多重PCR用于志贺菌的基因分型研究

[目的]用多重PCR法鉴定志贺菌的初步研究。[方法]运用多重PCR法对117例来自不同医院的腹泻病人粪便细菌标本进行多重基因联合鉴定。[结果]用多重PCR法鉴定志贺菌其灵敏度和特异性均高于生化鉴定法（PCR检出率55％vs生化检出率33％）。[结论]多重PCR法可用于志贺菌的鉴定。     

儿童细菌性痢疾志贺菌属血清型分布及耐药性分析

为了解本地区儿童细菌性痢疾志贺菌属感染的血清型及其耐药性,我们对2006年4~10月本院儿科就诊患儿粪便标本中分离到的79株志贺菌进行血清学分型和药敏试验,结果如下。1材料SS、M-H和中国蓝培养基购自天津金章公司;抗生素纸片(氨苄西林、复方新诺明、头孢曲松、头孢吡肟、头孢他啶、氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、安曲南、亚胺培南)、肠杆菌科生化鉴定管、志贺菌属诊断血清等购自杭州天和公司。2培养及鉴定按照全国临床检验操作规程(第二版)进行实验操作;对疑似志贺菌属的菌株进行生化鉴定,再用志贺菌属诊断血…     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8 h内同时检测3种目的菌,通过检测其他9种常见食源性致病菌,结果表明该方法特异性好,多重PCR检测灵敏度分别为:沙门菌104cfu/mL,志贺菌102cfu/mL,副溶血性弧菌104cfu/mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应（PCR）技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8h内同时检测3种目的菌,通过检测其他9种常见食源性致病菌,结果表明该方法特异性好,多重PCR检测灵敏度分别为：沙门菌10^4cfu／mL,志贺菌10^2cfu／mL,副溶血性弧菌10^4cfu／mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

福氏志贺菌gtrI基因突变导致的血清型回复转换

目的 研究携带O抗修饰基因gtrI的福氏志贺菌Y血清型菌株特征。方法 采用血清型多重聚合酶链反应(PCR)分型方法检测携带gtrI基因但I型抗原表位阴性的福氏志贺菌Y血清型菌株,并对其gtrI基因簇进行序列分析,对其基因组进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析。结果 5株福氏志贺菌基因组携带gtrI基因簇,但是I型抗血清凝集阴性,表现为Y血清型特征;测序发现这5株菌株中的gtrI基因均发生了功能失活性突变;PFGE分析显示这5株菌株与福氏志贺菌血清型1a菌株具有相同或相近的PFGE带谱。结论 携带O抗修饰基因gtrI的福氏志贺菌Y血清型菌株来源于血清型1a。     

IPaH-1基因在志贺氏菌表达的检测及PCR条件的优化

目的检测IPaH1基因在志贺氏菌特异性表达水平并对PCR条件进行优化。方法应用设计的针对IPaH1基因的特异性引物,通过PCR法检测IPaH1基因在鲍氏志贺氏菌、野生志贺氏菌、大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌(O157:H7)、肠炎沙门氏菌、阪崎肠杆菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、单增生李斯特菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌的表达水平,并对PCR反应中退火温度、最佳引物浓度等进行优化。结果①在志贺氏菌检测到IPaH1基因特异性表达,而大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌(O157:H7)、肠炎沙门氏菌、阪崎肠杆菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、单增生李斯特菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌未见表达;②PCR法扩增志贺氏菌IPaH1基因时,第一对引物IPaH1-1的最适退火温度为55.0℃-59.0℃,第二对引物IPaH1-2为51.0℃-55.0℃;两对引物理想终浓度均为0.1μM。结论 IPaH1基因特异表达于志贺氏菌;应用设计的引物通过PCR法扩增志贺氏菌IPaH1基因的最适退火温度分别为55.0℃-59.0℃、51.0℃-55.0℃,最适引物终浓度均为0.1μM。     

