察转染情况;流式细胞仪检测各组转染率。结果荧光显微镜下,低频超声联合脂质体+微泡组PC3细胞胞质内可见大量绿色荧光蛋白表达,明显多于其他各组,各亚组间又以20 k Hz超声组绿色荧光蛋白较多;脂质体组和脂质体+微泡组绿色荧光蛋白表达量亦多于空白对照组和质粒组。流式细胞仪检测显示,低频超声联合脂质体微泡组转染率高于质粒组,其中20 k Hz超声组转染率最高,明显高于其他各组,差异有统计学意义(P<0.05)。脂质体组与脂质体+微泡组之间、500 k Hz超声组与1 MHz超声组之间转染率比较差异无统计学意义。结论低频超声辐照微泡可显著促进脂质体介导的p EGFP质粒转染人前列腺癌PC3细胞。在相同声功率、相同辐照面积下,随着辐照频率的升高,转染率呈现下降趋势。     

低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导pEGFP-N1基因转染体外前列腺癌细胞

目的探讨低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染前列腺癌细胞的可行性,并对超声微泡浓度参数进行优化。方法将前列腺癌PC-3细胞悬液分为空白对照组、超声组、微泡组、微泡+超声组、脂质体组、脂质体+微泡组、脂质体+超声组、脂质体+微泡+超声组,其中脂质体+微泡+超声组根据微泡体积浓度不同分为(0、10%、20%、30%、40%和50%)6个亚组。经超声辐照,24h后用荧光显微镜观察细胞中基因表达情况,并用流式细胞仪检测转染率。结果脂质体+微泡+超声组基因转染效率最高,与其他组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);在脂质体+微泡+超声亚组中,微泡浓度为20%亚组基因转染率最高。结论低频超声联合微泡能有效增强脂质体介导pEGFP-N1基因在体外前列腺癌细胞中的转染率,20%是体外基因转染前列腺癌细胞的最佳微泡浓度。     

共聚物P85联合超声微泡介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨共聚物P85与黏附增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein,EGFP)质粒的微泡造影剂(microbubble,MB)结合后联合一定强度的超声(ultrasound,US)辐照,是否增强人肝癌细胞(HepG2)的质粒转染及表达.方法 以人肝癌细胞(HepG2)为研究对象,质粒DNA是可表达绿色荧光蛋白的pEGFP,添加微泡造影剂或共聚物P85后进行脉冲多普勒超声辐照(频率1 MHz,声强1 W/cm2,工作周期20%,时间20 s).24 h后台盼蓝染色评价细胞存活率,荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞的基因转染率.结果 有超声辐照组的pEGFP转染率明显高于无超声辐照组(P＜0.01),有超声辐照组中pEGFP+30%MB+P85+US组转染效率(22.14±3.06)%优于单独使用微泡组(11.34±2.2)%或P85组(9.72±1.21)%(P＜0.01).结论 微泡造影剂与共聚物P85结合同时给予超声辐照可增强基因转染效率,在基因治疗上有待于进一步关注和研究.     

超声微泡介导自杀基因对卵巢癌细胞的抗瘤效应

目的探讨超声微泡介导自杀基因对卵巢癌SKOV3细胞抗瘤效应的机制。方法采用最适超声转染参数,以超声介导微泡转染pORF-HSV1TK质粒,将SKOV3细胞分成6组:阴性对照组(C组)、超声辐照组(U组)、脂质体组(L组,阳性对照组)、脂质体+超声辐照组(L+U组)、脂质体+微泡+超声辐照组(L+M+U组)和微泡+超声辐照组(M+U组)。以RT-PCR检测HSV1TK的表达,以MTT测定各组细胞增殖抑制率。光镜下观察各组转染细胞数量、形态变化,以流式细胞术(FCM)检测各组细胞凋亡率及细胞周期。结果L+M+U组HSV1TK基因表达最强,细胞增殖抑制率明显高于其他组(P均<0.05),且光镜下细胞数量减少最多,形态明显异常;其细胞凋亡率为(49.13±0.82)%,且大多数细胞周期被阻断于G1期(P<0.05)。结论超声介导微泡能增强HSV1TK/GCV系统抑制SKOV3增殖和诱导SKOV3凋亡的作用,且将SKOV3细胞周期阻断在G1期,从而发挥抗瘤效应。     

超声联合声诺维辐照增强GFP基因在鼠胶质瘤C6细胞中的转染

目的 探讨超声联合声诺维微泡辐照对增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)在鼠胶质瘤C6细胞中的转染增效作用及安全性.方法 实验分为4组:单纯质粒组、质粒+微泡组、质粒+超声组和质粒+超声+微泡组.辐照条件为超声频率1 MHz,声强1 W/cm2,辐照时间30 s,占空比20%.按不同实验条件辐照后,应用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪评估基因转染效率,台盼蓝染色法评估细胞活力.结果 经超声联合微泡辐照C6细胞后,GFP基因转染效率较其他组显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),且各组均未发现显著的细胞损伤.结论 超声联合声诺维微泡辐照可显著增强GFP基因在鼠胶质瘤C6细胞的转染,为临床胶质瘤基因治疗提供了一种安全,有效的非病毒基因转染方法.     

