肝癌细胞内表达抗肝癌单链抗体对肝癌细胞的杀伤作用

为研究抗肝癌单链抗体基因在肝癌细胞内表达对肝癌细胞的作用。采用脂质体转梁技术把含抗人肝癌ｓｃＦｖ基因的逆转录病毒载体导入人肝癌细胞系ＨＣＣ９２０４中，Ｇ４１８筛选阳性细胞克隆。ＲＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ杂交分析ｓｃＦｖ基因在ＨＣＣ细胞中的表达。光镜及电镜技术观察转染细胞结构的变化。     

抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及包装

0　引言　人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验 ,同时 ,逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法 [1 ] .迄今所掌握的研究资料表明 ,接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应 .因此 ,我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体 p L XSN,将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(s Fv- TNF-α)克隆至该载体 ,进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究 .1　材料和方法1.1　材料　分泌型抗肝癌单链…     

抗肝癌单链抗体基因库的制备

目的构建抗肝癌噬菌体单链抗体(Single-chainvariblefragments,ScFv)库并加以鉴定。方法从经肝癌细胞免疫小鼠脾淋巴细胞中提取mRNA,RT-PCR扩增轻、重链可变区基因片段,连接成ScFv基因并扩增,克隆到pCANTAB5E,导入大肠杆菌TG1培养并计数。PCR检测ScFv基因插入情况并对ScFv进行基因序列分析和ELASA检测。结果抗体库库容为2.14×106;90%的噬菌体基因中有ScFv基因的插入;核酸序列分析显示抗体库基因结构正确;ELASA检测证实ScFv的表达。结论所建抗肝癌噬菌体ScFv库库容大,质量良好,对肝癌的基础研究和临床有潜在的应用价值。     

抗CD44抗体单链抗体构建及表达

目的 构建抗CD44抗体的单链抗体（anti-CD44-ScFv），为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法 从分泌抗CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系HII44a中提取总RNA，经RT-PCR分离获得了轻、重链可变区（VL、VH）基因，用连接肽将其构建成具有VL-Linker-VH结构的单链抗体基因，并将构建的单链抗体基因克隆到分泌型蛋白表达载体PEV22b（＋）中进行表达。结果 经测序表明，VH、VL及Linker的序列正确。ScFv在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的16％。能够特异性与CD44抗原结合。结论 成功构建抗CD44抗体单链抗体，为进一步制备基因工程抗体奠定了基础。     

抗肝癌单链双功能抗体融合绿色荧光蛋白表达载体的构建及表达

0　引言　肝癌恶性程度极高 ,在我国有着较高发病率和死亡率 ,迄今尚无理想的治疗手段 .随着现代分子生物学和免疫学的发展 ,基因工程抗体的诞生为肿瘤的诊断和治疗带来了希望 ,尤其是单链抗体的应用成为肿瘤免疫基因治疗的热点我们利用本室克隆的抗肝癌单链抗体 (s Fv)基因与人肿瘤坏死因子 (TNF- α)基因偶连 ,构建抗肝癌单链双功能抗体与绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein,GFP)融合表达的真核表达载体 ,并在小鼠成纤维细胞 NIH3T3中表达了 s Fv-TNF- GFP融合蛋白 ,为肝癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础 .1　材料和方…     

特异性抗肝癌单链抗体的表达及意义

目的优化表达条件，荻取有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体。方法以ITPG诱导大肠杆菌HB2151表达可溶性抗肝癌单链抗体；利用HiTrap Anti—E Tag素和层析拄对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化；纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以Bradford检测法测定其浓度，ELISA法及免疫组化法鉴定其生物学活性；结果在培养基中加入0．4M蔗糖，以IPTG 1mmol／L于30℃诱导12h，抗肝癌scFv可溶性表达量较多，纯化后可溶性抗肝癌scFv含量为325μg／L。纯化的抗肝癌scFv与肝癌组织、肝癌细胞抗原特异性结合，与肝硬化、正常肝组织无阳性结合。结论成功获得具有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体，为肝癌靶向诊断及治疗的开发与应用奠定了基础。     

抗前列腺特异抗原/CD3双特异单链抗体的构建及表达

0　引言　前列腺特异抗原 (prostate- specific antigen,PSA)是一种灵敏度较高的肿瘤标志物 [1 ] .抗 PSA/ CD3双特异单链抗体 (single chain antibody,Sc Fv) ,能同时识别 T细胞上的 CD3分子和前列腺癌的特异性抗原 PSA.我们在已构建抗 CD3Sc Fv和抗 PSA Sc Fv的基础上[2 ,3] ,利用基因重组技术 ,构建了抗 PSA/ CD3双特异 Sc Fv,并进行了原核表达 .1　材料和方法1.1　主要材料与试剂　抗 PSA Sc Fv(E4B7Sc Fv)重组质粒由本室构建并保存 .抗 CD3Sc Fv由本校生化教研室白玉杰博士构建并惠赠 .p UC19- L inker质粒由本校…     

