不同nPCL/HA电纺纤维薄膜对人骨髓间充质干细胞黏附率的影响

目的：观察nPCL/HA电纺纤维取向薄膜材料对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的黏附生长的影响,评价其作为组织工程支架材料的应用前景。方法：将体外诱导培养的人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）,经传代培养第5代的人骨髓间充质干细胞,以2×105的密度与不同nPCL/HA电纺纤维取向薄膜支架在培养板内共培养,同时以nPCL电纺纤维非取向薄膜材料作为对照,初步观察不同nPCL/HA支架材料与hBMSCs的复合培养情况,计算各材料的细胞黏附率。结果：hBMSCs与4种电纺薄膜支架材料均有良好的细胞相容性,细胞能在不同材料表面黏附生长。但是nPCL/80℃HA电纺纤维取向薄膜材料黏附率（45.6±3.2）%,明显高于nPCL/180℃HA电纺纤维取向薄膜材料黏附率（36.5±3.0）%。结论：80℃条件下合成的nPCL/HA电纺取向薄膜材料细胞黏附率较高,较适合作为支架材料应用于hBMSCs为种子细胞的组织工程构建。     

聚己内酯／丝素蛋白／胶原电纺纤维的制备及其细胞相容性研究

目的：制备聚己内酯j丝素蛋白／胶原电纺纳米纤维支架,检测其对口腔黏膜j：皮细胞生长和增殖的影响。方法：将冉生丝素膜、水溶性胶原蛋白粉末及聚已内酯按质量比1：1：4;1：l：8;1：1：10共同溶于六氟异丙醇中。采用静电纺丝法制备制备聚己内酯/胶原／丝素蛋白电纺纳米纤维支架。将体外培养的口腔黏膜上皮细胞接种至材料表面,采用MTT法和扫描电镜研究口腔黏膜上皮细胞在材料表面的生长和增殖情况,评价聚己内酯／丝素蛋白/胶原电纺纳米纤维的细胞相容性。结果：MTT结果表明,口腔黏膜上皮细胞在聚己内酯/丝素蛋门／胶原电纺纳米纤维支架生长良好。电镜观察显示所制备的电纺纤维直径均一,呈相互连通的多孔网状结构。口腔黏膜上皮细胞在改性后的材料表面具有良好的生长形态。结论：聚己内酯/丝素蛋白/胶原电纺纳米纤维支架,具备合适的孔径和孔隙率,适合口腔黏膜。上皮细胞生长,细胞相容性良好,是一种组织工程尿道重建良好的支架载体。     

不同配比纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合材料细胞相容性的研究

目的：观察不同配比nPCL/HA电纺纤维取向薄膜材料的细胞相容性。方法：将人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外诱导培养为成骨细胞;并经传代培养第5代的人骨髓间充质干细胞,以2×105cm2的密度与不同配比nPCL/HA电纺纤维取向薄膜支架在培养板内共培养,同时以nPCL电纺纤维非取向薄膜材料作为对照,初步观察hBMSCs在不同配比nPCL/HA支架材料上复合培养,对其细胞相容性进行评价。结果：hBMSCs与3种电纺薄膜支架材料均有细胞相容性,细胞能在不同材料表面黏附生长、分化增殖。但是PCL/HA的配比为20：1电纺纤维取向薄膜材料黏附率（35.3±2.6）%,为3中材料中黏附率最高的一种,材料表面细胞生长良好,体积变大,有伪足生长。结论：PCL/HA的配比为20：1电纺纤维取向薄膜材料,较适合作为支架材料应用于hBMSCs为种子细胞的组织工程构建。     

电纺聚己内酯-明胶纳米纤维膜复合兔骨髓间充质干细胞构建软骨组织工程支架

目的探索构建电纺聚己内酯(PCL)-明胶纳米纤维膜复合体作为软骨组织工程支架的可行性。方法采用静电纺丝技术制作PCL-明胶(50︰50)纳米纤维膜作为支架。取第三代兔骨髓间充质干细胞(BMSC),接种于上述支架,构建细胞-支架复合体并进行成软骨诱导培养。通过电镜分析、力学测试、体内植入试验和细胞实验等检测材料纤维直径、孔径和孔隙率、力学性能,细胞在支架上生长、分化情况以及生物相容性。结果 PCL-明胶纳米纤维膜直径均匀,有较大的孔隙率和比表面积,较好的力学性能。细胞-支架共培养24 h、48 h、72 h后BMSC生长增殖良好,共培养能促进BMSC成软骨诱导分化。体内试验表明材料无毒性,对组织刺激性小,具有良好的生物相容性。结论电纺PCL-明胶纳米纤维膜有较好的力学性能、细胞亲和性和生物相容性,基本满足软骨组织工程支架条件,能够用作种子细胞承载体。     

