外源性睫状神经营养因子干预缺损神经再生及运动功能的恢复*

背景：睫状神经营养因子作为生物活性因子家族的成员,因其生物活性的多效性而备受基础与临床研究的重视。 目的：探讨睫状神经营养因子对缺损神经再生及其运动功能恢复的影响及相关因素。 方法：40只大鼠建立高位神经缺损模型后随机数字表法均分成4组,3个实验组分别将不同质量浓度10,20,40 mg/L的外源性睫状神经营养因子液0.2 mL注入神经再生室内,对照组注入等量的生理盐水。两组干预后检测坐骨神经功能指数、神经肌肉动作电位、神经再生及其靶器官的形态学变化。 结果与结论：治疗后4周,各组坐骨神经功能指数差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗后8,12周,各实验组的坐骨神经功能指数、运动神经传导速度、腓肠肌湿质量及截面积残存率均明显高于对照组(P < 0.05),各组神经远段再生的有髓神经纤维数量、直径、截面积及髓鞘厚度均小于自体神经近段(P < 0.05),其中以40 mg/L质量浓度指标变化最为显著(P < 0.05)。说明在修复缺损神经过程中,向由可降解生物膜形成的神经再生室内加入一定浓度的外源性睫状神经营养因子,对受损神经的结构再生与运动功能恢复有一定的促进作用。关键词：睫状神经营养因子;坐骨神经功能指数;运动神经传导速度;坐骨神经;神经再生 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.21.002     

睫状神经营养因子促进大鼠坐骨神经运动轴突再生

睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic Factor,CNTF)作为神经营养因子家族一员,在神经系统发育和神经损伤修复过程中具有重要作用.但在周围神经再生时,睫状神经营养因子的作用如何,尤其是其对运动轴突、感觉轴突的作用,目前未见研究报道.本实验采用160～200克雄性SD大鼠,一侧作手术侧,另一侧不手术作正常对照侧.睫状神经营养因子组6只,生理盐水组5只.暴露股后部坐骨神经,切除约2mm长的坐骨神经,用硅管(内径1mm,外径2mm)套接神经断端,断端间距约5mm.睫状神经营养因子组术时将重组人睫状神经营养因子(25μg)溶液注入硅管中.生理盐水组所给液体为生理盐水.术后分别皮下注射睫状神经营养因子(350μg/kg/天)和生理盐水.术后4周,多点注射30%辣根过氧化物酶于两侧腓总神经中.动物再存活48小时,灌注固定,取脊髓L_(3～6)节     

重组睫状神经营养因子对周围神经再生中多种细胞的作用

为了解重组睫状神经营养因子 ( CNTF)对周围神经再生中多种细胞的作用 ,用硅管套接切断的成年大鼠坐骨神经 ,在受损神经局部一次性给予重组睫状神经营养因子 :用免疫组织化学 ABC法结合计算机图像分析观测再生神经中 GAP-4 3、S10 0、CD68、MHC- 免疫反应阳性物质的变化。与生理盐水对照组相比 ,证明 CNTF组再生神经中上述四种物质显著增多。结果提示重组睫状神经营养因子能促进轴突的再生、Schwann细胞的迁入、单核细胞的渗出和活化     

脂肪源性干细胞促进大鼠受损坐骨神经传导及脊髓脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子的表达

目的:探讨脂肪源性干细胞(ADSCs)对坐骨神经损伤大鼠神经传导功能以及脊髓脑源性神经营养因子(BDNF)和睫状神经营养因子(CNTF)表达的影响。方法:将第4代ADSCs移植入脱细胞神经移植物(ANA)中,构建组织工程神经。大鼠随机分为正常组、杜氏改良Eagle培养基营养混合物F12(DMEM)组和ADSC组。DMEM组和ADSC组均建立坐骨神经损伤模型,后用相应的组织工程神经桥接损伤神经的断端。术后6周采用神经电生理记录仪检测各组大鼠坐骨神经传导速度和波幅,采用免疫荧光和Real-time PCR检测各组大鼠脊髓脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)蛋白和mRNA的表达。结果:ADSC组大鼠坐骨神经传导速度、波幅和脊髓BDNF和CNTF蛋白及mRNA表达均显著高于DMEM组。结论:ADSCs可增加坐骨神经传导速度和波幅、上调脊髓BDNF和CNTF的表达。     