超声微泡介导pEGFP-N1质粒转染人牙周膜成纤维细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂在一定能量的超声波辐照下,介导质粒pEGFP-N1转染人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的效率及安全性.方法 体外原代培养HPDLFs,以EGFP基因为报告基因,脂质微泡造影剂为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N1转染HPDLFs.实验组超声+微泡+质粒组根据转染条件不同分成不同亚组,对照组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组和脂质体+质粒组.转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP表达.同时用MTT法检测HPDLFs的活力.结果 超声微泡介导的质粒对HPDLFs的转染效率与脂质体介导的质粒转染效率相似,明显高于其他对照组.超声+微泡+质粒组中HPDLFs的活力明显高于脂质体+质粒组.结论 在一定条件下,超声微泡能安全、有效地介导外源基因的转染与表达.     

不同超声辐照时间和微泡剂量介导HepG2细胞基因转染的实验研究

目的 探讨不同超声辐照时间和微泡剂量与基因转染效率之间的关系,初步摸索适宜转染的参数条件.方法 质粒DNA用增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP),以人肝癌细胞(HepG2)为研究对象.超声频率1 MHz.声强0.5 W/cm2,对加入pEGFP和不同剂量微泡的HepG2细胞辐照不同的时间,24 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测基因转染率,台盼蓝染色检测细胞存活率.结果 各实验组均可见不同程度荧光蛋白表达,辐照时间为20 5和微泡剂量为60μl时可达到较理想的转染效率.结论 在超声频率和声强一定的条件下,不同超声辐照时间和微泡剂量有不同的基因转染效率,20 s、60 μl是一个较理想的参数,为基因治疗进一步研究提供了参考.     

超声辐照微泡声学造影剂增强脂质体介导肝细胞基因转染的体外实验研究

目的研究超声破坏微泡声学造影剂提高脂质体介导肝细胞生长因子质粒（plRES—EGFP—HGF）在肝细胞中转染率的可行性。 方法将培养的肝细胞分为4组：（1）单纯对照组，（2）脂质体转染组，（3）超声辐照脂质体转染组，（4）超声辐照微泡＋脂质体转染组。第（4）组按照每孔加入造影剂剂量又分为1）10μl组，2）20μl组，3）30μl组，4）40μl组4亚组。超声辐照微泡＋脂质体转染组在脂质体介导肝细胞生长因子转染肝细胞1h后，在24孔板中每孔加入微泡声学造影剂10，20，30或40μl，超声辐照60s。24h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况、MTT法检测肝细胞增殖率和流式细胞仪检测基因转染率。 结果超声频率1MHz，功率0．5W／cm。辐照60S，每孔加入造影剂30μl时肝细胞基因转染效率最高，与脂质体转染组比较有显著性。 结论在一定条件下，超声辐照微泡声学造影剂可明显提高脂质体介导肝细胞基因转染效率，为基因治疗提供了新的思路。     

超声辐照和SonoVue微泡在介导hAng-1基因体外转染时的作用和量效关系探讨

目的 探讨超声辐照和SonoVue微泡分别使用和联用在介导hAng-1基因体外转染过程中的作用以及辐照强度和微泡浓度对转染效率和细胞活性的影响.方法 实验分四组A组:单纯超声辐照+质粒组;B组:微泡+质粒组;C组:超声辐照+微泡+质粒组和空白对照组D组. C组内转染参数分别设置为超声照射强度0.5、1.0 、1.5和2.0 W/cm~2,微泡浓度5%、10%、20%、30%和40%.将连接有eGFP-C_3-hAng-1质粒的SonoVue微泡对293T细胞进行转染,48 h后检测各组基因转染效率和细胞存活率. 结果转染48 h后C组转染效率最高,荧光阳性细胞数最多,强度最大;A组转染效率很低,见少量荧光表达;B、D组无明显基因转染发生.随着超声照射强度和微泡浓度的增加,基因转染效率会逐步升高,具有统计学意义.微泡浓度大于20%、超声照射强度超过1.5 W/cm~2后基因转染效率不再升高甚至降低,细胞死亡率显著增高(P<0.01).结论 SonoVue微泡介导外源基因转染必须联合超声辐照才能获得较好的转染效率.对于hAng-1基因和SonoVue微泡,选择声强1.5 W/cm~2,微泡浓度20%是相对最佳转染条件.     