明胶/聚己内酯纳米纤维电纺膜在表皮组织工程中的应用

目的：观察明胶/聚己内酯（GT/PCL）纳米纤维电纺膜应用于表皮组织工程的可行性。方法测定HaCaT细胞（人类表皮细胞系）与电纺膜的生物相容性,并对于接种细胞前后该膜片的机械性能进行评价。应用CCK-8法检测细胞增殖情况。体内研究检测GT/PCL纳米纤维电纺膜构建的组织工程化表皮修复裸鼠皮肤缺损的效果。结果 HaCaT细胞能够在膜片上很好地附着和增殖,该膜片具有良好的生物相容性。机械性能测试显示,该膜片具有足够的力学特性以用于移植。体内研究表明,应用GT/PCL纳米纤维电纺膜构建的组织工程化表皮能够修复裸鼠的皮肤缺损。结论GT/PCL纳米纤维电纺膜是一种适合构建组织工程化表皮的支架材料。     

不同比例聚乳酸/丝素蛋白复合支架在兔尿道缺损修复中的疗效

目的 对比不同比例的3D打印聚乳酸及丝素蛋白复合支架在兔尿道缺损修复中的疗效。方法 构建聚乳酸（PLA）/丝素蛋白（SF）比例分别为25∶75、50∶50、75∶25的复合支架材料,与诱导多能干细胞共培养。24只人工尿道下裂模型的雄性新西兰兔随机分为3组,分别采用不同比例的复合支架行尿道成形术。在尿道成形术后6周,收集尿道移植物并进行大体和组织学分析,统计尿道狭窄的发生率。结果 体外实验中随着SF在复合材料中的比例增高,细胞黏附、增殖的数量增加。术后6周,PLA/SF=25∶75比例组尿道狭窄发生率低于其他两组（P<0.05）。结论 25∶75比例的聚乳酸/丝素蛋白复合材料更加有助于尿道缺损的修复。     

新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞相容性的体外实验研究

目的：研究新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞的体外相容性。方法：体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞。取传二代细胞,按照经典组织工程构建方法,分别接种双相磷酸钙（对照组）和双相磷酸钙复合纳米羟基磷灰石（实验组）支架。单纯细胞培养为空白对照组。体外成骨诱导培养14天。倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞生长情况;MTT法检测细胞增殖功能;碱性磷酸酶（ALP）检测细胞成骨分化功能。结果：细胞在新型支架上吸附、生长良好。各组MTT及ALP值随培养时间延长而增大。培养各时段实验组均高于其他两组,差别有统计学意义（P〈0.01）。结论：新型BCP支架与兔BMSC在体外具有良好的相容性,二者具有体外构建工程骨的潜力。     

小口径电纺组织工程血管支架的研究进展

小口径血管是组织工程血管领域的重要部分,临床实用性强。小口径血管支架的合成是构建小口径人工血管的基础,而电纺技术作为一种新型的组织工程材料制备技术,可利用高压静电场产生微米级甚至是纳米级的纤维,再经过一系列加工处理,形成类似细胞外基质的结构,刺激细胞的黏附和增殖。本文对小口径电纺组织工程血管支架的相关材料、制备工艺、表面修饰和评价进行综述。     

单层组织工程纤维环取向纳米纤维支架的构建和初步验证

目的 使用静电纺丝技术构建取向纳米纤维支架,观测其结构,测试其力学特点,观察支架与细胞之间的相互作用,探讨其作为纤维环组织工程支架的可能性.方法 使用高速滚轴作为收集装置制备聚左旋乳酸聚己内酯[poly（lactic acid-co-caprolactone,P（LIA-CL）]取向纳米纤维支架.以P（LLA-CL）无规纳米纤维支架作为对照,观察取向纳米纤维支架的纤维直径、角度分布、孔径等表观指标;测试其拉伸力学行为;体外接种骨髓间充质干细胞观察其体外增殖和生长形态情况.结果 P（LLA-CL）取向纳米纤维支架纤维取向性良好,平行于纤维方向上的拉伸力学性能得到明显增强.接种细胞后,支架可促进细胞增殖,并诱导细胞沿着纤维方向拉伸并定向排列.结论 取向纳米纤维支架的力学强度在取向方向上得到了明显增强,具有和单层纤维环相似的各向异性力学特点,并可以诱导细胞沿纤维方向定向排列,细胞分布与纤维环细胞排列方式相似,可用于纤维环组织工程研究.     