睫状神经营养因子对坐骨神经切断吻合后大鼠脊髓前角胶质纤维酸性蛋白表达的影响

背景:睫状神经营养因子具有多种生物活性,在神经系统发育、分化和损伤修复中具有重要意义。目的:观察睫状神经营养因子对坐骨神经切断吻合后大鼠相应脊髓节段前角星形胶质细胞的特异标记物胶质纤维酸性蛋白表达的影响。方法:将SD大鼠随机分为对照组、模型组、生理盐水组及药物组。除对照组外,对所有大鼠实施双侧坐骨神经切断吻合术,药物组手术区局部注射睫状神经营养因子100ng/kg,1次/d,生理盐水组局部注射等量生理盐水。术后1,3,7,14,21,28d取相应脊髓节段,免疫组织化学染色观察胶质纤维酸性蛋白的表达,苏木精-伊红染色、TUNEL染色对脊髓前角神经元进行计数。结果与结论:大鼠坐骨神经切断吻合后相应脊髓节段星形胶质细胞胞体大,突起分枝多且粗大,神经元数目逐渐减少,凋亡神经元增多,胶质纤维酸性蛋白表达增高。与模型组和生理盐水组比较,药物组神经元存活数目增多,凋亡减少,胶质纤维酸性蛋白表达明显增加(P0.05或P0.01)。同时,药物组大鼠的运动功能障碍较轻,恢复较快。说明睫状神经营养因子可以通过促进大鼠脊髓前角胶质纤维酸性蛋白的表达起到神经保护作用。     

大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子真核表达载体的构建及其体外表达的鉴定

背景：星形胶质细胞被激活后表现出神经干细胞的特性,细胞表面的神经营养因子(表皮生长因子、睫状神经营养因子)受体超表达,通过改善复杂的内环境,有利于定向诱导神经干细胞向神经元的分化。 目的：构建大鼠pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表达质粒,检测其在cos-7细胞中的共表达。 方法：采用反转录-聚合酶链反应技术从大鼠颌下腺、坐骨神经组织总RNA中扩增出表皮生长因子、睫状神经营养因子基因功能区,将上述基因片段分别连接到真核表达载体pSecTag2/Hygro B,聚合酶链反应初步筛选、双酶切鉴定后送测序。将构建成功的两种重组载体单独及共转染cos-7细胞,Western blot法鉴定重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白的瞬时表达。 结果与结论：反转录-聚合酶链反应结果证实成功获得大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子cDNA。DNA序列分析证实2种真核表达载体中的表皮生长因子、睫状神经营养因子序列与GenBank中目的序列一致。脂质体介导转染cos-7细胞48 h后,Western blot鉴定重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白在cos-7细胞中的表达,分别在Mr6 000,22 000处出现阳性条带。提示大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子基因的真核表达载体pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF构建成功,共转染cos-7细胞后能够共表达重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白。     

重组人睫状神经营养因子干预家兔视神经损伤动物模型视神经蠕变特性的分析

以蠕变特性指标研判重组人睫状神经营养因子干预动物视神经损伤的效果。以钳夹法复制动物视神经损伤模型,以重组人睫状神经营养因子连续干预30 d后,对各组动物进行视觉电生理检测,之后取各组动物视神经进行组织形态观察和蠕变实验。视神经损伤模型以重组人睫状神经营养因子干预治疗组Pl峰值大于视神经损伤模型组,差异显著(P0.05)。以重组人睫状神经营养因子干预治疗组视神经纤维结构尚存,较少部分视神经纤维排列不规则,视神经无明显变细,视神经损伤模型组兔视神经纤维束结构消失,神经纤维和胶质细胞变性、坏死。视神经损伤以重组人睫状神经营养因子干预治疗组7 200 s应变上升量大于视神经损伤模型组组、差异显著(P0.05)。以重组人睫状神经营养因子干预治疗动物视神经损伤模型后视神经的织形态、蠕变特性等得到较大的恢复。     