福氏志贺菌Xv血清型聚合酶链反应鉴定方法的建立及应用

目的建立福氏志贺菌Xv血清型聚合酶链反应(PCR)鉴定方法。方法根据福氏志贺菌Xv血清型O抗结构,针对O抗合成基因wzx、7;8群抗原决定基因gtr X和MASF IV-1抗原决定基因opt,建立PCR扩增鉴定方法。并应用该方法对139株福氏志贺菌临床分离株进行血清型检测。结果建立一种福氏志贺菌Xv血清型PCR鉴定方法,该体系在一个反应中包括3对引物,Xv血清型PCR扩增全部为阳性,可将Xv血清型与目前已知的其他18种福氏志贺菌血清型完全区分。非福氏志贺菌菌属及腹泻相关菌属菌株检测结果发现无任何PCR扩增产物。对139株不同血清型福氏志贺菌临床分离株的鉴定结果显示,该方法可将Xv血清型鉴定,与血清凝集结果一致。结论本研究建立的福氏志贺菌Xv血清型PCR鉴定方法具有快速、特异的优点,可以用于检测和监测。     

儿童细菌性痢疾志贺菌属的血清型分布及耐药性分析

目的调查引起儿童细菌性痢疾的志贺菌属的血清型分布及其耐药性，指导临床合理用药。方法对2000年6月～2003年10月门诊及住院患儿大便培养分离所得359株志贺菌进行血清学分型和抗生素敏感试验。结果儿童细菌性痢疾福氏志贺菌感染占71.0％，宋氏志贺菌感染占29．0％；总耐药率为27．0％，其中福氏为31.4％，宋氏为16．2％。志贺菌对氨苄西林、阿莫西林／克拉维酸、氨苄西林／舒巴坦、诺氟沙星、复方新诺明耐药严重。结论福氏志贺菌是儿童痢疾主要的血清型，临床治疗宜根据药敏结果用药。     

儿童细菌性痢疾志贺菌属的血清型分布及耐药性分析

目的调查引起儿童细菌性痢疾的志贺菌属的血清型分布及其耐药性,指导临床合理用药。方法对2000年6月～2003年10月门诊及住院患儿大便培养分离所得359株志贺菌进行血清学分型和抗生素敏感试验。结果儿童细菌性痢疾福氏志贺菌感染占71.0%,宋氏志贺菌感染占29.0%;总耐药率为27.0%,其中福氏为31.4%,宋氏为16.2%。志贺菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、诺氟沙星、复方新诺明耐药严重。结论福氏志贺菌是儿童痢疾主要的血清型,临床治疗宜根据药敏结果用药。     

用多重PCR快速检测登革病毒并分型

目的 建立一种多重聚合酶链反应(PCR)方法，对不同型别登革病毒进行快速检测及分型。方法 采用4种型别登革病毒通用的外侧引物进行逆转录PCR(RT—PCR)反应，继用4对(5种)型特异引物在单管内进行巢式PCR，依据扩增产物的片段大小进行分型。结果 采用多重PCR，扩增出482、119、290及392bp的特异片段，分别代表登革病毒1～4型。结论 该方法快速、敏感、特异，有一定的推广应用价值。     

一种多重PCR方法快速鉴定7种常见肠道病原菌

目的 建立一种能够快速检测并分型5种致泻性大肠埃希菌、志贺菌及沙门菌的多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction,M-PCR) 方法。 方法 设计针对7种常见肠道致病菌的12对引物,通过多重PCR方法扩增后电泳观察相应条带,确定病原菌。临床标本直接划线接种于肠道选择性平皿,挑取可疑菌落直接提取核酸进行多重PCR检测。 结果 所有标准菌株均能扩增到相应目的片段,322份腹泻病标本中使用该方法共检出志贺菌24株(福氏志贺菌7株、宋内志贺菌17株)、 沙门菌5株、EPEC共12株(均为aEPEC)、ETEC共6株(elt阳性3株;est阳性3株)、EIEC共3株、VTEC共1株(stx1和stx2A均阳性)、EAEC共3株。 结论 该方法快速特异,能同时检测7种常见肠道致病菌,可用于腹泻病常见病原的快速检验。     