兔骨髓间充质干细胞复合两种材料体外生物相容性的比较

[目的]探讨丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨体外生物相容性，为组织工程寻找理想的载体材料。[方法]体外培养兔骨髓间充质干细胞分别于丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨体外复合培养，应用扫描电镜、激光共聚焦显微镜，四唑盐比色试验（MTT法），观察材料上复合培养的细胞的生物学特性。[结果]兔骨髓间充质干细胞可以在丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨良好的黏附、增殖和生长。两种材料相比较其相容性没有明显的差异。[结论]丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原／骨均具有良好的生物相容性，可以作为组织工程理想的载体材料。     

应用生物反应器构建组织工程化血管的实验研究

目的探讨利用生物反应器体外构建具有完整结构的组织工程化血管的可行性。方法从6月龄毕格犬颈总动脉获取平滑肌细胞,颈外静脉获取内皮细胞,经体外培养扩增。然后,先将平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸(PGA)上,形成细胞—材料复合物,将该复合物置于生物反应器内培养。模拟成年哺乳动物循环系统的参数,予以动态力学刺激(搏动频率:75次/分;扩张量<5%)。8周后,在其上接种内皮细胞,对照组不接种内皮细胞,培养5d后取材检测。结果组织学染色显示,平滑肌纤维成分排列较规则,有层次感,内皮细胞完整;对照组未见内皮细胞层结构。结论利用生物反应器可在体外构建具有完整结构的组织工程化血管。     

骨髓间充质干细胞促进“创面”愈合的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）促进创面愈合的作用和用于创面修复的可行性。方法：密度梯度离心法分离培养正常人骨髓间充质干细胞（hMSCs），流式细胞仪检测培养第二代细胞CD14、CD29、CD34、CD44、CD45和CD106抗原表达以鉴定MSCs。实验分3组：直接共培养组（n=8）为hMSCs（1×10^5/ml）与人表皮角质形成细胞（HEKa）直接接触共培养；间接共培养组（n=7）为在transwell透明聚碳酸酯膜上层加入hMSCs细胞悬液[（2-3）×10^5个细胞）]，下层接种HEKa，间接共培养；单纯HEKa培养组（n=7）单纯培养HEKa。在倒置显微镜下刮擦生长融合成片的HEKa细胞以制备宽度为100μm的“表皮创面”模型。模型制备后24、48、72h，倒置相差显微镜下计数每高倍视野越过创缘迁移到创面的HEKa数，并用SigmaScan Pro5软件计算创面愈合率，检测HEKa细胞吸收脱氧胸腺嘧啶核苷的放射活性，判定HEKa细胞的分裂增殖活性。结果：流式细胞仪检测第二代hMSCs CD29、CD44和CD106抗原阳性（分别为94.81%、95.38%、97.40%），CD14、CD34、CD45抗原阴性（分别为1.23%、3.05%、2.64%）；直接培养组、间接培养组和单纯HEKa培养组越过创缘进入创面的细胞伤后24h分别有（10.00±0.25）、（5.50±0.20）和（5.20±0.35）个/高倍视野；48h分别有（55.30±0.22）、（27.00±0.34）和（26.50±0.25）个/高倍视野；72h分别有（110.50±0.45）、（42.50±0.50）、（40.20±0.38）个/高倍视野。3组伤后72h创面愈合率分别为（60.00±0.04）%，（35.00±0.01）%、（33.00±0.05）%。脱氧胸腺嘧啶苷掺入培养基法表明hMSCs对体外共培养HEKa细胞的增殖作用分别为（1650±270）cpm/10^5 cell、（1240±210）cpm/10^5 cell、（1180±220）cpm/10^5 cell。上述各指标直接共培养组与单纯HEKa培养组比较，差异有显著性（P〈0.01），而间接培养组与单纯HEKa培养组间差异无显著性（P〉0.05）。     