睫状神经营养因子对谷氨酸引起海马神经细胞内游离Ca~(2 )浓度和P53蛋白表达的作用

目的 :通过探讨睫状神经营养因子对谷氨酸引起海马神经细胞内游离 Ca2 浓度和 P53蛋白表达的作用 ,提供睫状神经营养因子存在非基因组快速作用途径 ,并对基因组信号转导产生影响的证据。方法 :用活细胞内荧光探针 Fura2 / AM实时检测睫状神经营养因子对谷氨酸引起海马神经细胞内游离 Ca2 浓度的影响 ,并用免疫组化方法观察睫状神经营养因子对谷氨酸引起海马神经细胞内 P53蛋白表达的作用。结果 :谷氨酸可引起海马神经细胞内游离 Ca2 浓度快速升高 ,并在 50 0μmol/ L-1范围内呈剂量依赖性。2 0 0μmol/ L-1的谷氨酸可上调 P53蛋白表达。睫状神经营养因子对静息条件下海马神经细胞内的游离 Ca2 浓度无显著改变。用睫状神经营养因子孵育 5min后 ,可快速压抑谷氨酸引起的胞内游离 Ca2 浓度升高 ,并下调 P53蛋白表达。结论 :睫状神经营养因子可能通过Ca2 信号的快捷途径 ,启动基因组的信号转导     

脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞向神经样细胞分化(英文)

背景:体外培养条件下脐血间充质干细胞可向神经样细胞诱导分化,一定浓度范围的脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子联合体外诱导可获得较高的神经元分化比例。目的:观察脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞分化成神经样细胞的可行性。方法:取第5代的脐血间充质干细胞,分别用5,10,20μg/L的脑源性神经营养因子和5,10,20μg/L睫状神经营养因子单独或联合诱导脐血源间充质干细胞向神经样细胞分化,另设空白对照组无任何干预措施。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,于实验第1,3,6天分别进行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色,并计数分化为神经元样细胞及神经胶质细胞的比例。结果与结论:①向神经细胞诱导后,人脐血源间充质干细胞形态明显改变,胞体收缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构。②与空白对照组相比,脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子能显著提高人脐血源间充质干细胞分化为神经元的比例。其中20μg/L的脑源性神经营养因子联合20μg/L睫状神经营养因子诱导人脐血源间充质干细胞分化为神经样细胞的比例最高。提示人脐血间充质干细胞经脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子体外诱导,均能够分化为神经样细胞。     

睫状神经营养因子缓释微囊的制备及表征

背景:睫状神经营养因子眼部给药非常困难且药物生物利用度较低,需要长期连续给药,为解决这一问题,可将其包封在选择性透过膜中形成微囊,利用膜的选择透过性释放囊内的生物活性物质或活体细胞分泌的生物活性分子和小分子代谢产物。目的:制备具有特殊结构的睫状神经营养因子缓释微囊。方法:将聚醚砜中空纤维膜的一端用医用胶紫外光固化封口,再将睫状神经因子从另一端注入聚醚砜微囊中,并用医用胶紫外光固化封口,制得睫状神经营养因子缓释微囊。将缓释微囊浸提液与小鼠成纤维细胞L929共培养,考察微囊的细胞毒性;将小鼠视网膜色素上皮细胞与缓释微囊共培养,考察细胞在缓释微囊表面的黏附性;将睫状神经营养因子缓释微囊浸泡在生理盐水中考察其降解性;同时考察在聚醚砜中空纤维囊中免疫球蛋白IgG和睫状神经营养因子的体外释放行为。结果与结论:睫状神经营养因子缓释微囊的内径约为398μm,壁厚约为145μm,囊壁的外层由疏松大孔构成,内层呈现许多微小的囊孔,孔径约10 nm,在生理盐水中4个月基本无降解,具有良好的细胞相容性。聚醚砜中空纤维囊对蛋白的释放具有选择透过性,能选择性释放睫状神经因子,有效阻隔球状抗体IgG。同时,缓释微囊改善了以往给药体系的突释行为,睫状神经营养因子只在中间阶段呈现较小程度的突释,然后呈现平稳释放。     