超声微泡介导绿色荧光蛋白基因在视网膜神经节细胞表达的实验研究

目的探讨超声微泡介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因在视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中的转染效率、优化转染的条件及毒性。方法体外培养RGCs,以GFP基因为报告基因,微泡造影剂(声诺维)为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N1转染RGCs。实验组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组,超声+微泡+质粒组根据转染条件不同分成亚组;对照组为空白对照。荧光显微镜和流式细胞仪测定GFP的表达,MTT法检测RGCs的活性。结果与超声+质粒组相比,超声+微泡+质粒组RGCs转染率增加约5倍。优化转染条件后,频率300kHz,声强1.25W/cm2,连续波,辐照时间60s,微泡浓度45μg/ml,质粒浓度50μg/ml时,24孔板培养的RGCs转染率为(26.87±3.12)%。毒性实验证明超声微泡在该条件下进行基因转染对RGCs无毒副作用。结论在一定条件下,超声破裂微泡能增强基因的转染与表达,有望成为一种安全、有效的基因载体。     

新型白蛋白微泡经超声介导破裂促进EGFP基因在Cos-7细胞的表达

目的：根据超声介导白蛋白微泡破裂空化效应可以增加真核细胞膜对大分子(如DNA)通透性的原理，探讨一种新的转基因方法，以便安全有效和定向地转移目的基因。方法：实验中选择绿色荧光蛋白基因EGFP为标记基因，以自制的白蛋白微泡为载体，用超声介导微泡破裂的方法在体外进行Cos—7细胞的基因转化，同时以脂质体为对照，激光共聚焦显微镜和流式细胞计数仪分别定性和定量观察细胞转化效率。锥虫蓝染色观察细胞的活性。结果：体外试验发现0．8MHz、1．0W／cm^2、10％占空比(dutycycle)、60s超声介导10％白蛋白微泡破裂可以有效稳定地转化EGFP基因在Cos—7细胞表达，且对细胞无毒副作用。结论：自制白蛋白微泡是一种安全、有效的新型基因载体，在一定超声条件控制下，能增强基因的转导与表达，有良好的靶向性，提示该技术有应用于临床基因治疗的广阔前景。     

超声破坏微泡法介导增强型绿色荧光蛋白质粒转染兔股骨头组织的安全性及可行性(英文)

背景:超声微泡转染系统已尝试于体内多部位的基因转染,但尚未见有用于骨部位基因转染的报告。目的:观察超声破坏微泡法介导增强型绿色荧光蛋白质粒转染兔股骨头组织的效率及可行性。方法:将日本大耳白兔按随机均分为裸转染组,预照射+裸转染组,超声定位转染组,预照射+超声定位转染,重复定位转染组。其中前2组不给予超声定向转染照射,后3组利用超声微泡破裂法介导增强型绿色荧光蛋白质粒,定向基因转染兔股骨头。各组转染1周后,于荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白在股骨头组织中的表达情况。结果与结论:超声定位转染组,预照射+超声定位转染,重复定位转染组均有增强型绿色荧光蛋白表达,且复定位转染组增强型绿色荧光蛋白质粒在兔股骨头内的转染效率明显高于其他组(P<0.01)。超声定位转染组,预照射+超声定位转染,重复定位转染组兔超声照射部位软组织和骨组织切片未观察到明显损伤病灶。结果证实,超声微泡破裂法能安全、有效实现增强型绿色荧光蛋白质粒在兔股骨头组织的转染。     

超声介导白蛋白微泡破裂对外源性基因在ECV304细胞和BALB/c鼠心肌中的表达

目的 探讨经超声介导白蛋白微泡破裂对外源性基因在体外ECV304细胞的转染效率及表达情况和在BALB／c鼠心肌中的表达及显像效果。方法 18只BALB／c小鼠分为裸质粒组（P组）、质粒＋超声介导转化组（P＋U组）、质粒＋白蛋白微泡＋超声介导转化组（P＋M＋U组），每组6只。选择携带增强绿色荧光蛋白基因（EGFP）的质粒DNA并与自制的白蛋白微泡相混，以超声介导白蛋白微泡破裂方法分别在体外对ECV304细胞及体内对BALB／c鼠心肌细胞进行基因转染，并测定基因转染和表达效率。结果 体内和体外研究表明，超声介导的白蛋白微泡破裂组（P＋M＋U组）与P和P＋U组相比可明显提高外源性基因转染及表达效率（P〈0．01）。体外采用频率0．8MHz、声强1．0W／cm^2、10％占空比，并30s两次的超声介导白蛋白微泡破裂可有效稳定地转染EGFP基因在ECV304细胞中的表达，并对细胞无毒副作用；体内超声介导白蛋白微泡破裂后具有良好的心肌灌注显像效果。结论 超声介导的白蛋白微泡破裂是一种安全且有效的基因转染方法，在一定的超声条件下可明显提高外源性基因在体内和体外的转染和表达。     