毛囊单位促进组织工程皮肤形成的体外实验研究

目的 通过插入分离的毛囊单位,构建带有皮肤附属器的组织工程皮肤,探讨毛囊对组织工程皮肤形成的作用.方法 将头皮分离成毛囊单位,插入由Ⅰ型鼠尾胶原、成纤维细胞和角质形成细胞构建的组织工程皮肤模型中,浸没培养1周,气-液界面培养3周.通过镜下观察、HE染色和免疫组化检测组织工程皮肤和毛囊的生长状态.结果 相对于悬浮培养的毛囊,实验组毛囊体外生长期延长,结构更完整.HE染色显示,实验组组织工程皮肤可见毛囊和皮脂腺存在.免疫组化染色显示,带有毛囊的组织工程皮肤中可见反映基底膜完整性的Laminin和Ⅳ型胶原呈线状连续分布于表皮、真皮连接处;而反应表皮成熟度的CK4和CK10/13则呈阳性分布于基底上层非角化细胞.结论 复合毛囊单位可以促进组织工程皮肤表皮组织的分化和成熟.本方法为组织工程皮肤的构建和毛囊的体外培养提供了新的思路和方法.     

毛乳头细胞促进组织工程皮肤血管化的实验研究

目的探讨毛乳头细胞对表皮干细胞与同种异体脱细胞真皮基质构建的组织工程皮肤血管化的影响。方法取门诊包皮环切术患者皮肤,用于表皮细胞培养;取孕19、20周引产胎儿头部皮肤,用于毛乳头细胞培养;患者及家属均知情同意。以中性蛋白酶联合胰蛋白酶消化、分离表皮细胞,IV型胶原黏附法分选表皮于细胞;以Ⅰ型胶原酶消化法分离毛乳头,常规成纤维细胞培养液培养。以同种异体脱细胞真皮基质为支架,在真皮基质的真皮乳头侧种植毛乳头细胞,基底膜侧种植表皮干细胞构建实验组组织工程皮肤替代物;对照组组织工程皮肤替代物不种植毛乳头细胞。取6～8周龄BALB/C-nu裸鼠60只,随机分成实验组和对照组（n=30）;实验动物背部制造1 cm×1 cm大小全层皮肤缺损模型,将两组组织工程皮肤替代物移植修复创面,2周后观察移植皮肤成活率。术后2、4周,取移植皮肤替代物标本,行HE及免疫组织化学染色,观察移植皮肤替代物CD31表达水平,并计算两组标本血管密度。结果Ⅳ型胶原分选后表皮细胞同时表达角蛋白19、β₁整合素,提示为表皮干细胞。由毛乳头培养出的细胞表达α平滑肌肌动蛋白,提示为毛乳头细胞。动物移植术后2周,实验组移植皮肤成活率为93.3%（28/30）,对照组为80.0%（24/30）,比较差异有统计学意义（χ²=2.31,P=-0.00）。HE染色观察示实验组表皮层达12层,表皮细胞体积较大;对照组表皮层达4～6层,表皮细胞体积较小。实验组术后2、4周,血管密度分别为（38.56±2.49）个/mm2和（49.12±2.39）个/mm²,对照组分别为（25.16±3.73）个/mm²和（36.26±3.24）个/mm²,两组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。结论毛乳头细胞可促进移植皮肤替代物血管形成,利于表皮层重建,提高组织工程皮肤移植成活率。     

毛囊干细胞定向分化过程中Wnt信号通路介导的基因调控

皮肤的毛囊干细胞具有自我复制以及多向分化潜能,在毛囊形态发育和定向分化过程中,Wnt信号通路起决定性作用。参与这条信号通路的重要蛋白质,如Wnt蛋白、Frizzled、B—catenin、GSK313、APC、Axin等研究相对较早,且颇为深入。但对于这条通路下游的调节因子,尤其是细胞核内关键性转录因子Tcf3、Lef1,以及它们所调控的一些重要基因c—myc、eyelinDl等的研究仍处于起步阶段。本文就Wnt信号通路介导的基因调节毛囊干细胞定向分化的研究现状进行综述．为构建组织工程皮肤提供理论参考。     

人脐带间充质干细胞移植治疗小脑萎缩

目的 研究人脐带间充质干细胞(Human umbilical-cord mesenchymal stem cells,hUMSCs)治疗小脑萎缩(Cerebellar atrophy,CA)的临床疗效.方法 健康新生儿脐带中分离MSCs,连续体外扩增,采用鞘内注射(2.5×1075 mL)结合静脉滴注(7.5×107100 mL)的方法,治疗57例小脑萎缩患者,每次治疗剂量为1.0× 108个细胞.结果 所有患者随访6个月,治疗3个月后有效率为72.0%,治疗6个月后有效率为79.0%,无明显并发症.结论 应用hUMSCs治疗小脑萎缩安全有效,但远期疗效尚待进一步观察.     