靶肌肉注射促红细胞生成素对大鼠周围神经再生的作用

目的探讨靶肌肉注射人重组促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin，rh-EP0）对大鼠坐骨神经损伤后神经再生的作用。方法选用健康雄性SD大鼠12只，制备大鼠右侧坐骨神经钳夹损伤模型。实验动物随机分为2组，每组6只，EPO组：靶肌肉注射rh-EPO2500U／kg；对照组：注射同体积的生理盐水。术后第7d、14d、21d观察坐骨神经功能指数（SFI），第21d组织学观察脊髓腰膨大（L4～L6）、夹伤远端坐骨神经、损伤侧腓肠肌组织并作图象分析测定脊髓前角运动神经元数、再生有髓神经纤维数、髓鞘厚度、轴突直径和腓肠肌肌细胞横截面积等指标。结果术后第7d两组SFI无显著性差异，术后第14d、21dEPO组SFI恢复程度明显大于对照组，差别有显著性意义（P〈0．05）；术后第21d损伤侧脊髓前角运动神经元数、再生有髓神经纤维数、髓鞘厚度、轴突直径和腓肠肌肌细胞横截面积等指标，EPO组均优于对照组（P〈0．01，P〈0．05）。结论靶肌肉注射rh-EPO能促进周围神经再生和功能恢复。     

重组人睫状神经营养因子对大鼠坐骨神经再生长的影响

目的: 观察重组人睫状神经营养因子(CNTF)对大鼠坐骨神经再生长的影响,并与神经生长因子(NGF)的作用进行比较。方法: 随机将动物分成正常对照组、模型组、CNTF给药小剂量组(48 μg/kg)、中剂量组(216 μg/kg)、大剂量组(1 080 μg/kg)、NGF 给药组(20 μg/kg),每组各10只。模型组采用大鼠坐骨神经切断再缝合法造成坐骨神经损伤模型,给药组采用不同药物剂量对神经损伤部位肌肉注射给药45 d后,测定神经动作电位潜伏期和传导速度。结果: 与模型组相比较,CNTF各给药组神经动作电位潜伏期显著缩短(P<0.01),传导速度显著增快(P<0.01);同时,216 μg/kg、1 080 μg/kg CNTF组和NGF组对神经动作电位潜伏期的影响无显著差别(P>0.05),但是216 μg/kg、1 080 μg/kg CNTF组的神经动作电位传导速度比NGF组显著增快(P<0.01)。结论: CNTF对大鼠坐骨神经再生具有一定的促进作用,而且其作用可能优于NGF。     

TGF-β3与牙髓干细胞联合应用对兔面神经损伤修复的作用

目的 探讨转化生长因子-β3(TGF-β3)与牙髓干细胞联合应用能否显著促进兔面神经的损伤修复.方法 取16只成年健康新西兰大白兔,制备面神经上颊支7mm缺损并于损伤局部进行硅胶管套接的动物模型.右侧面神经随机设为(TGF-β3+牙髓干细胞)实验组(8只兔)和TGF-β3对照组1(8只兔),左侧面神经设为PBS液对照组2(8只兔)和正常对照组(8只兔).术后3月,进行大体形态观察、组织学观察及电生理检测.结果实验兔16只均进入分析,实验组再生神经直径与近、远端神经干相当,无神经瘤形成,外膜血管丰富,质地坚韧.再生组织切片HE染色显示:实验组面神经外膜完整,神经纤维排列相对较整齐,形态较完整,髓鞘肿胀,仍可见肥大增生的雪旺细胞,胞核浓密,束间血管较多.光学显微镜图像分析显示:实验组再生神经纤维总数多于其他2个对照组,再生神经纤维直径也远远大于其他2个对照组,其差异具有统计学意义(p＜0.05).超薄切片透射电镜结果显示:实验组的再生纤维以有髓神经纤维为主,形态规则,髓鞘板层结构清晰,轴浆内细胞器丰富.神经电生理检测结果显示实验组神经肌肉动作电位的潜伏期明显短于其他2个对照组[实验组(1.96±0.32) ms,对照组1(2.35±0.41) ms,对照组2(3.42±0.55)ms,p＜0.05],并且实验组神经肌肉动作电位的波幅明显高于其他2个对照组[实验组(11.06±3.25) mV,对照组1(8.40±1.68) mV,对照组2(4.62±0.77) mV,p＜0.05].结论TGF-β3与牙髓干细胞联合应用能显著提高面神经损伤后的修复作用.     