抗DR5单链抗体的构建与表达

目的:构建抗DR5单链抗体的真核表达载体,以实现真核表达。方法:RT-PCR法从分泌抗DR5抗体的杂交瘤细胞中合成第一链cDNA,用通用引物钓取单克隆抗体的轻、重链可变区基因。经测序和BLAST比对,证实为一株新的鼠源性抗体基因。利用overlapping PCR方法构建单链抗体真核表达载体pCMV-express-scFv,Lipofectamine2000法转染宿主细胞293T,72 h后ELISA法检测细胞培养上清,检测抗体表达。结果:经序列鉴定和BLAST比对证实克隆的抗体轻、重链可变区基因为新鼠源抗体基因。ELISA实验结果显示抗体有效表达在细胞培养上清中。结论:成功得到抗体轻、重链可变区基因,实现了抗DR5单链抗体的真核表达,为进一步的研究和开发奠定了基础。     

卵巢癌抗独特性单链抗体6B11基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 制备在大肠杆菌中高效表达６Ｂ１１卵巢癌抗独特型单链抗体。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）克隆技术,将６Ｂ１１ｓｃＦｖ基因克隆到原核高效表达载体ｐｋＰＬ－３ａ上,重组子转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６,温度诱导表达,复性蛋白经二乙氨乙基琼脂糖快离子交换层析纯化,十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝腕鉴定蛋白纯度,直接法和竞争抑制法ＥＬＩＳＡ检测其活性,结果 ６Ｂ１１ｓｃＦｖ以包涵体形式表达获高效表达,包涵体     

99mTc螯合两种抗肝癌单链抗体的标记条件

目的:研究两种全新的抗肝癌基因工程单链抗体hdsFv和scFv-PE38的99mTc标记方法及适宜条件以应用于放免显像. 方法:选用二乙烯三胺五乙酸环酐(cDTPAa)作为螯合剂,沿用比较成熟的标记方法,以标记率和标记物免疫活性为指标分别测定两种单链抗体与99mTc偶联的适宜条件,并测定标记物的比活度和体外稳定性. 结果:其他理化条件不变,cDTPA与hdsFv的浓度比为20: 1～40: 1,99mTc活度37～148 MBq时,hdsFv标记率为62%～84%;cDTPA对scFv-PE38的浓度比为20: 1～100: 1,99mTc活度为37～148 MBq时,scFv-PE38标记率为68%～89%;且两种标记单链抗体的免疫活性均在60%以上. 结论:通过对这两种全新的单链抗体的标记和检测,得到了尽可能保持其原有免疫活性的标记条件,为通过放免显像在活体内检验单链抗体亲瘤性奠定了基础.     

抗CD44抗体单链抗体构建及表达

目的构建抗 CD44抗体的单链抗体(anti-CD44-ScFv),为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法从分泌抗 CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系 HII44a 中提取总 RNA,经 RT-PCR 分离获得了轻、重链可变区(V_L、V_H)基因,用连接肽将其构建成具有 V_L-Linker-V_H 结构的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到分泌型蛋白表达载体 PET22b( )中进行表达。结果经测序表明,V_H、V_L 及 Linker 的序列正确。ScFv 在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的16%。能够特异性与 CD44抗原结合。结论成功构建抗 CD44抗体单链抗体,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础。     

抗肝癌单链双功能抗体在Hut-78细胞系中的表达及体外杀伤活性

目的 用携带分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因（sFv-TNF-α）的重组逆转录病毒感染T细胞淋巴瘤Hut-78细胞，使其表达并分泌针对人肝癌细胞的sFv-TNF-α融合蛋白，观察转导的T细胞对体外培养肝癌细胞的杀伤作用。方法 用感染性重组病毒产生细胞C22（PA317/PST）产生的病毒上清转导入T细胞淋巴瘤Hut-78细胞，采用PCR，RT-PCR，细胞原位杂交及免疫组织化学染色等方法，对转导的Hut-78细胞进行DNA，mRNA及蛋白水平的分析。转导的Hut-78细胞分别与SMMC-7721，HHCC共培养，MTT法检测Hut/PST细胞表达产物对两种肝癌细胞的杀伤作用。结果 PCR，RT-PCR结果显示转导Hut细胞中扩增出外源目的基因对应的电泳条带，neo基因探针原位杂交显示转导细胞质内有较强的紫蓝色阳性反应信号，其阳性率约为95%，鼠抗人TNF-α多克隆抗体免疫组织化学染色，转导细胞质内有明确的棕黄色阳性反应信号，MTT法检测结果，分泌型抗肝癌单链双功能抗体对体外培养的两种肝癌细胞的杀伤率分别为15.4%和26.5%。结论 分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因可以在T细胞中整合并稳定表达，其分泌的表达产物对两种肝癌细胞均具有一定的亲合活性，并且具有一定的体外杀伤作用。     

抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

目的：重新设计并人工合成抗NI-35重组单链抗体(anti-NI-35-scFv)的cDNA克隆，构建其表达载体，在原核系统中实现初步表达。方法：根据抗NI-35抗体的轻链重链序列，重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段，经退火、复性连接成目的片段后，克隆到克隆栽体pUC—18中，经全自动序列分析仪测序证实，再亚克隆至表达栽体pET-28a( )，转化大肠杆菌BL21，诱导表达。结果：合成的基因序列与设计的仅差一个碱基，目的基因连接方向及阅读框架正确；SDS-PAGE检测显示，表达出相对分子量31kDa的融合蛋白，并得到了良好的生物活性。结论：抗NI-35重组单链抗体基因表达载体的构建和表达，为深入研究其应用于神经系统的损伤和修复奠定了基础。     

抗肝癌抗原单链抗体在荷人肝癌裸鼠体内的放射免疫显像效果

目的 :研究13 1I标记抗肝癌鼠源性单链抗体 (mouse derivedscFv2 5 ,mscFv2 5 )在荷人肝癌裸鼠体内放射免疫显像效果 .方法 :采用高效碘标法制备13 1I mscFv2 5 ,2 0只荷人肝癌裸鼠分别通过静脉和ip13 1I mscFv2 5后 1,4 ,8,16 ,2 4 ,2 8h进行裸鼠的体内分布和放射免疫显像研究 .结果 :2 0只荷肝癌裸鼠在 6～ 8h全部明确显像 ,对照组鼠瘤区未出现放射性浓聚 . 13 1I标记的mscFv2 5的瘤 /肝比值 2 4h为(9.6 3± 0 .0 5 ) .结论 :13 1I mscFv能提高瘤 /肝比值 (T/NT) ,缩短显像时间 ,有可能成为肝癌诊断的一项重要技术     

抗肝癌单链抗体与PE38融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达

目的：实现二硫键稳定的抗肝癌单链抗体与PE38融合，免疫毒索在大肠杆菌中的可溶性表达，为下游的活性检测等工作打下基础．方法：设计了两种不同的表达载体(GST、硫氧还蛋白促可溶表达载体)，并通过改变宿主菌菌株、IPTG诱导浓度、诱导温度及诱导时间等，优化表达条件；通过ELISA法判断该免疫毒素中单链抗体的结合活性．结果：抗肝癌单链抗体与PE38融合蛋白在大肠杆菌Origami(DE3)的上清中得到表达，表达量占菌体总可溶蛋白量的21％：ELISA法证实该融合蛋白保持了亲本抗体的特异性．结论：dsFv-PE38融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达为其他融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达提供了思路．     

抗CD3单链抗体基因克隆表达及生物活性鉴定

The genes encoding antibody heavy and light chain variable regions(VH and VL)were cloned by RT-PCR from OKT3 hybridoma cells,which produced anti-CD3 moleclonal antibody.The VH and VL genes were fused and become a single chain Fv(scFv).The scFv gene was cloned into pCANTAB5E vector and expressed on bacterial phage surface.By three panning rounds,we have obtained two single-chain antibodys that specific for CD3.The antiCD3 scFv wil be a reagent fox diagnosis and therapy of immuno-disorder.     

抗前列腺特异抗原单链抗体/人羧肽酶A融合基因的构建及表达

目的 构建抗前列腺特异抗原（PSA）单链抗体（scFv)/人羧肽酶A(hCPA)融合基因,为前列腺癌的抗全导向酶-前体药物疗法奠定基础。方法 在已克隆抗PSAscFv和hCPA基因的基础上,用加端PCR分别在scFv基因的3′端和hCPA基因的5′端加上部分连接肽（linker)基因序列,回收后混合。应用重叠延伸拼接法,将抗PASscFv基因和hCPA基因通过linker序列串联为scFv/hCPA融合基因;并将构建的融合基因克隆到融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达。结果 序列测定结果表明,构建的抗PSAscFv/hCPA融合基因中scFv和hCPA序列均正确,scFv和hCPA间有18bp的linker序列,推导的氨基酸序列为GSGGSG,与设计的序列相符,融合基因经IPTG诱导表达重组蛋白并以SDS-PAGE分析,在Mr为94000左右出现一条新生蛋白带,表达量约占菌体总蛋白的34%。结论 成功构建并原核表达了抗PSAscFv/hCPA融合基因。     

抗转铁蛋白受体单链抗体原核表达载体的构建和表达

目的 构建抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体原核表达载体，为进一步研究其效应奠定基础。方法 从抗TfR单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆载体pGEM-T-VH和pGEM-T-VL中扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，用重叠延伸PCR的方法，在VH和VL基因间引入连接短肽(Linker)，构建VH-Linker-VL的单链抗体(single chain Fv，scFv)基因。经NcoⅠ和NotⅠ酶切后亚克隆到原核分泌型表达载体pUCl9／119上，转化和筛选后，阳性细菌经IPTG诱导表达。间接免疫荧光法(IFA)及抗体封闭试验鉴定其抗体活性。结果 凝胶电泳可见重叠延伸PCR扩增产物约700bp条带，SDS-PAGE鉴定表达产物的分子量为27kD左右，与scFv的理论值一致，IFA及抗体封闭试验证明表达产物有抗人TfR的活性。结论 本研究成功地构建并表达了抗人TfR scFv，为抗人TfRscFv的应用奠定了基础。