毛囊干细胞表皮膜片修复裸鼠皮肤缺损的实验研究

目的开发新的组织工程表皮替代物,利用毛囊干细胞-壳聚糖明胶膜片(Chitosan-gelatin membrane,CGM)进行修复裸鼠皮肤缺损的实验研究。方法将体外扩增培养的毛囊干细胞接种于CGM,构建组织工程表皮膜片,裸鼠背部作直径1cm的全层皮肤缺损,将毛囊干细胞-CGM复合物覆盖创面。回植后1周、4周和12周分别进行组织学和免疫组织化学检测。结果毛囊干细胞在CGM上生长良好。毛囊干细胞-CGM修复裸鼠后1周切片示创面有新生上皮覆盖,表皮分化良好,而对照组残留较大未愈创面。修复后4周和12周可见对照组收缩较实验组显著。结论体外构建的毛囊干细胞-CGM可以修复裸鼠皮肤缺损。     

脐带间充质干细胞对创伤后早期急性肺损伤作用的研究

目的：探讨脐带间充质干细胞（UCMSC）对创伤后急性肺损伤（ALI）早期的作用.方法：采用撞击后静脉注射脂多糖的二次打击方法复制创伤后ALI家兔模型.24只家兔随机分为正常对照组（正常饲养）、ALI组（复制ALI模型）和UCMSC组（伤前30 min静脉注射UCMSC 1×106个）,每组8只.各组动物于伤后0、1.5、3和6 h测定血浆TNF-α含量;伤后6 h测定PaO2,支气管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α、补体C3a和C5a、白蛋白含量及中性粒细胞计数,肺湿/干重比值（W/D）,免疫组织化学法观察肺组织中TNF-α蛋白的表达,光镜下观察肺组织病理学变化.结果：与正常对照组比较,ALI组PaO2下降,其余各检测指标均明显升高,镜下见肺泡壁破坏,肺泡腔渗出和出血,肺组织TNF-α表达增强.伤前给予UCMSC能提高ALI动物的PaO2,不同程度降低外周血TNF-α及BALF中TNF-α[（0.72±0.70）μg/L比（1.82±0.60）μg/L]、C3a[（0.28±0.07）μg/L比（0.45±0.03）μg/L]、C5a[（0.08±0.01）μg/L比（0.19±0.03）μg/L]、白蛋白含量[（69.0±9.7）mg/L比（102.0±14.9）mg/L]和中性粒细胞计数[（229.0±21.4）×106/L比（298.0±36.8）×106/L],降低肺W/D,抑制肺组织TNF-α蛋白表达,减轻肺泡的损伤程度.结论：UCMSC能减少ALI时组织及血浆TNF-α的含量,减轻肺泡损伤程度,在一定程度上对早期创伤后急性肺损伤起保护作用.     

应用脂肪干细胞构建组织工程化小口径血管平滑肌层的实验研究

目的探索利用脂肪干细胞在生物反应器内构建组织工程血管平滑肌层的可行性。方法用抽吸的脂肪获取脂肪干细胞,在生长因子TGF-β1和BMP4作用下诱导成平滑肌细胞,然后将诱导的平滑肌细胞接种于PGA上,将细胞-材料复合物置于生物反应器内进行培养,在模拟胚胎发育血流动力学的刺激下(搏动频率:75次/分;扩展量<5%),构建小口径的血管平滑肌组织。培养8周后,取材行组织学和生物力学检测并与正常血管对比。结果脂肪干细胞在TGF-β1和BMP4的诱导下,细胞呈现平滑肌细胞特有的"波峰-波谷"样生长特点,并表达平滑肌细胞的特异性标记物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC;反应器内培养8周后,构建的管状组织胶原分泌旺盛,具有一定的力学强度和弹性。结论利用脂肪干细胞可在体外生物反应器内构建组织工程化小口径血管平滑肌层,为临床上小血管病变的修复提供了一种新的可能的途径。