多重PCR快速检测3种致泻性大肠埃希菌方法的建立

目的利用多重聚合酶链反应(PCR)技术,建立一种可以同时快速检测肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR方法。方法根据EPEC的eae基因、EIEC的ipaH基因、EHEC的stx1基因筛选设计引物,建立多重PCR检测体系,并对PCR反应体系和条件进行优化。结果设计的3对PCR引物均能特异地扩增出相应的目的基因,该多重PCR体系能同时检测3种目的菌,特异度强。结论初步建立了一种能够同时快速检测3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR检测方法,可用于食品安全及食物中毒事件的快速筛查。     

浙江省衢州市应用聚合酶链反应检测钩端螺旋体效果评价

目的 建立聚合酶链反应(PCR)检测钩端螺旋体的快速方法,应用于宿主动物钩端螺旋体的快速检测,同时比较PCR方法和常规检测的效果.方法 根据中国疾病预防控制中心提供的引物,以致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、溶藻弧菌、沙门菌、霍乱弧菌、痢疾志贺菌、非O1、O139霍乱弧菌、副溶血性弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7为对照,建立PCR检测钩端螺旋体的快速方法,用于钩端螺旋体的快速检测.结果 衢州市2006年分离钩体菌株进行PCR鉴定结果与血清学鉴定结果相符.100只鼠和100只蛙肝、脾、肾标本进行PCR检测,PCR检测阳性率10%,钩体菌株培养分离率仅为1%,二者差异有统计学意义(2=16.05,P0.005).结论 PCR检测钩端螺旋体灵敏度高、特异性强,可用于钩端螺旋体的快速检测.     

多重PCR在幽门螺杆菌检测及分型中的应用

应用多重ＰＣＲ同时扩增１６ＳｒＲＮＡ和ｃａｇＡ基因来检测幽门螺杆菌感染及其分型。ＰＣＲ产物经ＤＮＡ序列测定证实为转异性扩增，敏感度为１０＾２ＣＦＵ／ｍｌ。４８株Ｈｐ菌株中，Ｉ型菌株（ｃａｇＡ＋）２６株（５４．２％）；５５０份胃粘液标本，Ｈｐ阳性（１６ＳｒＲＮＡ基因＋）２１６份（４７．５％），其中Ｉ型Ｈｐ１３９份（５３．３％）。     

呼吸道合胞病毒A与B亚型多重荧光PCR检测方法的建立及应用

目的建立一种新的呼吸道合胞病毒(RSV)分型检测方法,用于快速检测和监测。方法针对RSV G基因设计引物、探针,并引入人β-actin基因(ACTB)作为内参质控,建立RSV-A、RSV-B多重荧光PCR检测方法。使用多种常用呼吸道病原体及体外转录RNA产物考核其特异性和灵敏度。并对2015年1月至12月广州两家医院的儿童急性呼吸道感染患者进行检测。结果所建立的多重检测方法未见非特异性反应。RSV-A、RSV-B和ACTB分别可检测低至4、8和12 copies/μL的RNA模板,且分别在10~1×10~(10)copies/μL、100~1×10~(10)copies/μL和100~1×10~(10)copies/μL时具备良好的线性关系,线性相关系数r2均大于0.99。儿童急性呼吸道感染患者监测中,RSV-A为期间优势亚型。结论本研究所建立的RSV-A、RSV-B多重荧光PCR检测方法,具有较好的特异性、灵敏度、可操作性,可用于相关研究。     