检测蟾蜍离体坐骨神经和腓肠肌生理功能的简便有效辅助装置

目的:设计一种检测蟾蜍离体坐骨神经动作电位和腓肠肌张力的简便有效辅助装置,并分析其实用性。方法:制作由固定坐骨神经和腓肠肌的坐骨神经槽和器官池组成的实验装置(L形管)。将蟾蜍离体坐骨神经-腓肠肌标本置于L形管中,利用BL-420S生物机能实验系统检测坐骨神经动作电位和腓肠肌张力。标本随机分为正常对照组、利多卡因神经组和肌肉组,每组6个标本。利多卡因组(0.05、0.2和1 g/L)用相应浓度的利多卡因处理后再用任氏液冲洗,通过分析其对神经和骨骼肌的可逆性麻醉作用,验证装置的实用性。结果:通过将标本固定于L形管,能够同时检测坐骨神经动作电位和腓肠肌张力曲线,且易于更换坐骨神经槽和器官池内液体。与对照组比较,0.05和0.2 g/L利多卡因使坐骨神经的阈强度和最大刺激强度显著性增高(P0.05),绝对不应期延长(P0.01),传导速度减慢(P0.01),1 g/L利多卡因完全阻滞神经传导。1 g/L利多卡因使腓肠肌的静息张力显著性升高(P0.01),最大单收缩幅度显著性降低(P0.01),但阈强度和最大刺激强度无统计学差异。冲洗后,坐骨神经和腓肠肌的观察指标完全或部分恢复到对照组水平。结论:作为辅助装置,L形管能够使蟾蜍离体坐骨神经动作电位和腓肠肌收缩性的检测更为便利。     

柴胡桂枝汤对离体蟾蜍坐骨神经动作电位的影响

目的:研究柴胡桂枝汤对蟾蜍离体坐骨神经干动作电位传导阻滞作用。方法:观察柴胡桂枝汤对蟾蜍离体坐骨神经复合动作电位的振幅和传导速度的影响。结果:柴胡桂枝汤作用0min、2min、4min、6min、8min、10min后均使坐骨神经干复合动作电位的振幅变小(P0.01),传导速度变慢(P0.01)并最终使坐骨神经动作电位消失。结论:柴胡桂枝汤能阻滞神经动作电位的传导。     

正中神经前臂段运动传导与腕管综合征严重程度的相关性研究

目的：探讨正中神经前臂段运动传导（fMCV）与腕管综合征（CTS）疾病严重程度的相关性,并初步探讨其发生机制。方法：以符合纳入标准的CTS患者66例（126只患手）为病例组,年龄、性别匹配的96例健康志愿者的非利手为对照组,均行神经电生理检测。采用正中神经末端运动潜伏期（DML）和复合肌肉动作电位（CMAP）作为CTS严重程度指标,并研究其与fMCV的相关性。结果：①尺神经：病例组与对照组的各电生理参数间比较差异均无显著意义（t检验,P〉0．05）;②正中神经：在病例组（n=126）和对照组（n=96）,DML（ms）分别为5．0±1．3、3．0±0．3,腕-掌段正中神经运动传导速度（m／s）分别为22．2±7．3、56．9±8．3,fMCV（m／s）分别为53．7±5．5、59．2±3．6,拇短展肌CMAP波幅（mV）分别为7．3±2．9、10．1±1．9。以上所有参数的值均经t检验,P〈0．05,差异有显著意义;③相关性：在病例组,fMCV与DML呈负相关（r=-0．35,P〈0．05）,与拇短展肌CMAP呈正相关（r=0．18,P〈0．05）。结论：fMCV的异常与CTS患者的严重程度相关,且正中神经逆行性变为其可能的发生机制。     