不同辐照模式低频超声对前列腺癌DUl45细胞的影响

目的探讨不同辐照模式低频超声对前列腺癌DUl45细胞的影响。方法对体外培养的人前列腺癌DUl45细胞悬液进行不同模式的低频超声辐照：第A组为对照组,第B组为脉冲波辐照模式,第C组为连续波辐照模式。辐照后即刻用荧光显微镜检测FD500染色阳性率反映细胞膜通透性改变情况;辐照后24h用MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果与对照组相比,两种模式的超声波处理组FD500染色阳性率均增加;与连续波模式相比,脉冲波模式FD500染色阳性率增加明显,差异有统计学意义（P〈O．01）。脉冲波模式轻微抑制细胞增殖,连续波能明显抑制细胞增殖（P〈0．05）。与对照组相比,两种模式的超声波处理组DUl45细胞凋亡率均增加;与脉冲波模式相比,连续波模式DUl45细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论不同辐照模式低频超声能够影响前列腺癌DUl45细胞的生物学行为。应用于基因转染或载药目的时,选择脉冲波模式增加细胞膜通透性;应用于治疗目的时,选择连续波模式能够抑制肿瘤生长。     

超声造影剂在肝癌基因治疗中的靶向性实验研究

目的 探讨结合了肝细胞配体的超声造影剂在超声辐照下介导目的 基因转染肝癌细胞的可行性,寻找一种新的基因靶向导入方法.方法 制备肝细胞表面特异性配体半乳糖基化多聚赖氨酸(GPLL),并对产物进行红外光谱分析.将c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)、G-PLL与SonoVue微泡三者偶联,在超声波介导下,促使c-myc ASODN转染人肝细胞癌SMMC-7721细胞及肺腺癌A-549细胞(作对照),实验结束后行半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以观察不同组问c-myc基因的表达情况.结果 超声介导微泡破裂可增加c-myc ASODN在SMMC-7721细胞和A-549细胞中的表达;SMMC-7721细胞加入G-PLL组中c-myc基因表达水平显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01),而A-549细胞中加入与未加入G-PLL组间c-myc基因表达量的差异无统计学性意义(P＞0.05).结论 超声介导微泡造影剂破裂的方法可促进基因的转染,而超声联合肝细胞受体介导的微泡造影剂则更具有肝细胞靶向性,能有效地促进目的 基因在肝癌细胞中的表达,为肝癌基因治疗提供了新的途径.     

VK3通过引起氧化应激激活NF-κB诱导PC-3M细胞发生凋亡

目的探讨维生素K3（VK3）作用下人雄激素非依赖前列腺癌PC-3M细胞发生凋亡的机制。方法PC-3M细胞按处理方法不同分对照组、VK3（60／μmol／L）组、VK3（60μmol／L）＋NAC（40μmol／L）组,给药事件均为12h。应用MTF法检测PC-3M细胞生存率;PI-AnnexinV双染法检测细胞凋亡率;荧光法检测细胞内还原型谷胱甘肽含量;提取细胞核蛋白,Western-blot法检测核蛋白中NF-κB的P65和P50亚单位表达。结果与对照组相比,60μmol／LVK3作用下,PC-3M细胞生存率和细胞内还原型谷胱甘肽含量降低,凋亡率和核蛋白中P65和P50表达增加;60μmol／LVK3和40μmol／LNAC联合应用的时候,与VK3单独作用组相比,细胞细胞生存率增加,还原型谷胱甘肽含量增加,凋亡率下降,核蛋白中P65和P50表达下降。结论VK3可能主要通过引起PC-3M细胞内氧化应激导致NF-κB激活诱导细胞发生调亡。     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白2具有很强的诱导干细胞成骨活性。目的：构建人骨形态发生蛋白2基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果。方法：通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2。利用脂质体LipofectamineTM2000分别介导人骨形态发生蛋白2基因、EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并经G418进行筛选。结果与结论：酶切鉴定及DNA测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建成功。经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为（18.0±0.42）%,并经过G418筛选后获得了稳定转染的细胞。细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响。ELISA检测发现人骨形态发生蛋白2组的人骨形态发生蛋白2因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达。经人骨形态发生蛋白2基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高。