6种食品致病菌的多重PCR检测

目的寻求食物中毒诊断及食品检测的有效方法。方法建立多重PCR体系一次检测多种食品致病菌方法。结果可以一次检测出肠毒性大肠埃希菌(E.coli-ETEC),蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus),沙门菌属(Salmonellaspp),大肠埃希菌O157:H7(E.coli-O157:H7),志贺菌属(Shigellaspp),霍乱弧菌(Vibriocholerae)等菌属或菌。结论多重PCR体系检测6种菌DNA的灵敏度最低为10.30fg,与单独的PCR检测的灵敏度相同。将它做成体外基因诊断试剂盒,将成为细菌性食物中毒诊断及食品检测的有效工具。     

Evaluation of LAMP assay using phenotypic tests and PCR for detection of blaKPC gene among clinical samples

BackgroundCarbapenem‐resistant Enterobacteriaceae (CRE) infection constitutes a public health threat, which blaKPC was the major carbapenemases concerned in China. Timely and efficient diagnosis is of paramount importance for controlling the spread of drug‐resistant bacteria. Here, we develop an approach based on loop‐mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid confirmation of blaKPC within 60 min from samples collected.MethodsWe designed primers specific to detect blaKPC and evaluated it for its sensitivity and specificity of detection using real‐time monitoring. Five hundred forty‐six clinical specimens were analyzed by the LAMP assay and compared with the phenotypic tests and PCR. The samples with inconsistent results were further verified by Sanger sequencing.ResultsThe LAMP assay displayed a detection limit of 1 × 10² CFU/ml, which was 10‐fold more sensitive than the PCR. No cross‐reactivity was observed for strains that produced other types of β‐lactamase. Furthermore, we demonstrated concordant results (Kappa > 0.75) between the genotypic method and phenotypic tests for the 546 clinical samples. The data presented in this study suggested that the genotypic method is a reliable assay for identifying blaKPC‐induced CRE in China. The results of the Sanger sequencing indicate that the developed method not only has high accuracy but also meets the need for rapid diagnosis, while the PCR method is prone to false negatives.ConclusionsWe successfully constructed a LAMP technique that can be used for auxiliary diagnosis of CRE, which is faster, cheaper, and more accurate than the PCR. It may therefore be routinely applied for detection of blaKPC producers in routine clinical laboratories.     

多重实时荧光PCR快速检测沙门菌和单增李斯特菌

目的 建立可同时检测沙门菌、单增李斯特菌的双重实时荧光PCR快速检测方法,并应用于食品样品的检测.方法 根据GenBank上下载的沙门菌invA基因、单增李斯特菌hlyA基因的保守区序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立并优化双重实时荧光PCR反应体系.对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行评估,并应用于食品标本...     

多重PCR-毛细管电泳检测儿童5种腹泻病毒的方法建立及应用

目的:建立肠道腺病毒(Adv)、诺如病毒G1及G2型(NoV G1和NoV G2)、A组轮状病毒(RV A)、扎如病毒(SV)及星状病毒(HAstV)5种儿童腹泻病毒多重PCR-毛细管电泳法检测体系。方法:针对Adv、NoV G1、NoV G2、RV A、SV及HAstV保守序列设计特异性引物,设计并优化腹泻病毒的多重PCR-毛细管电泳检测体系,琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段;进行性能(灵敏度、特异性)评估;收集185例儿童病毒样腹泻样本,采用多重PCR-毛细管电泳体系进行检测,并通过测序验证阳性结果。结果:所设计引物特异性扩增出5种腹泻病毒;多重PCR-毛细管电泳检测体系检出限为102~103 copies/μL,CV均<10%;其他腹泻病原体未出现交叉反应,无明显的非特异杂峰,特异性较好;185例临床病毒样腹泻样本检测阳性132例(71.35%),其中RV A 105例(56.8%)、Adv 22例(11.9%)、SV 15例(8.1%)、NoV G211例(5.9%)和HAstV 10例(5.4%),其中包括双病毒感染样本;毛细管电泳进样量需20μL,3 h内完成全部分析;测序结果与GeneBank比对分析,序列一致。结论:成功建立一种能够快速筛查5种常见儿童腹泻病毒的多重PCR-毛细管电泳检测方法。