改性壳聚糖联合甲基泼尼松龙促进大鼠损伤坐骨神经的修复

背景：研究表明壳聚糖能够促进周围神经损伤修复,甲基泼尼松龙可改善损伤神经附近微环境,临床常用于中枢神经损伤急性期治疗。 目的：观察改性壳聚糖联合甲基泼尼松龙修复大鼠损伤坐骨神经的效果。 方法：将大鼠坐骨神经切断,立即显微吻合,分别于神经吻合周围注入改性壳聚糖,甲基泼尼松龙,改性壳聚糖+甲基泼尼松龙,生理盐水进行干预,并设假手术组进行对比。 结果与结论：在所有组中改性壳聚糖与甲基泼尼松龙联合治疗组展爪恢复时间最早(P < 0.05)。建模后4,8,12周,与改性壳聚糖组、甲基泼尼松龙组及生理盐水对照组相比,改性壳聚糖与甲基泼尼松龙联合治疗组坐骨神经传导速度较快(P < 0.05),腓肠肌湿质量残存率下降较少(P < 0.05),腓肠肌细胞直径及截面积较大 (P < 0.05)。建模后12周,改性壳聚糖与甲基泼尼松龙联合治疗组通过吻合口的神经纤维显著增多,且直径大小、排列较为一致,神经变性较轻。结果证实,改性壳聚糖联合甲基泼尼松龙治疗有利于促进大鼠坐骨神经损伤的修复与再生。     

神经节苷脂M_1对兔子运动神经再生影响的实验研究

目的研究局部应用神经节苷脂M1(GM1)对兔子运动神经-面神经损伤的修复作用,为临床早期应用神经节甘脂M1,促进面神经损伤再生提供理论和实验依据。方法将18只健康成年新西兰大白兔按随机原则分为实验组(神经节苷脂M1组)和空白对照组。建立兔面神经损伤后再生的实验模型,实验组于面神经吻合处滴注2.0μL(10μg)GM1溶液,空白对照组于面神经吻合后未作任何处理,分别在术后2周、4周、8周观察面神经的传导速度及组织学变化。结果术后2周、4周神经传导速度,实验组分别为(5.35±0.74)m/s,(14.25±1.3)m/s,空白对照组分别为(3.32±0.30)m/s,(8.10±0.92)m/s,实验组与空白对照组比较,差异有统计学意义(P0.05),术后8周神经传导速度,实验组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05),光学显微镜观察术后2周、4周实验组神经再生状况优于空白对照组,光学显微镜观察术后8周实验组与空白对照组神经再生状况差别不大。结论兔面神经横断伤后立即应用神经节苷脂M1对面神经损伤后早期(2周,4周)再生恢复有明显的促进作用。     

睫状神经营养因子对大鼠去神经骨骼肌的营养作用

目的：通过测定SD大鼠坐骨神经离断后比目鱼肌（SOL）和趾长伸肌（EDL）肌纤维横截面积,观察持续给睫状神经营养因子（CNTF）对神经骨骼肌萎缩的影响。结果：SD大鼠坐骨神经离断后,持续给0．2mg/kg.d的CNTF20天后,损伤侧SOL和EDL肌纤维横截面积分别比实验对照组高27％（P＜0．01）和14％,SOL肌纤维横截面积比EDL增加的幅度大,而给予0．05mg/kg.d的CNTF20天后,动物肌纤维横截面积与实验对照组无明显差异。结论：CNTF可显著改善坐骨神经离断后SD大鼠骨骼肌的萎缩,并且CNTF效应的强弱与用药剂量和肌肉类型有关,0．2mg/kg.dCNTF作用明显强于0．05mg/kg.dCNTF,慢肌（SOL）比快肌（EDL）对CNTF更敏感。